血管生成素研究管理论文

【关键词】血管生成素；肿瘤；血管生成；血管新生 [关键词]血管生成素；肿瘤；血管生成；血管新生 早在 1971 年，美国学者 Folkman[1]就曾提出肿瘤的生长与转移依赖于血管的生成， 在随后的几十年中越来越多的研究证实了这一点。血管生成素（angiopoietin，Ang）是是 第一个被确定的来源于人肿瘤组织具有促血管生成作用的细胞因子[2]。目前已知该家族包 括 Ang1，2，3，4 四个成员，其中 Ang1、2 与血管生成关系最为密切，并且有关该家族 成员在肿瘤血管生成中的研究正日益增多。现就 Ang1 和 Ang2 在肿瘤血管生成中的作用 作一综述。 1Ang1 和 Ang2 的结构与生物学功能 1.1Ang1 和 Ang2 的结构 Ang1 基因在 1996 年由 Davis 等[3]首次克隆出来。人 Ang1 基因定位于第 8 号染色体长臂上（8q22.3～q23）是，其基因开放的阅读框为 1497bp，编码 498 个氨基酸。Ang1 是一种糖蛋白，相对分子质量约 75000。Ang2 基 因由 Maisonpierre 等[4]在 1997 年从人和小鼠的 cDNA 文库内首先克隆出来。人 Ang2 基因定位于第 8 号染色体短臂上（8q23.1）是，其基因开放的阅读框为 1491bp，编码 496 个氨基酸。Ang1，Ang2 的蛋白结构基本相同，均有信号肽、N 端卷曲螺旋结构域 （coiledcoildomain，CC）是和 C 端类纤维蛋白原结构域 （fibrinogenlikedomain，FL）是。其主要的结构特点有：（1）是Ang1、Ang2 的 N 端信 号肽分别由 10 和 20 个疏水氨基酸组成，与血管生成素分泌到细胞外有关。（2）是卷曲螺 旋结构域分别由 180 和 200 个左右氨基酸构成，该断氨基酸序列折叠弯曲，形成卷曲螺 旋四级结构，这一结构可能与血管生成素和其他蛋白形成多聚体有关。（3）是类纤维蛋白 原结构域具有高度保守性，与血管生成素的生物学功能密切相关。改变该区域的氨基酸序 列，血管生成素的功能也发生相应的改变；敲除血管生成素其他区域的氨基酸序列，保留 该结构则其功能没有明显改变[34]。CC 和 FL 结构域之间的连接肽是 Ang1 与细胞外基质 （extracellularmatrix,ECM）是连接的结构域[5]。Ang2 和 Ang1 的主要区别在于 CC 与 FL 的交界处前者比后者少 1 个半胱氨酸，导致了其生物学功能的截然不同。 1.2Ang1 和 Ang2 的生物学功能 Ang1 和 Ang2 是 Tie2（tyrosinekinasewithimmunoglobulinandepidermalgrowthfactorhomology domain2）是的天然配体。Ang1 主要由血管旁支持细胞包括周细胞（pericyte）是、血管平 滑肌细胞和肿瘤细胞等合成，通过旁分泌作用，与附近内皮细胞膜上的 Tie2 受体特异性结 合，引起其受体磷酸化和随后的信号传递。迄今对调控其表达的因素知之甚少。Ang1 的 主要生物学功能有：(1)抑制内皮细胞凋亡、促进内皮细胞生存，减少血管的萎缩和退化。 与血管内皮生长因子（VEGF）是不同，Ang1 不是细胞有丝分裂原，不能促进血管内皮细胞 增殖和内皮细胞相互聚合形成血管，而是通过激活丝氨酸苏氨酸蛋白酶 AKT，稳定细胞活 力，抑制凋亡。(2)促进内皮细胞出芽，迁移，趋化。