青霉素结合蛋白检测技巧

当前,细菌耐药性问题日趋严重,给临床治疗带来困难,对卜内酞胺类抗生素而言,某些菌 青霉素结合蛋白(PBps)PBps))改变造成的耐药性,是卜内酞胺类抗生素的特点。一般细菌的 PBPs) 均为胞浆膜上的蛋白质,是细菌致死的靶位。它的数目、位置、亲和力的变化造 成与卜内酞胺类抗生素不易结合而产生耐药性。人们常采用 SDS 聚丙烯酞胺凝胶电 泳和放射自显影的方法研究 PBPs) 图谱,以便了解敏感菌和耐药菌的区别。 所以,PBPs) 测定技术是研究压内酸胺类耐药性的重要手段。的穿透力弱,用一般放射自 显影法不能获得 PBPs) 图谱,需采用荧光闪烁剂增效的“荧光放射自显影法”。国内有关 PBps) 测定技术报道甚少,以 3HH 标记者更少,本文介绍这一技术。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种肺炎链球菌 3H1003H,3H03H01(PBps)北京药品生物制品检定所;Pen08.R6Pen08.R6 本室保存 菌种。 1.1.2 培养基 C+Y 培养基。 1.1.3H 仅器及药品 垂直板凝胶电泳槽(PBps)吴县科研仪器厂);Pen08.R6NG 一 l 型真空凝胶干燥器(PBps)太仓电视机厂);Pen08.R6TGLL 一 1a 型台式高速冷冻离心机(PBps)中科院上海生物化学研究所);Pen08.R6843H8 一超低温冰箱 (PBps)FormaSclentifi。,美国);Pen08.R6电泳仪 DY 一 1 型(PBps)上海医用分析仪器厂);Pen08.R6丙烯酞胺 (PBps)Aerylamide,临海止学厂产);Pen08.R6甲撑双丙烯酞胺.(PBps)big;Pen08.R6瑞士产品);Pen08.R6N,N,N,N 一四甲基乙 二胺(PBps)TEMED,上海前进农场制剂厂);Pen08.R63HH 标记青霉素乙酞呱陡盐 (PBps)NewEngiandNuclear,美国);Pen08.R6x 光底片(PBps)天津感光材料厂;Pen08.R6KodakDiangnos)tiefilmX 一 OmatAR13HX18em);Pen08.R62,5 一二苯基嗯哇(PBps)PPO,闪烁纯,上海试剂一厂);Pen08.R6月桂酞肌氨 酸钠(PBps)Sarkos)yl,Sigma);Pen08.R6十二烷基硫酸钠(PBps)SDs),上海新华化工厂);Pen08.R6二甲基亚矾(PBps)DMs)o, 北京旭东化工厂)。 1.2 方法 1.2.1 肺炎链球菌 PBPs) 样品的制备将肺炎链球菌按种 c+Y 培养基 3H7℃过夜培养,次 日再移种新鲜培养基中,3H7℃培养 2~3Hh 至对数生长期,菌数约为个/ml(CFU/ml),ml(PBps)CFU/ml(CFU/ml),ml),菌 液分装试管,每管 lml 于冰浴中加入不同浓度的氖标记青霉素 3H7℃保温 10min,在冰 浴中加入 5 非标记青霉素 G 钠盐 20 万单位/ml(CFU/ml),ml,冷冻离心 5000:/ml(CFU/ml),minlom 仇,弃去上 清,菌体沉淀用 50 以磷酸缓冲液(PBps)PH6.8)做成菌悬液,然后加入 5 一 10 拼一 20%sarkosyl,37℃s)arkos)yl,3H7℃保温 10min 使细胞溶解,加入 3H0 协一样品缓冲液,煮沸 3Hmin,置 室温备用。 1.2.2 聚丙烯鱿胺凝胶电泳采用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳(PBps)SDSPAGE)方 法。制备凝胶薄片(PBps)厚 0.2cm),凝胶配方:分离胶 (PBps)10%sarkosyl,37℃):Aerylamide:bis)(PBps)3H0:0.5)6.7ml,Tris)(PBps)pH8.8,1.5ml/ml(CFU/ml),l)5ml,10%sarkosyl,37℃SDS0.2ml, 蒸馏水 8.1ml,真空搅拌 10 一 15min 除去气体,再加入 TEMED,浓缩胶(PBps)5%sarkosyl,37℃):按上述 配方依次为 1.7ml,2.5ml,0.1 而,5.6ml,7.5,和 150。