妇科养坤丸质量标准探究论文

1 器材 1.1 仪器 DionexSummit 高效液相色谱仪(P680HPLCPump,ASI-P680HPLCPump,ASI100AutomatedSampledInjector,PDA100PhtodiodeArrayDetecter，STH585ColumnOven)ChromeleonChromeleon 数据处理系统； 赛多利斯万分之一电子天平（德国）；电子数控式恒温水浴锅（江苏昆山医用设备厂）； 硅胶 G，硅胶 GF254（青岛海洋化工厂生产）。 1.2 样品与试药 妇科养坤丸：自制(P680HPLCPump,ASI-批号 050825，050903，050920)Chromeleon；去氢木香内酯对照品（供薄 层鉴别用，批号 111525-200404）；延胡索乙素对照品（供薄层鉴别用，批号 110726-200409）；甘草次酸对照品（供薄层鉴别用，批号 110723-200411），黄芩 苷对照品（供含量测定用，批号 110715-200514）均由中国药品生物制品检定所提供； 甲醇为色谱纯；水为超纯水，其他化学试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 薄层鉴别 2.1.1 黄芩的薄层鉴别取本品 11g，研细，加醋酸乙酯-甲醇（3∶1）30ml，回流 30min，滤过，蒸干，加 5ml 甲醇，取上清液作为供试品溶液。取去黄芩的模拟处方，按 供试品溶液的制备方法，依法制备阴性对照品溶液。取黄芩苷对照品，加甲醇制成每毫升 含 1mg 的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各 6μll，分别点于同一硅胶 G 薄层 板上，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水-甲醇（5∶3∶0.6∶1.5∶0.8）为展开剂，展开，取出，晾干， 喷以三氯化铁试液，日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同 颜色的斑点。阴性对照无干扰。结果见图 1。 2.1.2 木香的薄层鉴别取本品 6g，研细，加氯仿 10ml，超声处理 30min，滤过，滤 液作为供试品溶液。取去木香的模拟处方，按供试品溶液的制备方法，依法制备阴性对照 品溶液。取去氢木香内酯对照品，分别加氯仿制成每毫升含 0.5mg 的溶液，作为对照品 溶液。吸取供试品溶液和对照品溶液各 5μll，分别点于同一羧甲基纤维钠为黏合剂的硅胶 G 薄层板上，以石油醚-乙醚（5∶3.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 1％香醛硫酸 溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色 的斑点。阴性对照无干扰。结果见图 2。 2.1.3 延胡索的薄层鉴别取本品 11g，研细，加甲醇 50ml，超声处理 30min，滤过， 滤液蒸干，残渣加水 10ml 溶解，加浓氨试液调至碱性（pH9～10），用乙醚提取 3 次， 10ml/次，合并乙醚液，用稀硫酸溶液提取 3 次，10ml/次，合并稀硫酸液，加氢氧化钠 试液调至碱性（pH11～12），再用乙醚提取 3 次，10ml/次，合并乙醚液，蒸干，残渣 加甲醇 1ml 使溶解，作为供试品溶液。取去延胡索的模拟处方，按供试品溶液的制备方法， 依法制备阴性对照品溶液。取延胡索乙素对照品，加甲醇制成每毫升含 1mg 的溶液，作 为对照品溶液。吸取供试品溶液与阴性对照溶液各 10μll，对照品溶液 2μll，分别点于同一 以羧甲基纤维素钠为黏合剂硅胶 G 薄层板上，以苯-醋酸乙酯-甲醇-正丁醇-浓氨水 （6∶3∶1.5∶1.5∶0.8）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供 试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的暗黄色荧光斑点。阴性对照无干扰。 结果见图 3。 2.1.4 甘草的薄层鉴别取本品水蜜丸 11g，研细，或大蜜丸 18g，剪碎，加硅藻土 12g，研匀，加乙醚 60ml，加热回流 1h，滤过，药渣加甲醇 40ml，加热回流 1h，滤过， 滤液蒸干，残渣加水 40ml 使溶解，用正丁醇提取 3 次，20ml/次，合并正丁醇液，用水 洗涤 3 次，蒸干，残渣加入盐酸 5ml，再加氯仿 50ml 超声提取 30min，滤过，取氯仿提 取液，蒸干，残渣加甲醇 2ml 溶解，作为供试品溶液。