消支饮治疗小鼠生殖道解脲支原体感染对血清干扰素

解脲支原体(Uu) Uu) ) 是介于细菌与病毒之间的最小原核微生物, 属于柔膜体纲、 支原体科、脲原体属的微生物。主要寄生在人类泌尿生殖道黏膜表面, 女性生殖 道感染后可上行至子宫腔和输卵管腔引起相应部位的炎症。针对其病因病机导 师梁学林教授制定了以健脾益气, 升阳除湿为主, 佐以清热解毒杀虫的治疗大法, 自拟“消支饮”方治疗本病, 注重扶正祛邪, 固护正气, 尤其对抗生素治疗耐药的患 者更为适宜。通过动物实验以中药“消支饮”方, 治疗 Uu) 感染, 并设西药“阿奇霉 素”为对照组, 从小鼠 Uu) 转阴率、血清干扰素-γ γ 两方面观察“消支饮”的治疗作用。 1 材料与试剂 1. 1 实验动物 BALB/C 小鼠 104 只购于中国医学科学院实验动物研究所, 鼠龄 8 周, 雌性, 清洁级, 体重(Uu) 20±2)g。 1. 2 实验药品及制备 消支饮：由太子参、山药、柴胡、炙甘草、陈皮 、 白芍、炒荆芥、车前子、苍术、炒白术、黄柏、苦参等中草药组成, 由辽宁中医 药大学附属医院中药局制备,浓缩至 2 g/ml(Uu) 即 1 ml 煎液内含有 2 g 生药), 灭菌 备用。 阿奇霉素：石家庄欧意药业有限公司生产, 规格：0.25 g/片,生产批号：国 药准字 H10980218。 1. 3 主要试剂 Uu) 标准株：Uu) 血清 8 型冻干标准株, 由南华大学微生物 教研室提供。复苏并传代后备用。 液体培养基：购于珠海丽珠试剂有限公司, 批号：YZB/粤 0205-γ 2007。 固体培养基：购于上海恩康生物科技有限公司, 批号：YZB/ 沪 0948-γ 40-γ 2005。 小 鼠 IFN-γ γ 定 量 酶 联 检 测 试 剂 盒 ： 购 于 ADLITTERAMDIAGNOSTIC LABORATORIES, 批号：QRCT-γ 301330101003-γ EIA/UTL。 1. 4 主要仪器及设备 酶联免疫吸收分析仪, 型号 Anthos-γ 2010, 用于测定 血清 IFN-γ γ ;日本奥林巴斯 BX51 号显微镜,用于小鼠阴道分泌物 Uu) 检测观察。 2 实验方法 2. 1 Uu) 菌液制备 将冻于-γ 80℃的 Uu) 血清 8 型标准株置 37~45℃水浴中 1 min, 使其快速融化, 无菌接种于 Uu) 液体培养基, 37℃恒温箱培养 24~48 h, 见 液体培养基由黄变红, 且液体澄清透亮无浑浊、沉淀, 可确认有 Uu) 生长。取对 数生长期 Uu) 菌液制成 2.5×105 ccu) /ml 浓度, 经 1000 r/min 4℃离心集菌备用。 2. 2 动物造模 在同样条件下, 随机分为 A、B、C、D、E、F、G 7 组。 模拟 Taylor-γ Robinson 的造模方法, A、B、C、D、E、F 组每只小鼠颈部皮下注 射苯甲酸雌二醇 0.4 mg, 浓度 1mg/ml, 每周 1 次, 共 4 次。A、B、C、D、E、F 组小鼠在经过雌激素预处理后, 将血清 8 型浓度为 2.5×105 cu) u) /ml 的 Uu) 菌液 用留滞针软管取 20 μl l 注入小鼠阴道, 连续给菌 3 d。小鼠在接种 Uu) 1 周后取小 鼠阴道分泌物进行检测。用 2 支无菌棉签棒伸入小鼠阴道 0.5 cm 轻轻转动, 将 第 1 支棉签在液体培养基(Uu) 1 ml) 中充分洗脱, 进行液体培养;第 2 支棉签接种于 Uu) 固体培养基平板上。固体和液体培养基均放于 37℃孵育箱孵育, 24~48 h 后 观察结果, 液体培养基颜色由黄变红且澄清, 固体培养基长出典型“煎蛋样”Uu) 菌 落, 提示造模成功。 2. 3 分组给药治疗 消支饮预防高剂量组(Uu) A 组：14 只小鼠,造模同时, 给 予中药“消支饮”80 g/(Uu) kg·d), 连续给药 4 周;消支饮预防低剂量组(Uu) B 组) ：14 只小 鼠, 造模同时, 给予中药“消支饮”20 g/(Uu) kg·d), 连续给药 4 周;消支饮治疗高剂量组 (Uu) C 组)：17 只小鼠, 造模成功后, 给予中药“消支饮”80g/(Uu) kg·d), 连续给药 3 周;消 支饮治疗 低剂量组 (Uu) D 组) ：17 只小鼠 , 造模 成功后 , 给予 中药“消支饮” 20 g/(Uu) kg·d), 连续给药 3 周;阿奇霉素组(Uu) E 组) ：14 只小鼠, 造模成功后,给予西药“阿 奇霉素”0.2 g/(Uu) kg·d), 连续给药 2 周;模型组(Uu) F 组) ：16 只小鼠, 造模成功后, 给予 0.9% 的生理盐水, 连续 3 周;空白组(Uu) G 组) ：12 只小鼠, 正常饲养, 与模型组同时 给予 0.9% 的生理盐水, 连续 3 周;灌胃量：每 10 g 小鼠给 0.4ml 的药液, 每天给 药 1 次。 