(3)稳定血管，防止渗漏 [3,6]。Ang2 主要由血管内皮细胞合成，通过自分泌作用，与自身细胞膜上的 Tie2 受体 特异性结合，但不引起受体磷酸化和随后的信号传递。因此 Ang2 的主要功能是竞争性抑 制 Ang1 形成不稳定的血管。缺氧、VEGF、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是等因素可 促进 Ang2 表达增高[7]。 2Ang1 和 Ang2 与肿瘤的血管生成 Ang 在肿瘤血管生成中发挥了重要作用，在很多多血管性的实体肿瘤中得到了证实， 如在人胃癌、肝癌、乳腺癌和胶质细胞瘤等均可见到有 Ang1 和 Ang2 及其受体 Tie2 表达 增加，特别是在肿瘤边缘的血管新生区。由此可见，Ang1、Ang2 参与肿瘤的血管生成， 但目前其具体的机制尚不完全清楚。Ang2 与肿瘤血管生成关系密切，可促进肿瘤细胞及 肿瘤血管的生长；但 Ang1 和肿瘤血管生成的关系尚有争议。 2.1Ang1 与肿瘤血管生成 2.1.1Ang1 在肿瘤中的表达及其对肿瘤生长的作用有研究表明，Ang1 可促进肿瘤血 管生长。Torimura 等[8]用双重免疫荧光染色和 RealtimePCR 检测 Ang1 及其受体 Tie2 在不同肝癌细胞系和 59 例肝癌组织中的表达情况，发现 Ang1 在体外培养的肝癌细胞和 肝癌组织中均较对照组表达升高，但与肿瘤的分化程度无相关性；其受体 Tie2 表达于内皮 细胞、肝星状细胞和平滑肌细胞，说明 Ang1 在肝癌的血管生成中起了重要作用。Wang 等[910]用免疫组化、RTPCR 和 WesternBlot 检测 53 例胃癌组织和 23 例正常胃粘膜中 Ang1 的表达，结果显示有 66％的胃癌组织中 Ang1 明显升高且与胃癌细胞株的分化程度 有相关性。他们构建正、反义 Ang1 载体并将其转染至胃癌细胞 SGC7901，裸鼠成瘤试 验发现转染正义 Ang1 组肿瘤生长及血管生长较对照组明显增加，而反义转染组肿瘤生长 缓慢，血管生长减少。Stratmann 等[11]将内皮细胞与胶质瘤细胞共同培养于基质胶 （matrigel）是中，可检测到 Ang1 的表达，并观察到内皮细胞迁移，形成相互吻合的血管 网，血管成条索状；反之，当去除胶质瘤细胞时，未能检测到 Ang1 的表达，而内皮细胞 堆积成团，血管延伸异常。推测肿瘤细胞可分泌 Ang1，使内皮细胞迁移、趋化，从而促 进肿瘤血管生成。Zadeh 等[12]将 Ang1 转染至恶性胶质细胞瘤，建立皮下和颅内动物模 型，并用四环素控制 Ang1 的表达水平，发现 Ang1 可促进胶质瘤形成“丝球体” （glomeruloidbodies:microvascularproliferationandformationofvascularentities ）是,且有明显的剂量依赖性；而当阻断 Ang1/Tie2 作用后，“丝球体”形成也被阻断，由此推 测 Ang1 是胶质细胞瘤病理性血管形成的关键调节分子。上述体、内外试验及临床研究均 提示 Ang1 可促进肿瘤的血管生成。而与前述结论相反，也有少数人的研究结果认为 Ang1 抑制肿瘤血管生成。Tian 等[13]用 RTPCR 检测乳腺癌细胞 MCF7 及组织中 Ang1 的表达时发现，Ang1 在体外培养的癌细胞中大量表达，但在组织中的表达率仅为体外培 养癌细胞的 1/7。