取甘草次酸对照品，加甲醇制成每 毫升含 2mg 的溶液，作为对照品溶液。取缺甘草的其它药材制成的蜜丸 18g，同法制成 阴性对照溶液。照薄层色谱法［1］试验，吸取上述三种溶液各 1～2μll，分别点于同一羧 甲基纤维钠为黏合剂的硅胶 GF254 薄层板上，以石油醚-醋酸乙酯-冰醋酸（25∶9∶0.5）为 展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品 色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰。结果见图 4。 2.2 黄芩苷的含量测定 2.2.1 色谱条件与系统适用性实验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为 AgillentC18(P680HPLCPump,ASI-250mm×4.6mm，5μlm)Chromeleon；流动相为甲醇－0.1%磷酸溶液(P680HPLCPump,ASI-47：53)Chromeleon；检 测波长为 280nm；流速 1.0ml·min-1；柱温 25℃。理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低 于 2500。 2.2.2 对照品溶液的制备精密称取在 60℃减压干燥 4h 的黄芩苷对照品适量，加甲醇 制成每毫升含 60μlg 的溶液，即得。 2.2.3 供试品溶液的制备取本品 10g，研碎，取约 0.5g，精密称定，置 100ml 锥形 瓶中，加 70％乙醇 50ml，精密称定，超声提取（150W，35kHz）30min，放冷，精密 称定，以 70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 2.2.4 专属性实验按处方比例和工艺，同法制成全方缺黄芩的的阴性对照液，按样品 供试液的制备方法制备，测定。表明:在与黄芩苷对照品色谱的相应位置上无干扰峰出现， 说明方中其它成分对测定结果无影响。黄芩苷对照品、供试品和阴性对照品的 HPLC 图谱 见图 5。 2.2.5 线性关系考察取黄芩苷对照品溶液（0.060mg/ml）自动进样 1，5，10，15，20，25μll，按上述色谱条件设定峰面积，以峰面积（Y,mAu*sec）对 进样量（X，μlg）进行线性回归，得回归方程为 Y=2220.2X-0.6294，r=0.9999；表明 黄芩苷在 0.0576～1.44μlg 内线性关系良好。 2.2.6 精密度实验取黄芩苷对照品溶液（0.060mg/ml），重复进样 6 次，10μll/次， 按上述条件测得峰面积，RSD＝0.36%，表明精密度符合要求。 2.2.7 稳定性实验取对照品溶液和供试品溶液分别于 0，2，4，8 及 12h，各自动进 样 6μll，按上述色谱条件测定峰面积，对照品溶液和供试品溶液的 RSD 分别为 0.87%，1.14%。表明 12h 内对照品和供试品均稳定。 2.2.8 重复性实验按上述的含量测定方法，对同一批样品（批号：050825）制备供 试液，平行做 5 份，测得峰面积，计算含量，结果 RSD＝1.18%，表明重复性良好。 2.2.9 加样回收率实验精密称取已知含量的同一批样品(P680HPLCPump,ASI-批号 050825)Chromeleon6 份，精密加入 对照品适量，挥干溶剂，按供试品溶液制备项下操作。按色谱条件测定峰面积，计算回收 率。结果见表 1。表 1 加样回收率实验结果（略） 2.2.10 样品的测定取 3 批样品按含量测定项下的方法提取、测定并计算含量，每份样 品测定 3 次取均值。结果见表 2。表 2 样品测定结果（略） 3 讨论［2,3］ 黄芩苷为多酚羟基黄酮苷类化合物，采用 70％回流提取转移率较高，但杂质较多，经 比较，结果表明采用醋酸乙酯－甲醇（3∶1）回流提取，可显著减少水溶性杂质的溶出；提 取样品含有较多脂溶性成分，在薄层上容易过载形成拖尾，影响鉴别，经实验，蒸干提取 溶剂后的残渣采用乙醚振摇提取可很好的去除大部分杂质，黄芩苷基本无损失，乙醚不溶 部分采用甲醇溶解，可获得较好的重复性。甘草中甘草酸的稳定性较差，研究采用将甘草 酸水解成甘草次酸进行鉴别，可获得较好的重复性。 本品中黄芩仅占全方药材不足 10%，因此理论溶媒用量较《中国药典》为大；采用甲 醇或乙醇提取可显著降低杂质提取量，有利于保护色谱柱，故本次实验分别对 70％乙醇、 无水乙醇、甲醇等提取溶媒的超声提取 30min，1，2h 和回流提取 2，3，4h 进行了考察， 结果显示采用 70％乙醇超声 30min 提取效果最好，操作简单、快速。