何首乌毛状根化学成分研究论文

【摘要】目的研究转基因何首乌毛状根中的化学成分。方法采用硅胶、 SephadexLH-20、ODS 柱色谱等方法分离何首乌毛状根中的化学成分，并根据理化性质 和波谱数据鉴定其化学结构。结果从何首乌毛状根 60％乙醇提取物中分离得到了 12 个化 合物。利用理化性质及波谱技术确定其结构分别为：2,3,5,4''''-四羟基反式二苯乙烯-2-Oβ-D-葡萄糖苷(1)、没食子酸(2)、没食子酸甲酯(3)、3,5-二羟基苯甲酸(4)、丁香酸(5)、 对羟基苯甲酸(6)、胡萝卜苷(7)、β-谷甾醇(8)、豆甾醇(9)、烟酸(10)、碳直链十七酸 (11)、碳直链三十一酸(12)。结论上述 12 个化合物均为首次从转基因何首乌毛状根中分 离得到；化合物 3，4，5，6 为首次从该种植物中分离得到。 【关键词】何首乌毛状根化学成分 Abstract： ObjectiveTostudythechemicalconstituentsfromthetransgenichairyrootsofPolyg onummultiflorumThunb..MethodsThecompoundsIXIIwereisolatedbyacombinationofsilicagel,SephadexLH20,andODSchromatographictechnologiesandtheirstructureswereidentifiedbysp ectralmethods.ResultsTwelveknowncompoundswereisolatedfromhairyrootsofP. multiflorum.Theirstructureswereidentifiedbymeansofspectroscopicanalysisas:2 ,3,5,4''''-tetrahydroxystilbene-2-O-β-Dglucoside(1),gallicacid(2),methylgallate(3),3,5-dihydroxybenzoicacid(4),3,5dimethoxy-4-hydroxybenzoicacid(5),phydroxybenzoicacid(6),daucosterol(7),βsitosterol(8),stigmasterol(9),nicotinicaicd(10),n-CH3(CH2)15COOH(11),nCH3(CH2)29COOH(12).ConclusionAllcompoundsareisolatedfirstlyfromtransgen ichairyrootsofP.multiflorumandcompounds3～ 6areisolatedfromP.multiflorumforthefirsttime. Keywords：Polygoniummultiflorum；Hairyroots；Chemicalconstituents 何首乌，又名首乌、赤首乌，为蓼科植物何首乌 PolygonummultiforumThunb.的 干燥块根。其性微温、气微、味微苦而甘涩，有解毒、消疮痈、润肠通便等功能，可用于 肝肾精血亏虚、头昏目眩、须发早白等病症的治疗［1］。何首乌的化学成分主要为蒽醌 类、二苯乙烯苷类、酚酸类以及卵磷脂等化合物类型［2］。 自 20 世纪 80 年代以来，基因工程的研究成果渗透到细胞工程中来，引起了细胞培养 研究的新突破。其中通过发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)中 Ri 质粒介导的天然 植物遗传转化，建立发根培养系统来生产原植物中的次生代谢产物成为植物基因工程和细 胞工程相结合的一项新技术。转基因毛状根（transgenichairyroots）能够在无激素的培能够在无激素的培 养基上生长，并且其生长速度大大高于其相应的细胞培养物和未转化的根培养物［3］， 具遗传性状稳定、次生代谢产物含量高等优点［4］。本实验在前期工作基础上，对转基 因何首乌毛状根进行了较系统的化学成分研究，从中分离得到 12 个单体。本文报道其分 离和鉴定工作。 1 仪器与材料 熔点用北京泰克仪器有限公司 X-4 数显显微熔点测定仪测定；NMR 用 VARIANINOVA-400 型核磁共振仪测定。所用溶剂为工业级试剂经过重蒸处理； SephadexLH-20 为瑞士安玛西亚公司产品；RP-18 为美国默克公司产品；柱层析硅胶和 薄层层析硅胶(GF254)均为青岛海洋化工厂产品。 何首乌毛状根由本室诱导获得。PCR 和 Southern 杂交表明发根农杆菌 Ri 质粒中的 T-DNA 已经整合到何首乌细胞核的基因组中［3］。 2 方法与结果 2.1 提取与分离何首乌毛状根 450g(DW)，粉碎后经 60％乙醇加热回流提取 5 次， 2h/次。减压浓缩得浸膏。