在乳腺癌的异种种植瘤动物模型中，Ang1 过表达时，肿瘤边缘血管被 大量的间充质细胞、周细胞所包绕，血管的扩张及出芽受限，癌细胞增殖减少，凋亡增加， 肿瘤生长迟滞。Stoeltzing 等[14]用重组 Ang1 转染人肝癌、结肠癌细胞并种植到裸鼠身 上，发现转染 Ang1 的 HT29 种植瘤比转染空载体组的体积小，血管密度低，肿瘤细胞增 殖程度低，血管周细胞包绕程度高，血管渗透性低。推测 Ang1 可通过抵抗血管渗漏，抑 制血管新生，维持血管稳定，有阻止肿瘤转移的潜能。 2.1.2Ang1 在肿瘤血管生成中的可能作用机制尽管目前就 Ang1 在肿瘤生成中的作用 尚未形成一致观点，但其参与肿瘤血管生成已是一个不争的事实。认为 Ang1 可促进肿瘤 血管生成主要有如下几方面的可能机制。（1）是抑制内皮细胞凋亡。Ang1 抗内皮细胞凋亡 作用是一系列复杂的生化反应通路。其中由磷脂酰肌醇 3 激酶 （phosphatidylinositol3kinase,PI3K）是的信号传导在抗凋亡中起到重要作用。Ang1 与 Tie2 受体结合后，能够引起与受体相连的 PI3K 的亚基 P85 磷酸化从而激活 PI3K。随后 活化的 PI3K 作用磷酸肌醇脂，提高细胞内 1、4、5 三磷酸肌醇和 3、4、5 三磷酸肌醇的 含量，两者正性调节丝氨酸/苏氨酸激酶。苏氨酸结合磷脂酰肌醇后被磷酸化，磷酸化位点 在激活环 Thr308 和羧基端 Ser473，其中 Ser473 位点是依赖 PI3K 磷酸化的。Ang1 作 用后 survivin 表达升高，可通过抑制 caspase7、caspase9 磷酸化或 Bad 等途径抗凋亡 [15]。（2）是介导血管内皮细胞与血管旁细胞间的相互作用。Ang1 是一种分泌性的蛋白分 子，当肿瘤细胞受到各种因素作用后可分泌 Ang1，Ang1 可促进胞浆素及金属基质蛋白 酶 2（matrixmetalloproteinases,MMP2）是的分泌，促进基底膜的降解，从而使内皮细 胞迁移并促进与血管旁细胞间的相互作用[15]。（3）是抑制肿瘤细胞凋亡。有实验发现转 染 Ang1 基因的肿瘤细胞凋亡指数降低，但目前具体机制不清楚。而认为 Ang1 抑制肿瘤 血管生成的主要机制是过高的 Ang1 使血管周细胞包绕程度高，减少了血管渗漏，形成稳 定的血管，从而抑制了肿瘤的生长。由此可见，在肿瘤发展过程中，Ang1 形成的稳定血 管可以促进肿瘤血管生成，也可以抑制肿瘤生长，可能受到其他一些因子的调节[16]。 2.2Ang2 与肿瘤血管生成 2.2.1Ang2 在肿瘤中的表达及其对肿瘤生长的作用 Ang2 参与多种肿瘤的血管生成， 且与肿瘤血管形成的数目、肿瘤的临床分期及预后关系密切。Ahmad 等[17]应用 Ang2cDNA 转染人结肠癌细胞 HT29 建立小鼠荷瘤模型，发现 Ang2 转染组的肿瘤体积 明显变大，肿瘤组织内血管密度明显增高，肿瘤细胞的增殖指数高；而 Ang1 转染组肿瘤 的生长、血管密度均较对照组低，推测 Ang2 可能通过拮抗 Ang1 促进血管新生，从而加 速肿瘤的生长。Etoh 等[18]对胃癌病例的研究也发现，组织中 Ang2 高表达同时伴有血管 密度增高、成熟度下降，患者临床 TNM 分期晚,术后生存率低。用 Ang2 转染的胃癌细胞 接种裸鼠，结果发现肿瘤转移率增高，且转染的胃癌细胞在体外 VEGF 存在的条件下，能 促进人脐静脉内皮细胞分泌更多的金属基质蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMP）是 和尿激酶等蛋白水解酶，这可能与 Ang2 促进肿瘤生长、转移有关。 