中药抗氧化作用分析论文

1 中药抗氧化作用的可能机理 目前认为中药成分对机体氧化损伤的保护作用主要包括以下几方面: 1.1 直接清除活性氧自由基自由基又叫游离基,活性氧自由基是一些处于激发态的含氧 基团,如超氧阴离子自由基、羟基自由基、烷氧基自由基等。·ＯＨ是化学性质最活泼的活是化学性质最活泼的活 性氧，它带有一个不成对电子，是对人体毒性最大的自由基，它可以与活细胞中的任何分 子发生反应而造成损害，而且反应速度极快。Ｏ-2·是自由基引起机体中毒的主要原因，可 使核酸链断裂、多糖解聚和不饱和脂肪酸过氧化，进而造成膜损伤、线粒体氧化磷酸化等 影响。目前制备超氧阴离子自由基的经典方法是邻苯三酚自氧化法。如陈玫等［3］采用 连苯三酚自氧化法,研究浙贝母、茵陈等 8 种中药不同提取物的抗氧化活性。结果表明,其 中 7 种中药都可抑制连苯三酚自氧化,清除超氧阴离子自由基。 1.2 增强抗氧化酶活性细胞在生命活动过程内不断地产生自由基，机体的抗氧化酶通 过一系列的催化反应将其转化为 O2 和 CO2。细胞中的主要抗氧化酶是超氧化物歧化酶 （SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化氢酶（CAT）。SOD 是含有 Cu，Zn，Mn，Fe 等金属离子，是体内超氧阴离子的主要清除者，将其催化分解为 H2O2，H2O2 也具有氧化损伤作用，通过过氧化氢酶将其转化为 O2 和 H2O。同时 H2O2 也可通过 GSH-Px 的催化和还原型谷胱甘肽（GSH）反应生成 H2O,同时生成还原 型谷胱甘肽［4］。如槲皮素能减少胰岛 β 细胞的氧化损伤，同时还能恢复 Fe2+致肾细胞 损伤动物的 SOD，GSH-Px 和过氧化氢酶的活力［5］。李波等研究表明杨梅素芸香苷对 氧化损伤性原代培养大鼠肝细胞具有明显保护作用，其保护作用机理是直接清除氧自由基， 增加原代培养肝细胞内抗氧化酶 SOD 和 GSH-Px 的活力。 1.3 抗脂质过氧化，维持细胞膜稳定性细胞中自由基对细胞的直接损伤作用主要是攻 击细胞膜上的脂质，自由基先和细胞膜上的磷脂或低密度脂蛋白（LDL）的不饱和脂肪酸 反应，该反应产物又攻击附近的不饱和脂肪酸，最终导致链式反应的产生。过氧化程度多 以其最终产物中丙二醛（MDA）为评价指标［6］。近来有研究认为，部分黄酮类化合物 以氢键形式与细胞膜结合，保护细胞膜上的不饱和键不与自由基接触，抗脂质过氧化 ［7］。 1.4 减少 DNA 损伤自由基学说认为，过剩的自由基可以攻击 DNA，引起 DNA 损伤， 从而引发多种疾病。对中药抗氧化作用的研究目前在某些方面已深入到 DNA 分子水平 ［8］。 1.5 对氧化酶系活力及表达的影响如对黄嘌呤氧化酶（XO）的影响。XO 可将黄嘌呤 催化生成尿酸盐，同时产生超氧阴离子。该过程是缺血/再灌注损伤的一个非常重要的途径。 在机体正常生理状态下，该酶以黄嘌呤脱氢酶形式存在，在机体处于缺血状态时，黄嘌呤 脱氢酶转化为 XO，当缺血组织再灌注时，XO 催化产生超氧阴离子，导致氧化损伤。因此 黄嘌呤氧化酶的含量可作为抗氧化研究的指标成分（2005 浙江大学硕士论文《八种中药 豆类荚果乙醇提取物及所含杨梅树芸香苷抗氧化作用研究》）。 另外,对一氧化氮（NO）及一氧化氮合酶的影响。正常生理状态下，NO 在舒张血管 内皮、维持机体血压平衡方面起重要作用。但高浓度却能和活性氧反应后产生氧化能力更 高的亚硝基自由基，同时 NO 也可看作是一种自由基，导致细胞氧化损伤。在缺血再灌注 损伤时，NO 主要合成酶，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活性增加，大量 NO 产生而导致 氧化损伤形成［9］。