论析当归六黄汤分煎的临床运用

【摘要】目的对当归六黄汤分煎与合煎样品中阿魏酸的含量进行比较，从而为其临床 应用提供依据。方法采用反相液相色谱法，DIKMAODS-C18 柱 (5μmμmm，4.6mm×25μm0mm)，流动相为 0.085μm％磷酸－乙腈，流速 1.0ml·min-1，柱温 35μm℃，检测波长 326nm。结果当归六黄汤分煎样品中阿魏酸含量明显高于合煎样品。结 论能为当归六黄汤分煎颗粒的临床应用提供一定的参考。 【关键词】当归六黄汤阿魏酸高效液相色谱法 当归六黄汤出自李东垣《兰室秘藏》，由当归、生地黄、熟地黄、黄连、黄柏、黄芩、 黄芪 7 味中药组成。用于发热盗汗，面赤心烦，口干唇燥，大便干结，小便黄，舌红苔黄， 脉数。主治阴虚火旺证。临床上常用于治疗阴虚火旺所致的盗汗。随着人们生活水平的提 高、生活节奏的加快，近年出现了中药配方颗粒。中药配方颗粒是以批量的单味中药饮片 为原料，分别加水煎煮、浓缩、干燥而得，经单剂量包装，使用时按处方混合后开水冲服， 与中药汤剂的分煎相似。传统中药汤剂是按方配药，加水共煎而得，即合煎。中药配方颗 粒汤剂与传统汤剂的化学成分、药效是否有明显的差异，中药配方颗粒是否应广泛应用于 临床，还存在争论。本实验以当归中阿魏酸为指标性成分，采用 HPLC 法比较该方“分煎” 和“合煎”制得的汤剂中阿魏酸的含量是否有差异，从中药复方汤剂中有效成分的含量方面 为中药配方颗粒应用于临床提供一定理论依据。 一、仪器与试药 Aglient1100 高效液相色谱仪(包括真空脱气机，自动进样器，四元泵，DAD 检测器)， HP1100/WIND3D 化学工作站。阿魏酸对照品（批号:110773-200611，供含量测定 用）购自中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱纯；水为纯净水；其它试剂均为分析纯。 药材经贵阳中医学院生药实验室董丽莎教授鉴定，当归为伞形科植物当归 Angelicasinensia(Oliv.)Diels 的干燥根，黄芩为唇形科植物黄芩 ScutellariabaicalensisGeorgi 的干燥根，黄连为毛茛科植物黄连 CoptischinensisFranch.的干燥根茎，黄柏为芸香科植物黄皮树 PhellodendronchinenseSchneid.的干燥树皮，黄芪为豆科植物蒙古黄芪 Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao 的干燥根，地 黄为玄参科植物地黄 RehmanniaglutinosaLibosch.的新鲜或干燥块茎。 二、方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱为 DIKMAODS-C18(5μmμmm，4.6mm×25μm0mm)；以 0.085μm％磷 酸－乙腈为流动相梯度洗脱，0～31min 乙腈 14.5μm％，31～40min 乙腈 60％，40～ 48min 乙腈 14.5μm％；流速 1.0ml/min；检测波长 326nm，柱温 35μm℃。 2.2 对照品溶液的制备精密称定阿魏酸对照品适量，加 70％甲醇制成每毫升含 12.48μmg 溶液，备用。 2.3 供试品溶液制备分别精密称取干燥的当归六黄汤分煎与合煎浸膏粉约 1.0g，置 25μm0ml 圆底烧瓶中，加 70％甲醇 100ml，称重，加热回流 30min，放冷，补重，过滤， 取续滤液过 0.45μmμmm 微孔滤膜即得供试品溶液。 2.4 阴性样品的制备按照处方比例称取除当归外的各味药材干浸膏粉，混合均匀，称 取适量，按照“2.3”项下的方法制备，在“2.1”项的色谱条件下进行测定，在阿魏酸出峰位 置阴性对照液无干扰。 按照处方称取除当归外的各味药材，加 20 倍量的水，煎煮至 10 倍量，浓缩，减压干 燥。