2.2.2Ang2 在肿瘤血管生成中的可能作用机制 Ang2 在早期可促进血管退化。在肿瘤 形成早期，肿瘤细胞与宿主共择（cooption）是并形成一个血供较好的血管区，但这些血管 并不随肿瘤的生长而生长，却发生了退化，同时伴有 Ang2 表达增多。其可能的原因是肿 瘤组织和健康组织为同一血供，由于肿瘤组织生长快、代谢高，较正常组织有优势，此时 机体就自分泌 Ang2 进行“自杀性防御”，破坏被肿瘤组织占据的血管，阻止肿瘤的进一步 生长。这期间 VEGF 的表达不增高，肿瘤组织表现为血管退化、肿瘤细胞凋亡。随后，边 缘残存的肿瘤在缺氧的刺激下，产生大量的 VEGF[19]。Ang2 参与血管形成的启动阶段 和激发阶段。Ang2 开始通过拮抗 Ang1 破坏肿瘤血管，消除血管基底膜和血管旁细胞对 血管形成的限制，并激活了内皮细胞；然后，在残余肿瘤细胞受到缺氧等刺激大量分泌 VEGF 的情况下，活化的内皮细胞对 VEGF 的作用极为敏感，迅速发生增殖、侵袭、迁徙， 新生血管芽生。但由于 Ang2 的持续高表达拮抗了 Ang1 稳定血管的作用，所以新生的肿 瘤血管管壁不完整，渗透性高。在肿瘤的生长过程中，发生了原宿主成熟血管的退化和肿 瘤新生血管形成的双向效应，同时伴有 Ang2 的持续性增高和 VEGF 迟发性增高。另外， Ang2 可通过细胞整合素激活 FAK(focaladhesionkinase)、p130Cas 和 JNK(cjunNH2terminalkinase)，促进 MMP2 的表达与分泌，引起内皮细胞的迁移，促进 肿瘤新生血管的形成，引起肿瘤的生长与转移[20]。 3 有待进一步解决的问题 Ang1 和 Ang2 均参与肿瘤的血管生成。Ang1 在肿瘤血管生成的作用尚未达成一致 的意见，Ang1 是促进还是抑制肿瘤的血管生成？Ang1 受哪些因素或细胞因子的调节？ 是否在肿瘤形成的不同阶段 Ang1 发挥了不同的作用？有哪些调控机制？Ang2 主要是由 血管内皮细胞产生，部分肿瘤细胞也能分泌 Ang2，那么，这些表达 Ang2 的内皮细胞和 肿瘤细胞是否存在某种自分泌调节机制？Ang2 对淋巴管的作用机制是什么？这些问题都 有待于进一步研究。相信随着对 Ang 信号转导、基因表达调控等方面进一步深入的研究， 有望为肿瘤的临床治疗提供一种新途径。 【关键词】血红素加氧酶 [关键词]血红素加氧酶 1；心脏疾病；文献综述 人类在进化过程中一种适应性变化就是能够抵御外界氧化损伤而保持自身稳定。超氧 化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶和一些非酶类物质维生素 E、维生素 C 在抵御外界 氧化损伤中都起了重要作用，还有鲜为人知的血红素加氧酶（HO）是在应激条件下保持细胞 的稳定性也至关重要。HO 基因缺失的个体不能正常生长并且对氧化损伤的敏感性增加， 直至最后死亡[1]。HO 是血红素氧化的限速酶，在体内有 3 种同工酶，HO1、HO2 和 HO3，分别由不同的基因编码，其氨基酸序列的同源性 HO1 与 HO2 之间是 40%，HO2 与 HO3 是 90%。他们在分子结构、表达调节和组织分布中有很大差异。HO1 为诱导型而 HO2 为构成型。