蜘蛛毒素药用价值分析论文

1 蜘蛛的传统药用 蜘蛛是动物界中的一个庞大家族，种类多、数量大、分布广，与人类的关系密切。我 国人民对蜘蛛的认识，早在公元前 1200 年的《诗经》中就有记载。以蜘蛛作为药用，始 于唐代陈藏器《本草拾遗》，距今有 1000 多年历史。资料显示,蜘蛛全体的应用在以下方 面:① 治疗咽喉炎和咽喉息肉；②治疗喉蛾(又名乳蛾)；③治疗鼻炎和鼻息肉；④治疗牙疳； ⑥治疗肺结核和淋巴结核；⑥治疗脑动脉硬化和脑供血不足；⑦治疗中风偏瘫；⑧治疗肾 阳亏虚；⑨治疗男性不育症；⑩治疗脱肛；○11 治疗痔疮等［3～11］。 2 蜘蛛毒素的研究与应用 近年来，蜘蛛毒素的研究成为蛛形学研究的热门之一。如美国一公司从蜘蛛毒液中分 离出一种多肽蛋白质，使用几十微克，就可起到高效止痛作用，且无吗啡样成瘾性。美国 SIGMA 化学公司开发的蜘蛛毒素价格是蛇毒的 10 倍。在众多蜘蛛品种中，要数捕鸟蛛毒 液多、质量高，每 200 只 1 年可提取蜘蛛干毒 10g 左右。 我国科研人员在抗衰老研究中心用蜘蛛毒液研制成功的“脑力再造丸”“增微一号丸”等， 对治疗脑血管疾病和肿瘤效果很好。 2.1 蜘蛛毒素的获取采用具有动物肉体柔软性又易清洗的用具，模仿某种昆虫的动作 对毒蜘蛛进行触及性诱导，或者模仿某种生物体的动作对毒蜘蛛进行攻击性诱导，调动蜘 蛛捕食和自卫的本能及活性，使毒蜘蛛误认为是其它昆虫猎物或者某种天敌而对其进行主 动性攻击而排毒。将蜘蛛排在用具上的毒汁收集起来，按常规分离纯化，真空吸脱水分， 冷冻干燥可得到蜘蛛毒干品(CN1209268A)。 2.2 蜘蛛毒液中多肽神经毒素功能及作用机理蜘蛛毒液成分复杂，其中以神经毒素最 重要。根据化学结构神经毒素可以分为 2 类：多肽类神经毒素和多胺类神经毒素。多肽类 神经毒素又可根据分子量的大小分为 2 类：第Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在类是小分子量的多肽，分子量在 10kD 以 下，能与细胞膜上的 Na+，K+，Ca2+等各种离子通道作用；第Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在Ⅱ类是高分子量的多肽类是高分子量的多肽， 如，α-latrotoxinlatrotoxin 毒素，能与突触前膜上的受体连接，促进神经递质的释放。此外，研究 还发现一些蜘蛛毒素有抑菌和选择性癌细胞致死作用，如狼蛛抗菌肽和穴居狼蛛毒。表 1 介绍部分已知多肽神经毒素的来源、功能及作用机理［12～20］。 2.3 蜘蛛毒素在医学上的应用蜘蛛种类繁多，蜘蛛毒液成分丰富，功能多样，蜘蛛毒 液中含有各种与 Na+，K+，Ca2+等各种离子通道作用的成分，由于它们对离子通道的 选择性，蜘蛛毒素在药理学、神经生物学和医学领域已展现出广阔的应用前景。蜘蛛毒素 有着广阔的开发应用前景，国内外正不断开发新的蜘蛛毒素，并探索其应用价值，以早日 造福于人类。表 1 已知多肽神经毒素的来源、功能及作用机理（略） 2.3.1 治疗局部缺血症在大脑局部缺血和缺氧时，细胞外的谷氨酸浓度显著增加，而 一种从黑腹栉足蛛(Phoneutrianigrienler)中分离的多肽毒素—Phoneutriatoxin3-latrotoxin4 能 抑制电压依赖的 Ca2+通道，导致 Ca2+的流入量减少，进一步引起谷氨酸的释放；同时， 它也能抑制突触小体吸收谷氨酸而导致谷氨酸的释放量减少。因此，Tx3-latrotoxin4 可作为研究治 疗局部缺血症的重要工具。 2.3.2 抗原和抗毒蛛毒也具有抗原性，可根据其抗原作用生产出抗毒血清。例如，把 L1reclusa 的毒汁反复注入兔子体内，即会产生抗毒汁损害作用。现存在的抗毒血清主要 有抗 L1reclusa 血清、抗 Loxoscelesreclusa 血清和抗 Atraxrobustus 血清。 2.3.3 神经保护剂毒素 Argiotoxin-latrotoxin636 可以穿过血脑屏障，且对谷氨酸产生反应，尤 其是那些由 NMDA 受体、电压依赖的 Ca2+流和细胞内贮备的 Ca2+释放引起的反应产生 抑制作用，这为治疗或防止严重的突发性发作、癫痫发作和神经变性疾病引起的神经元的 损坏提供了一个特别好的模板。 