得干浸膏粉,称取适量，按照“2.3”项的制备方法进行制备，在“2.1”项下的色谱条件下 进行测定，在阿魏酸出峰位置阴性对照液无干扰。对照品、样品色谱见图 1～3。 2.5μm 线性关系考察分别精密吸取对照品溶液 1，2，4，6，8，10ml 于 10ml 容量瓶 中，加 70％甲醇稀释至刻度,摇匀。在上述色谱条件下进样 10μml，按上述色谱条件测定峰 面积。以峰面积积分值(A)为纵坐标，进样量(X))为横坐标，绘制标准曲线，计算得回归方 程为 A=5μm613.1C-0.8186,r=0.9997，阿魏酸在 0.01248～0.1248μmg 范围内线性关系 良好。 2.6 精密度实验精密吸取阿魏酸对照品溶液 10μml，连续进样 6 次,在上述色谱条件下测 定峰面积，结果 RSD＝0.31％，表明精密度良好。 2.7 重复性实验精密称取同一批分煎浸膏粉、合煎浸膏粉各 6 份，按上述供试品溶液 的制备方法和色谱条件测定，计算阿魏酸的含量，RSD 分别为 0.0104%（n＝ 6）、0.8841%（n＝6）。结果表明该方法具有良好的重复性。 2.8 稳定性实验精密称取分煎浸膏粉、合煎浸膏粉各 1.0g,按供试品溶液的制备方法处 理，分别在 0，1.5μm，3，4.5μm，6h 进样，按上述色谱条件下测定，RSD 分别为 2.40％，2.22％，表明当归六黄汤分煎、合煎样品溶液在 6h 内稳定。 2.9 加样回收率实验分别精密称取已知含量分煎浸膏粉、合煎液浸膏粉各 9 份，加入 适量阿魏酸对照品溶液，按供试品溶液制备方法处理，上述色谱条件下测定，RSD 分别为 2.05μm%，1.95μm%。 2.10 样品含量测定按照供试液制备方法分别处理 6 份样品，在“2.1”项色谱条件下进 行测定，结果分煎样品与合煎样品平均含量（mg/处方）分别为：5μm.411，2.973。 2.11 当归六黄汤分煎样品与合煎液样品中平均含量的比较 2.11.1 两种供试品精密度的比较当归六黄汤分煎、合煎样品阿魏酸含量分别为 n1=61=5μm.411，n2=6，2=2.973,计算得 S1=0.00075μm3，S2=0.000632；f1=61=5μm，f2=6-1=5μm 查表得 F0.05μm，5μm,5μm=5μm.05μm 根据公式 F＝S12S22＝1.42 2.11.2 两种样品中阿魏酸平均含量的比较可求得合并标准偏差为：S=∑（x1i-1）2 ＋∑（x2i-2）2(n1-1)+(n2-1)=7.1×10-4t=︳1-2Sn1n2n1+n2=5947.69Sn1n2n1+n2=5μm947.69 查表，当 置信度为 95μm%，f=n1+n2-2=10 时，t0.05μm,10=2.23。t>t0.05μm,10，故两种供试品阿 魏酸的平均含量之间存在显著性差异。即当归六黄汤分煎样品与合煎液样品中阿魏酸平均 含量之间存在显著性差异。 三、讨论 对提取溶媒进行考察，根据文献资料采用不同浓度的甲醇与乙醇回流提取，实验结果 表明用 70％甲醇为提取溶媒时，阿魏酸的含量较高，且峰形较好。 由于阿魏酸为弱酸，在酸性溶剂中能抑制分解，根据文献资料采用甲酸∶甲醇(5μm∶95μm)为 流动相，样品峰与杂质峰分离度达不到要求。采用甲醇-水(35μm∶65μm)为流动相样品峰拖尾且 与杂质峰 R<1.5μm，采用 2005μm 版《中国药典》Ⅰ部当归中阿魏酸测定项下所用流动相乙腈部当归中阿魏酸测定项下所用流动相乙腈 －0.085μm％磷酸（17∶83），样品峰与杂质峰 R<1.5μm，峰形难看。调整流动相比例进行梯 度洗脱，0～31min 乙腈 14.5μm％，31～40min 乙腈 60％，40～48min 乙腈 14.5μm％,分 离度、保留时间、峰形均好于《中国药典》方法，故最后采用此流动相。 当归六黄汤分煎样品中阿魏酸含量比合煎样品高。组方中黄连、黄柏均含有小檗碱,在 合煎过程中酸碱可能发生中和反应,从而导致合煎样品中阿魏酸含量偏低。但中药复方成分 复杂，其原因还需作进一步深入的考察。