先配制分离胶,灌注直立式电泳 槽后,使凝胶凝固。次日加入浓缩凝胶,放入加样梳,静置 2h。在加样槽内依次分别加 入 PBps) 样品。接通电流,第一小时维持电压在 60v,至染料前沿到达分离胶和浓缩胶 交界处调高电压至 120v,走完全程约需 3H 一 4h,用考马斯蓝 R250 染色 3H0 一 45min, 过夜脱色。 1.2.3H 关光放射自显影方法凝胶片用二甲基亚矾(PBps)DMSo)处理 3H0min,再用新鲜 DMSo 再次处理 3H0 而 n,20%sarkosyl,37℃即。处理 2 一 3Hh,l%sarkosyl,37℃甘油和 1%sarkosyl,37℃乙酸处理 lh,将凝胶片贴附在厚 滤纸上,使用凝胶真空干燥器进行真空干燥,将凝胶片和 x 光底片贴紧,置于 x 光射线暗 匣内,放超低温冰箱一 70℃使曝光 1~Zwr,将 x 光底片显影,定影,冲洗得到 PBPs) 的放 射自显影图谱。x 光底片预曝光条件:(PBps)1)国产 x 光底片用照相闪光灯红色滤光片,加 6 层红色玻璃纸滤过,x 光底片上覆盖 6 层红色玻璃纸,距离 50cm,闪光灯闪二次;Pen08.R6(PBps)2)进 口 x 光底片预曝光用 x 光机最小功率 100mA40kV,距离 40em,每张 x 光底片曝光 0.04s)。 1.2.4 竟争性结合试验定量菌液中分别加入不同浓度的甲氧西林保温 3H7℃10min,然 后加入饱和量的氛标记青霉素,3H7℃保温 10min,再按上述方法继续进行实验。 2 结果与讨论 本法测定肺炎链球菌全细胞中 pBps) 的含量,首先需要分离菌体蛋白,为使菌体蛋白浓 度维持在一定的水平上,必须控制菌龄和菌液浓度。菌液浓度约 CFU/ml(CFU/ml),ml。肺炎链球菌 破碎细胞的方法以采用离子型去污剂 s)arkos)yl 为宜,它能选择性地作用于胞浆膜(PBps)3H), 使胞浆膜破裂,菌体蛋白释放出来,与此同时,已经与青霉素结合的膜蛋白 PBPs) 也一起 释放出来。样品制备完毕,煮沸 3Hmin,以便除去某些蛋白质的干扰,青霉素与 PBPs) 结 合较牢固,不会被破坏。 本实验采用 SDS 一 PAGE 方法(PBps)4-5),SDS 在分离胶与浓缩胶中的终浓度均为 0.1%sarkosyl,37℃。 分离胶浓度为 10%sarkosyl,37℃,浓缩胶浓度为 5%sarkosyl,37℃。 氖标记物穿透力较弱,用一般放射自显影方法不能得出图象,本实验采用荧光放射自显 影法(PBps)6-8)(PBps)Fluoro,aphy),检测聚丙烯酞胺凝胶片上 3HH 标记的蛋白质,有一定的优点。 PPO 是荧光增效剂,其作用原理不是直接依赖 s)H 放射出来的日射线,而是藉助 3HH 上的 日粒子与 PPO 相互作用发射出的光,造成 x 光底片的局部发黑得到深浅不同的暗线,从 而获得青霉素结合蛋白的图谱。肺炎链球菌的 PBPs) 图谱上可见有三条区带,即 p 即;Pen08.R6 (PBps)a,b),pBpZ 和 pBp3H。一般情况下,青霉素浓度越大,亲和力越强,颜色越深,在竞争性 试验中,甲氧西林浓度越大,亲和力越强,颜色越浅。 据报道(PBps)7-9),x 光底片预曝光可增加荧光放射自显影法的灵敏度,.因为预曝光可以纠正 样品放射性和 x 光底片图象吸收值之间的非线性关系,所以,经预曝光的 x 光底片上所 得到的图象可以正确反映出样品的放射性分布情况。 用国产 x 光底片不经预曝光时,无图象出现,经预曝光则有图象出现(PBps)见图 1),用进口 x 光底片未经预曝光者,图象的暗线区别不大(PBps)见图 2)。预曝光后的 x 光底片显示出暗线 深浅不同的正确图象(PBps)见图 3H)。国产 x 光底片与进口 x 光底片比较,国产片敏感性较低, 预曝后的 x 光底片上出现的暗线普遍较浅且细,PBPI。不可见。