浸膏用水分散，依次以石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，浓缩 醋酸乙酯和正丁醇萃取液分别得到浸膏 A（50g）能够在无激素的培和浸膏 B（10g）能够在无激素的培。浸膏 A 用 300～ 400 目的硅胶柱分离，以氯仿-甲醇梯度洗脱。氯仿-甲醇(90：10)洗脱部分，经 SephadexLH-20 柱分离，得化合物 8，9，11 和 12；氯仿-甲醇(85：15)洗脱部分，经 SephadexLH-20 柱分离，ODS 纯化得化合物 2，3 和 7；氯仿-甲醇(80：20)洗脱部分， 经 RP-18 纯化得化合物 1。浸膏 B 用 200～300 目的硅胶柱色谱分离，以氯仿-甲醇(4:1) 洗脱，再经反复 SephadexLH-20 和 ODS 柱纯化，得化合物 1，2，4，5，6 和 10。 2.2 结构鉴定 2.2.1 化合物 1 白色无定形粉末(氯仿-甲醇)，易溶于甲醇，乙醇。IR(KBr)cm-1： 3420,1606,1515。ESI-MS:407［M+H］+，379［M-CH2=CH2+H］+；1HNMR［400MHz，CD4O］δ:3.3-3.8(6H，m，糖上 H)，4.54(1H，d，J=8.0Hz，H1'''''''')，6.28(1H，d，J=2.4Hz，H-4)，6.58(1H，d，J=2.4Hz，H6)，6.80(2H，d，J=8.0Hz，H-3'''',5'''')，6.96(1H，d，J=16.0Hz，H2a)，7.49(2H，d，J=8.0Hz，H-2'''',6'''')，7.75(1H，d，J=16.0Hz，H-1a)；13CNMR［100MHz，CD4O］δ:158.3(C-4'''')，155.9(C-5)，152.0(C-3)，137.9(C2)，133.6(C-1'''')，130.8(C-2a)，130.0(C-2'''',6'''')，129.2(C-1a)，121.6(C1)，116.4(C-3'''',5'''')，108.2(C-6)，103.5(C-1'''''''')，102.6(C-4)，78.1(C5'''''''')，77.9(C-3'''''''')，75.4(C-2'''''''')，70.6(C-4'''''''')，62.7(C-6'''''''')。以上数 据和文献［2］对比基本一致。故确定化合物 1 为 2,3,5,4''''-四羟基反式二苯乙烯-2-O-βD-葡萄糖苷(2,3,5,4''''-te-trahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside)。 2.2.2 化合物 2 淡棕色针状结晶(氯仿-甲醇)，易溶于甲醇，乙醇。mp235～238℃，FeCl3 反应阳 性。IR(KBr)cm-1：3434,1715,1629,1363,1092；ESI-MS:171［M+H］ +，169［M-H］-；1HNMR［400MHz,CD4O］δ:4.76(3H，s，3×ArOH)，7.09(2H，brs，2×Ar-H)；13CNMR［100MHz，CD4O］δ:170.5(C=O)，146.3(C-3,5)，139.6(C-4)，121.8(C1)，l10.3(C-2,6)。以上光谱数据与文献［5，6］基本一致，故将化合物 2 鉴定为没食子 酸(gallicacid)。 2.2.3 化合物 3 白色固体粉末(氯仿-甲醇)。IR(KBr)cm-1： 3362,1693,1536,1330,1263,1213,765；ESI-MS:185［M+H］+；1HNMR［400MHz,CD4O］δ:3.85(3H,s,COOCH3),7.08(2H,s,H-2,6)；13C- NMR［100MHz，CD4O］δ:169.2(C=O)，146.5(C-3,5)，139.8(C-4)，121.3(C1)，109.9(C-2,6)，52.3(OCH3)。以上数据与文献［6，7］基本一致，故鉴定该化合物 为没食子酸甲酯（methylgallate)。 2.2.4 化合物 4 白色结晶性粉末(氯仿-甲醇)，易溶于甲醇，乙醇。mp235～237℃。FeCl3 反应阳 性。IR(KBr)cm-1：3442,1682,1610,1482,1402,917,851,766；ESIMS:155［M+H］+；1H-NMR［400MHz，CD4O］δ:6.49(1H，t，J=2.4Hz，H4)，6.97(2H，d，J=2.4Hz，H-2,6)；13CNMR［100MHz，CD4O］δ:170.0(C=O)，159.7(C-3,5)，133.7(C-1)，119.0(C2,6)，108.1(C-4)。根据以上光谱数据鉴定该化合物为 3,5-二羟基苯甲酸(3,5dihydroxybenzoicacid)。 2.2.5 化合物 5 白色针晶(氯仿-甲醇)，易溶于甲醇。