2.3.4 镇痛药实验证明虎纹捕鸟蛛毒素-latrotoxinI 即虎纹镇痛肽-latrotoxinL（HWAP-latrotoxinI)具有镇痛活性。 近两年来，根据其分子空间结构中的活性部位与美国 FDA 即将批准的新镇痛药 SNX-latrotoxinIII(ω-latrotoxin 芋螺毒素)的活性部位具有极其相似的性质，开展了大量的药效药理学实验。采用生理性及 病理性致痛两种模型，分别用硬膜外和蛛网膜下腔给药的方法在大鼠和兔等动物上进行了 实验。研究结果表明，它具有很强的镇痛活性，镇痛持续时间长于吗啡，并未显示出明显 的毒副作用及成瘾性的良药。以期将该毒素开发成一种用于晚期癌痛病人及手术后病人镇 痛［15］。 2.3.5 抗菌和抗癌作用近来还发现，蜘蛛毒素还具有抗菌和抗癌作用。从蜘蛛毒素中 提取出的抗菌活性肽，对枯草芽孢杆菌(Subtilisbacillus)、短小芽孢杆菌 (Pumilusbacillus)及大肠埃希菌(E1coli)有明显的抑菌作用。而从蜘蛛毒素中提取的抑抗 性多肽，也已证明其对肺癌和鼻咽癌传代细胞的生长抑制作用。当肿瘤侵入组织时，周围 的正常细胞变形，并释放能促进或加速肿瘤生长的生长因子，其中 Ca2+通道可能是正常 细胞释放生长因子的信号，因此阻断该通道可有助于肿瘤的治疗［16］。 2.3.6 对心脑血管系统的作用心房纤颤是一种十分常见的心律失常疾病，一般认为心 脏细胞中的某些 Ca2+，Na+，K+等离子的特殊通道是导致心房纤颤的根源。当病情发 作时，心脏跳动极不规则，因而大大增加了血栓和中风的危险。据调查,美国科学家已从蜘 蛛毒液中提取出抗心律失常药物［17］。 3 蜘蛛丝的研究与应用 蜘蛛吐出的丝是一种骨蛋白，十分精细，坚韧而富有弹性，吐出后遇空气变硬。《本 草纲目》记载，蜘蛛丝能主治健忘失眠等症。用蜘蛛丝生产的蛛网口服液对神经性疾病疗 效显著。 3.1 蜘蛛丝的结构特点蜘蛛丝是具有多级结构的蛋白质纤维，牵引丝具有皮芯层结构， 芯层内含有数十根纳米级的微纤维。蜘蛛丝的基本组成单元为氨基酸，纤维性能受分子的 构象、结晶度、取向度、纤维的形态结构等多种结构因素的综合影响［21］。 3.2 医疗应用事实上，蜘蛛网在民间作为医疗用品已有很长的历史，主要用于伤口的 包扎，这种很细的纤维具有良好的止血作用，有些丝还有杀菌作用。蜘蛛牵引丝有促进伤 口痊愈和凝血的功能，将使其在伤口包覆材料方面获得广泛的应用，如脉管伤口修复材料， 止血敷料、止血片、止血胶和缝合线等。蜘蛛丝无与伦比的韧性也是一种很有价值的性能， 可以减少丝线突然断裂的可能性，同时细度小的蜘蛛丝可以改善缝合线等的使用性能，特 别适合于眼科、神经科等精细的手术。 蜘蛛丝在现代医学和保健方面有广泛用途。由于蜘蛛丝是天然产品,又由蛋白质组成， 和人体有良好的相容性，因而可用作高性能的生物材料，制成伤口封闭材料和生理组织工 程材料，如人工关节、人造肌腱、韧带、假肢、组织修复、神经外科及眼科等手术中的可 降解超细伤口缝线等产品，具有韧性好、可降解等特性。除了伤口包覆材料以外，蜘蛛丝 在永久植入人体的器官以及痊愈后被吸收的器官方面也将会有很大的应用潜力，如韧带和 肌腱的修复移植、动静脉移植以及其他人体器官的替代品（食管、气管、肠、胆管等）、 心脏阀门、整形整容外科手术用材料等［22，23］。 1 化学成分 迄今为止，苦玄参中的化学成分主要集中在葫芦苦素(Cucurbitacin)三萜成分和黄酮 类化合物的研究报道，国内外对苦玄参进行研究，发现其有效成分主要为四环三萜苷类。 三萜成分是苦玄参中最早被报道的一类化学成分，由于它们与葫芦科植物中的苦味素结构 相似，所以也有文献将其称为葫芦苦素(cucurbitacin)［3］。成桂仁等自苦玄参药材中 共分离鉴定了 6 个葫芦苦素类苷元、1 个皂酮、10 个皂苷［4～17］和 3 个黄酮 ［18］。