HO 的第 3 种亚型 HO3 最近才被发现，与 HO2 结构相似,但对血红素的 分解功能较弱。HO1 在组织氧化损伤的病理条件下起着保护细胞作用，而 HO2 则起着生 理性调节作用[2]。目前研究主要集中在对 HO1 的基因表达、调控以及与疾病的关系等方 面。 1HO1 的一般生物学特性与功能 HO1 也称之为热休克蛋白 32（HSP32）是，是目前研究最多的一种同工酶。相对分子 质量为 32000，染色体定位 22q12，在细胞中定位于微粒体，诱导性表达于肝、脾、心、 肺、血管平滑肌、脑等组织，诱导因素为应激、缺氧、内毒素、过氧化氢、重金属、紫外 线、细胞因子、生长因子等。作为血红素降解的限速酶，HO1 降解由衰老或破损的红细胞 释放出血红素，首先生成胆绿素、一氧化碳(CO)和 Fe2+，然后胆绿素在胆绿素还原酶作 用下转换成胆红素，Fe2+诱导并参与了体内铁蛋白的合成。在血红素降解过程中需要烟 酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）是供氢并消耗 O2。以往认为血红素代谢产物不仅对机 体无益，过量时还可对机体造成损害。如游离胆红素如果不能和葡萄糖醛酸充分结合并排 出体外，就容易透过血脑屏障对神经系统造成损伤；Fe2+可产生活性羟基引起严重的氧 化应激，导致细胞膜损坏和组织的损伤[3]；而 CO 和血红蛋白结合后可造成组织缺氧。随 着研究深入，人们对 HO1 及其催化产物在机体中的作用有了更深入的了解。首先 HO1 分 解血红素，避免了血红素对细胞的损伤，催化过程中消耗了 O2，减少了氧自由基生成。 其次 HO1 的催化产物铁蛋白、CO、胆红素在氧化应激中起着保护组织细胞的作用，其中 铁蛋白可降低细胞内 Fe2+的浓度[4]，同时 HO1 还可以上调内质网上的 Fe2+通道，促 进细胞内 Fe2+泵出[5]，防止由 Fe2+介导的氧化应激损伤；胆红素作为 HO1 的代谢产 物，能有效地清除氧自由基，防止细胞脂质层过氧化，而且游离胆红素比结合胆红素更能 有效地抑制低密度脂蛋白分解[6]；CO 可以促使血管舒张，其机制为 CO 和 NO 一样可以 活化鸟甘酸环化酶，使三磷酸鸟嘌呤核苷（GTP）是转化成环磷酸鸟甙（cGMP）是，使血管 舒张；CO 还可以通过刺激平滑肌细胞膜上的 K+通道促使血管舒张，以及抑制缩血管内皮 素(ET1)的释放所引起的血管收缩[7]。另外，CO 还通过鸟甘酸环化酶活化 P38 有始分裂 原活化 MAPK 信号转导途径，既可抑制炎症因子的基因表达，又可促进抗炎因子的产生来 抑制炎症反应[8]。除此以外，CO 还有防止血管平滑肌细胞过度增生、抗血小板聚集、抗 凋亡等作用。 2HO1 的诱导与表达 调控 HO1 可以被许多不同种类的因素所诱导，这些因素的共同特点是都能引起氧化 应激，并通过有丝分裂原活化 MAPK、蛋白激酶 C、cAMP 依赖性蛋白激酶 A、cGMP 依 赖性蛋白激酶 G 等不同的信号途径来诱导 HO1 基因表达。研究表明，HO1 基因表达调控 主要在转录水平上，HO1 启动子区域包含不同的顺式反应元件,包括激活蛋白 1(AP1)结合 位点、金属反应元件、抗氧化反应元件、热休克和血红素反应元件等，转录因子如氧化应 激反应转录因子 NFκBB 和 AP1 等与这些特殊元件结合可导致 HO1 基因激活。但 HO1 基因 调控在不同细胞种类和物种之间有很大差异，如在大鼠 HO1 的启动子上有热休克反应元 件，热休克可促使热休克核因子聚集到相应的基因片段使 HO1 基因稳定。