mp212～213℃，FeCl3 反应呈阳性。 IR(KBr)cm-1：3383,1699,1619,1522,1460,1373,1205,1114,865；ESIMS:197［M-H］-;1HNMR［400MHz，CD4O］δ:3.93(6H，s，OCH3×2)，7.37(2H，s，H-2,6)；13CNMR［100MHz，CD4O］δ:169.9(COOH)，148.8(C-3,5)，141.7(C-4)，121.9(C1)，108.3(C-2,6)，56.8(OCH3×2)。以上光谱数据与文献［8，9］基本一致，故化合 物 5 鉴定为丁香酸(syringicacid)。 2.2.6 化合物 6 白色针状结晶(氯仿-甲醇)，易溶于甲醇，FeCl3 反应呈阳性。IR(KBr)cm1:3396,2924,2651,2543,1673,1608,1594,1510,1448,1424,1320,1244,1169； ESI-MS:139［M+H］+；1HNMR［400MHz，CD4O］δ:6.85(2H，dd，J=7.2,2.4Hz，H3,5)，7.9l(2H，dd，J=7.2,2.4Hz，H-2,6)；13CNMR［100MHz，CD4O］δ:170.1(C=O)，163.4(C-4)，133.0(C-2,6)，122.7(C1)，116.0(C-3,5)。以上光谱数据与文献［10，11］基本一致，化合物 6 鉴定为对羟基 苯甲酸(p-hydroxybenzoicacid)。 2.2.7 化合物 7 白色无定型粉末(甲醇)，难溶于氯仿、丙酮，微溶于甲醇，易溶于吡啶。mp282～ 284℃。254nm 下无紫外吸收，与 10%硫酸乙醇溶液反应显紫红色，与磷钼酸反应显蓝 色，初步推断化合物为萜类或甾体化合物。TLC 结果显示 Rf 值与胡萝卜苷标准品一致。且 混合后熔点不下降，故将该化合物鉴定为胡萝卜苷(daucosterol)。 2.2.8 化合物 8 白色片状结晶。1H-NMR［400MHz，CDCl3］δ:0.68(3H，s，H18)，0.80(3H,t，J=8.0Hz，H-29)，0.85(6H,d,J=7.2Hz，H26,27)，0.92(3H,d，J=7.2Hz，H-21)，1.01(3H，s，H-19)，3.52(1H,m,H3)，5.36(1H,m,H-6)。以上光谱数据与 β-谷甾醇文献值［12］基本一致，故将其鉴定为 β-谷甾醇(β-sitosterol)。 2.2.9 化合物 9 白色片状结晶。1H-NMR［400MHz，CDCl3］δ:0.79(3H，s，H18)，0.80(3H,t，J=8.0Hz，H-29)，0.87,0.83(3H,each，brs，H26,27)，1.04(3H，s，H-19)，1.05(3H，brs，H21)，5.03(1H,dd,J=8.5Hz，15.0Hz，H-23)，5.15(1H，dd，J=8.5，15.0Hz，H22)，5.36(1H，brd，J=4.4Hz，H-6)。根据以上光谱数据与文献［13］对照，鉴定该 化合物为豆甾醇(stigmasterol)。 2.2.10 化合物 10 白色针晶。mp234～237℃。ESI-MS:124［M+H］+，80［M-CO2+H］＋；1HNMR［400MHz，DMSO-d6］δ:7.55(1H，dd，J=8.0,4.8Hz，H5)，7.78(1H，d，J=4.8Hz，H-6)，8.26(1H,d,J=8.0Hz，H-4)，9.072(1H,brs，H2)；13C-NMR［100MHz，DMSO-d6］δ:166.5(COOH)，153.5(C-2)，150.4(C6)，137.2(C-4)，126.8(C-3)，124.0(C-5)。以上光谱数据与文献［8］基本一致,该化 合物鉴定为烟酸(nicotinicaicd)。 2.2.11 化合物 11 白色固体粉末，易溶于氯仿。ESI-MS:269［M-H］-；1HNMR［400MHz，CDCl3］δ:0.88(3H,t,J=6.8Hz,CH3)，2.38(2H,t，J=7.6Hz,αCH2)。化合物鉴定为碳直链十七酸。分子式为：n-CH3(CH2)15COOH。 2.2.12 化合物 12 白色固体粉末，易溶于氯仿。ESI-MS:465［M-H］-；1HNMR［400MHz，CDCl3］δ:0.88(3H，t，J=6.8Hz，CH3)，2.38(2H，t，J=7.6Hz ，α-CH2)。综合以上数据，将化合物 12 鉴定为碳直链三十一酸。分子式为：nCH3(CH2)29COOH。 3 讨论 本研究组对何首乌毛状根中的蒽醌类成分已有报道。本实验在前期工作基础上对其进 行了较系统的化学成分研究。从中分离到 12 个单体，均为首次从转基因何首乌毛状根中 分离得到；其中化合物 3，4，5，6 为首次从该种植物中分离得到。