王力生等［19］从苦玄参乙醇提取物的较低极性部位中分离鉴定了 6 个化合物， 即 N-latrotoxinbenzoylphenylalanyl-latrotoxinL-latrotoxinphenylalaninolacetate①，1-latrotoxin羟基-latrotoxin7 羟甲基蒽醌②， 9，16-latrotoxin二羟基-latrotoxin10，12，14-latrotoxin三烯-latrotoxin十八碳酸③，5，7，4''''-latrotoxin三羟基黄酮④，β-latrotoxin谷甾醇⑤和 胡萝卜苷⑥。化合物①～③的 13C-latrotoxinNMR 数据为首次提供。邹节明等［20］用硅胶和 MCI 柱色谱分离纯化，得到 2 个不含呋喃环的葫芦苦素类化合物，分别鉴定为 11，24-latrotoxin二酮-latrotoxin 5，21-latrotoxin二烯葫芦素-latrotoxin3α-latrotoxinO-latrotoxinβ-latrotoxinD-latrotoxin吡喃木糖基-latrotoxin16α-latrotoxinO-latrotoxinα-latrotoxinL-latrotoxin吡喃鼠李糖苷（脱氢拜俄尼苷）和 己降葫芦苦素 F，其中前者为新化合物，后者首次从苦玄参中分离得到。此外，他们还用 采用大孔树脂、硅胶柱色谱纯化得到一个新的三萜皂苷——11，22-latrotoxin三羰基-latrotoxin16α-latrotoxin羟基-latrotoxin (20s，24)-latrotoxin环氧苦味素-latrotoxin5，23-latrotoxin二烯-latrotoxin2β-latrotoxinO-latrotoxinβ-latrotoxinD-latrotoxin吡喃葡糖苷（苦玄参苷 XI）［21］。现 将已从苦玄参中分离鉴定的三萜成分和黄酮类化合物结构整理如下。 1.1 四环三萜类苷及苷元 见表 1～2，图 1～6。表 1 四环三萜类苷及苷元结构式（略）表 2 四环三萜类苷及苷 元结构式（略）表 3 黄酮类化合物结构式（略） 2 定量分析 四环三萜苷类是苦玄参中主要活性成分，苦玄参 IA 和 IB 是其中的主要苷元，药理实 验证明，苦玄参干浸膏有明显的抗炎及镇痛作用［22］。2005 版《中国药典》正文中尚 未收载该品种，但有些以其为原料的中成药如妇炎净胶囊等已收载入《中国药典》（2000 年版及 2005 版）［23］。目前学者对苦玄参质量分析的研究主要集中在对苦玄参药材及 其中成药中苦玄参苷 IA 含量的测定方面。 2.1 高效液相色谱法陈勇等［24］用 RP-latrotoxinHPLC 法，采用 C18ODS2 柱 (5μmm，4.6mm×250mm)，以乙腈-latrotoxin0.3％磷酸(34∶66)为流动相，流速 lml／min，柱温 为 25℃，检测波长为 264nm，对不同产地、不同采收季节苦玄参中苦玄参苷 IA 进行含 量测定。结果显示，苦玄参苷 IA 进样量在 0．42～2．10μmg 的范围内呈良好的线性关系 （r=0.9999），平均回收率为 100.4％，RSD=1.64％(n=6)。实验证明不同产地苦玄 参中苦玄参苷Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 A 的含量不同，苦玄参采收季节不同是影响其含量的一个因素。 邹节明等［25］将超滤技术用于苦玄参等药材有效成分的分离提取，以提取物中有效 成分（苦玄参苷Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 A）的转移率、药液的膜通量和干膏（固体物）降低率 3 个考察指标作 为评价的标准，对苦玄参水提液进行超滤实验，用 HPLC 法测定苦玄参苷 IA 的含量，结果 在超滤前药液中的含量约为 0.28％，而超滤后在药液中能达到 0.22％以上，转移率能够 达到 80％以上，干膏降低率达到了 45％以上，取得了良好的效果。 