但在人类，两 者结合则会引起 HO1 基因的表达[9]。目前研究最多的转录因子是激活蛋白因子 1（AP1）是家族，其中 NFE2 相关因子 2（Nrf2）是最为重要。Nrf2 可以和 HO1 基因抗氧化 反应片段结合，调节相关基因，在氧化应激细胞反应中起重要作用。动物试验证实在小鼠 HO1 基因的增强区有一 10bp 序列，被称为应激反应元件（StR Ｅ）是，对于缺氧以外各种 因子引起的应激反应非常重要，StRE 中包含了 AP1 家族结合位点，两者结合可诱导 HO1 基因表达，而 StRE 突变会使 HO1 基因在应激状况下不能被活化，显示了 AP1 蛋白在 HO1 基因表达调控中的作用。其他转录因子如低氧诱导因子 1（HIF1）是，在与 HO1 基因 相应片段结合后可诱导缺氧状况下的 HO1 基因表达[10]。HIF1 在含氧量正常情况下也可 被一些受体介导因子如生长因子、细胞因子所诱导，但效应远低于低氧因素，低氧可以通 过 MAPK 或磷脂酰肌醇 3 激酶信号通道介导 HIF1 蛋白合成[11]。 3HO1 与心血管系统 3．1HO1 与冠状动脉疾病（CAD）是早在 1994 年 Schwertner 等[12]第一次发现了 血浆中胆红素的浓度与 CAD 的发病率成显著负相关，这个重要发现提示血浆中的胆红素浓 度低于正常可能会导致缺血性心脏疾病的发生。随后，Hopkins 等也注意到有家族性 CAD 的病人血浆中的胆红素浓度明显低于无家族史的病人。Hunt 等进一步证实遗传性胆 红素浓度降低病人早期易患 CAD。另外人们发现胆红素血浆浓度与许多 CAD 的危险因素 如吸烟、低密度脂蛋白、糖尿病、肥胖呈负相关，与 CAD 保护性因素高密度脂蛋白呈正相 关。但即使消除了 CAD 的危险因素，胆红素血浆浓度降低仍易导致 CAD,表明了血浆中的 胆红素浓度直接与 CAD 相关。CAD 与氧自由基生成、脂质过氧化、动脉粥样硬化以及炎 症有关[1314]。血管动脉粥样硬化主要是因为低密度脂蛋白氧化并被内皮巨噬细胞吞噬后 形成了富含脂质的泡沫状细胞。而胆红素能防止脂蛋白特别是低密度脂蛋白氧化，从而阻 止动脉粥样硬化斑块形成。同时胆红素能清除氧自由基和与炎症有关的过氧化氢，保护心 肌细胞膜免受氧化损伤。HO1 还可通过其他途径来影响 CAD 的发生。如 HO1 分解血红蛋 白（Heme）是，减少了 Heme 对心肌细胞的氧化损伤；产生的 CO 可通过活化鸟甘酸环化 酶增加平滑肌细胞内的 cGMP，使冠脉平滑肌舒张，还可抑制血小板聚集和血管平滑肌增 生；HO1 促使铁蛋白合成增加也消除了由细胞内铁引起的细胞损伤和慢性炎症。总之， HO1 及其代谢产物可通过不同的途径降低 CAD 发病的危险性。 3．2 心脏缺血再灌注损伤随着心脏移植、体外循环、冠脉搭桥、冠脉介入治疗应用于 临床，缺血再灌注损伤已引起医学界的高度重视。动物实验显示，氧自由基、钙超载、心 肌纤维能量代谢障碍、血管内皮细胞、一氧化氮、中性粒细胞、细胞黏附分子和细胞凋亡 等均可能参与再灌注损伤的发病过程。而 HO1 作为抗氧化应激的蛋白酶，它在心肌缺血 及随后的再灌注损伤中的作用也越来越受到人们关注。Clark 等[6]发现在心肌缺血前 24h 用氯高铁血红素(HO1 诱导剂)预处理，再灌注后心肌功能较对照组有显著改善，而且在 HO1 高表达的区域，线粒体完整性保存较好，心肌梗死面积明显缩小。氯高铁血红素预处