2. 4 实验检测指标 小鼠转阴率的检测：实验给药结束后,全部小鼠取阴 道分泌物进行检测。24~48 h 后观察结果。于奥林巴斯 BX51 号显微镜下观察并 拍照。 小鼠血清中 IFN-γ γ 值检测：用消毒眼科镊取出小鼠眼球, 取小鼠眼球血, 应 用酶联免疫吸收分析仪检测血清 IFN-γ γ 值。 2. 5 统计学方法 采用 SPSS17.0 统计学软件对数据进行统计分析。计数 资料采用率(Uu) %) 表示, 行 χ2 检验;计量资料应用 LSD-γ t 检验。P<0.05 表示差异具 有统计学意义。 3 结果 小鼠在接种 Uu) 1 周后取小鼠阴道分泌物进行检测。液体及固体培养基检测 结果显示：A、B、C、D、E、F 组小鼠均感染了 Uu) , 感染率 100%, 空白组 12 只 小鼠均未感染 Uu) ,感染率 0。证明实验造模成功。 3. 1 治疗后 Uu) 转阴率 3. 2 血清 IFN-γ γ 检测 取小鼠眼球血, 离心分离出血清,采用酶联免疫吸附 法, 由酶联免疫吸收分析仪读取结果, 换算出最后 IFN-γ γ 值。基本步骤①取出酶 标板, 依照次序对应分别加入 100 μl l 的标准品于空白微孔中;② 分别标记样品编 号, 加入 100 μl l 样品于空白微孔中;③ 在标准品孔和样品孔中加入 50 μl l 的酶标 记溶液;④ (Uu) 36±2)℃孵育反应 60min ;⑤ 洗板机清洗 5 次, 每次静置 10~20 s ;⑥ 每 孔 加 入 底 物 A 、 B 液 (Uu) 呈 色 剂 ) 各 50 μl l ;⑦ (Uu) 36±2)℃ 下 避 光 孵 育 反 应 15 min ;⑧ 每孔加入 50 μl l 终止液, 终止反应。 结果判断：于波长 450 nm 的酶标仪上读取各孔的 OD 值;B= 标准品 OD 值、 B0= 标准品 0 点 OD 值;以 B/B0% 值为纵坐标, 以标准品的浓度为横坐标, 在对 数坐标纸上绘制标准曲线;在标准曲线上查找对应的浓度范围;敏感度为 1.0pg/m l, 根据样品 OD 值在该曲线图上查出相应小鼠 IFN-γ γ 含量。 4 讨论 4. 1 本实验研究的结果分析 4. 1. 1 治疗后转阴率分析 各组小鼠治疗 4 周后对小鼠分泌物 Uu) 检测结 果说明, 消支饮和阿奇霉素对 Uu) 感染均有治疗作用。本实验属于急性 Uu) 感染, 根据转阴率可以说明, 阿奇霉素对急性 Uu) 感染的抑菌作用优于消支饮, 且消支 饮高剂量组疗效优于低剂量组。 4. 1. 2 干扰素-γ γ 值分析 国内外专家研究发现 Uu) 发病与免疫因素有关, 其中 IFN-γ γ 由活化的 T 细胞产生, 是迟发型超敏反应(Uu) DHSR) 中最重要的细胞因 子, 多位学者认为, 在 Uu) 感染致病过程中与输卵管损伤有关。Shcheglovitova 等发现 Uu) 感染妇女血清 IFN-γ γ 水平升高。袁淑珍通过研究发现输卵管支原体感 染不孕妇女输卵管液中 IFN-γ γ 水平升高,认为支原体感染引起的输卵管炎症导致 不孕可能与 IFN-γ γ 升高有关。IFN-γ γ 作为免疫细胞因子, 在正常情况下, 对机体有 保护作用;如其过度表达, 则引起免疫损伤。韩延华等用 80 只小鼠做 Uu) 感染后 血清 IFN-γ γ 的动物实验研究, 通过自拟方剂消抗灵Ⅱ号和阿奇霉素治疗Ⅱ号和阿奇霉素治疗号和阿奇霉素治疗, 结果发 现消抗灵Ⅱ号和阿奇霉素治疗Ⅱ号和阿奇霉素治疗号和阿奇霉素均能降低 Uu) 感染引起的血清 IFN-γ γ 的水平升高, 说明 通过治疗与防治, 可能影响 Uu) 感染引起的血清 IFN-γ γ 的高水平。 本实验采用酶联免疫吸附法, 检测各组小鼠血清中 IFN-γ γ 值, 应用 LSD-γ t 检 验方法统计结果表明：小鼠感染 Uu) 后, IFN-γ γ 值有上升趋势。用药治疗后：① 各组与模型组比较, 其中消支饮预防低剂量组与模型组比较, 差异有统计学意义 (Uu) P<0.05), 说明消支饮能降低 Uu) 感染引起的 IFN-γ γ 高水平。②各组与阿奇霉素 组比较, 其中消支饮预防低剂量组与阿奇霉素组比较, 差异有统计学意义 (Uu) P<0.05), 说明消支饮较阿奇霉素更能降低 Uu) 感染引起的 IFN-γ γ 高水平。 通过本次实验研究, 可以看出消支饮是治疗 Uu) 感染的有效方剂。该方不仅 能有效改善 Uu) 感染引起的生殖道组织炎症, 且能降低 Uu) 感染引起的 IFN-γ γ 高 水平, 能整体调节机体的免疫功能, 与现代研究认为 Uu) 致病与免疫因素有关是 相一致的。而且这为中医药治疗 Uu) 感染开辟了新途径,提供了理论依据。