郑成远等［26］采用 RP-latrotoxinHPLC 法测定湖南张家界、广西梧州、安徽亳州、江西樟树 和河南商丘 5 个产地苦玄参中苦玄参苷 IA 含量，色谱条件为：Kro-latrotoxinmasilC-latrotoxin18 柱 (4.6mm×250mm,5μmm)，柱温 35℃；流动相乙腈-latrotoxin0.5%醋酸=36∶64，流速 1.0ml/ min，检测波长 264nm。结果显示各地苦玄参药材中苦玄参苷Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 A 的含量差异较大，安 徽亳州和江西樟树所产苦玄参药材中苦玄参苷Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 A 的含量较高。 邹节明等［27］以 HPLC 法测定苦玄参苷 IA 的含量为指标，筛选适用的大孔吸附树 脂型号，评价树脂吸附与解吸工艺，结果表明苦玄参提取物精制适用 HPD50 号树脂，吸 附阶段泄漏点和饱和点分别在 1.5 和 l1 左右，解吸阶段的适用乙醇浓度分别为 50%，苦 玄参苷 IA 含量可提高 4 倍以上。 甄汉深等［28］采用 AgilentZORBAXEclipseXDBC8 色谱柱 (4.6mm×150mm，5μmm)，以乙腈-latrotoxin0.5%醋酸(32∶68)为流动相，流速 1ml·min-latrotoxin1，检 测波长 264nm，测定广西两种不同产地种植的苦玄参药材的茎、叶中苦玄参苷Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 A 的含 量。实验结果显示，苦玄参苷Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 A 在 2.28～11.4μmg 范围内线性良好，平均加样回收率为 101.1%，RSD=2.4%(n=5)。两种产地叶中苦玄参苷Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 A 均明显高于茎。 胡慧玲等［29］用 KromasilODS-latrotoxin1HPLC 柱 C18(250mm×4.6mm,5μmm)，以乙 腈-latrotoxin水-latrotoxin冰醋酸(38∶62∶0.5)为流动相，流速 1.0ml/min，柱温 40℃，检测波长 264nm， 对妇炎宁片中的苦玄参苷 IA 进行了含量测定。结果为苦玄参苷 IA 在线性范围为 0.1～ 0.6μmg 范围内线性良好(r=0.9995)，平均回收率为 101.22%，RSD=2.16%(n=5)，10 批样品的平均测定结果为 3.44mg/g。 2.2 薄层扫描法邹节明等［30］采用薄层扫描法测定不同产地苦玄参的根、茎、叶中 苦玄参苷Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 A 和Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 B 的含量，以甲醇为溶媒，超声提取苦玄参各药用部位，提取物经大孔 树脂 D101 精制后，点于含 1%CMC-latrotoxinNa 的硅胶 GF254 板上，以氯仿-latrotoxin甲醇-latrotoxin水(4∶1∶0.1) 为展开剂展开后，用 CAMAGTLCⅢ 型线性扫描仪测定，检测波长为 268nm，狭缝尺寸为 8mm×0．6mm。结果显示，苦玄参苷Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 A 的点样量在 1.1～5.4μmg，苦玄参苷Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 B 在 1.0～6.2μmg 范围内与各自峰面积呈良好的线性关系，r 分别为 0.9990 和 0.9992，加样 回收率分别为 98.3%和 97.5%；在同一产地不同药用部位中，苦玄参苷Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 A 和 IB 的含量： 叶中最高，茎中次之，根中最低；在同一药用部位中，叶中苦玄参苷Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 A 含量高于Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 B， 根和茎中苦玄参苷Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 B 含量高于Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 A。 陈勇［31］采用双波长薄层扫描法分别测定炎肿化毒片、炎见宁片和妇炎净胶囊中苦 玄参苷Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 A 的含量，用 5%CMC-latrotoxinNa 的硅胶 GF254 板，展开剂为氯仿∶甲醇=4∶1，在紫外 灯下（254nm）检视定位，进行光谱扫描，扫描条件为： λS=270nmS=270nm，λS=270nmR=350nm，SX=3，反射式锯齿形扫描。结果表明苦玄参苷Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 A 的点样 量在 2.4～7.2μmg 间呈良好的线性关系，平均加样回收率为 97.9%，RSD=1.8% (n=5)。蒋明廉［32］用同样的方法测定苦玄参中苦玄参苷Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 A 的含量，从测定结果来看， 与成桂仁［12］报道从苦玄参中提取分离苦玄参苷Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 A 和Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 B 的收得率 0.25%和 0.17% 基本一致。 2.3 其他方法王力生等［33］以 TLC 为检测手段，考察 D-latrotoxin101 大孔吸附树脂对苦玄 参总皂苷的吸附和洗脱条件，并采用分光光度法测定提取物中苦玄参皂苷的含量。结果 D-latrotoxin 101 大孔吸附树脂可以把苦玄参总皂苷含量由浸膏中的 8.7%提高至 27.3%，增加 20% 乙醇洗脱操作可进一步提高至 52.1%；苦玄参总皂苷的最大吸收波长为 261nm，与苦玄 参苷Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 A 一致。苦玄参苷Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 A 在 4.56～91.2μmg/ml 与吸光度呈良好的线性关系，平均回 收率为 96.3%。结果表明，D-latrotoxin101 大孔吸附树脂能有效富集并纯化苦玄参总皂苷；分光 光度法测定苦玄参总皂苷含量具有快捷、准确的特点。 3 结语 苦玄参所含化学成分复杂，具有多种生物活性。本文依据皂苷元母核将其归纳分类， 为进一步探讨苦玄参的化学成分和构效关系研究提供了方便和依据。 苦玄参苷 IA 是苦玄参三萜部位中含量最高的成分，在干植物中的含量约为 0.25%［12］，有中枢抑制作用和抗补体作用［3］，是苦玄参的主要活性成分，因此苦 玄参定量分析方面报道最多的是苦玄参苷Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 A 的含量测定，各地苦玄参药材中苦玄参苷 Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 A 的含量差异较大，含量的差异与很多因素有关，与采收的季节也有关系，因此，今后 可对苦玄参的最佳采收期及最适加工方法进行进一步考究。 苦玄参苷Ⅰ类是小分子量的多肽，分子量在 A 的含量测定方法比较发现，薄层扫描法测定含量时易出现斑点不清、拖 尾等现象。高效液相色谱法集分离和测定为一体，简便、稳定、重复性好，易与其他干扰 成分分开，可作为苦玄参质量控制的研究方法。