研究发现许多黄酮类化合物包括槲皮素、姜黄素在缺血再灌注损伤 时可抑制 iNOS 的活性，而起到抗氧化作用［10］。 2 中药抗氧化活性的评价方法 中药抗氧化活性的评价方法随着科学技术的发展和设备的更新而不断地发展和改变。 一些过程繁琐，准确性不高的评价方法逐渐被淘汰，下面重点介绍一些近年来出现的中药 抗氧化活性评价方法。 2.1 二苯代苦味酰基自由基（DPPH）法 1958 年,Blois 首次将 DPPH 法应用于抗氧化 剂的筛选研究，近年来该方法在抗氧化剂研究中受到普遍重视，它克服了传统方法的一些 缺陷，具有快速、简便、灵敏、易检测和直接可行的优点，被广泛用于抗氧化剂的研究， DPPH 在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其结构中含有 3 个苯环，1 个氮原子上有 1 个 孤对电子，其溶液呈深紫色，在 517nm 有强吸收。有自由基清除剂存在时，DPPH·的单 电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小，而且这种颜色变浅的程度 与配对电子数成化学剂量关系，从而用于评价实验样品的抗氧化能力。该反应必须在避光 条件下进行，另外反应体系的 pH 值应调至 7.4 左右，最好在缓冲液体系中进行。柳艳等 ［11］利用自由基反应模型观察丹酚酸 B 对 DPPH 自由基的淬灭效应，并结合高效液相色 谱(HPLC)HPLC)技术分别研究温度和 pH 值对丹酚酸 B 清除 DPPH 能力的影响。为丹酚酸 B 抗氧 化能力的另一作用途径及其影响因素的研究提供依据。胡博路等［12］采用 DPPH 法测定 30 种中草药乙醇提取液中的抗氧化活性。结果表明五倍子、诃子、大黄、槐花米等 9 种中 药具有很强的抗氧化活性。康文艺等［13］采用 DPPH 自由基体系对茜草提取部位进行抗 氧化筛选。结果从有活性的氯仿部位分离得到 11 个化合物,其中 3 个化合物具有抗氧化活 性。 2.2 硫代巴比妥酸（TBA）法 TBA 法是测量脂肪酸，细胞膜和生物组织脂质过氧化的 最古老也是应用最多的方法，它还是最容易应用于粗提生物体系的方法，氧化的油脂多生 成丙二醛，一分子的丙二醛可同两分子的硫代巴比妥酸（TBA）作用生成有色化合物，该 有色化合物在吸光度 530nm 左右有吸收。因此，可通过测定丙二醛的量来评价油脂的氧 化程度。夏晓凯等［14］通过 TBA 法测定大鼠肝匀浆自发和诱导的脂质过氧化产物 MDA 含量，研究黄精多糖(HPLC)PSP)体外抗氧化作用。邓胜国等［15］采用ＴＢＡ法测定和评价荷法测定和评价荷 叶黄酮的抗氧化效果。结果表明荷叶黄酮具有良好的清除自由基能力，能有效抑制亚油酸 的氧化。 2.3Fe3+还原/抗氧化能力（FRAP）法 FRAP 法原理为在较低 p Ｈ是化学性质最活泼的活环境下，Fe3+－ 三吡啶三吖嗪（tripyridyl-triazine,TPTZ）可被样品中还原物质还原为二价铁形式，呈现 出蓝色，并于吸光度 593nm 处具有最大光吸收，根据吸光度大小计算样品抗氧化活性强 弱［16］。吴青等［17］采用 Folin-Ciocalteu 方法测定 15 种中草药不同提取物总酚含 量；用ＤＰＰＨ是化学性质最活泼的活和ＦＲＡ法测定和评价荷Ｐ法评估了不同提取物的抗氧化活性。结果表明大花紫薇叶的抗 氧化活性最高，其甲醇提取物中酚类物质的含量最高。李云峰等(HPLC)2004 军事医学科学院博 士论文《石榴皮抗氧化物质提取及其抗氧化抗动脉粥样硬化作用研究》）以 FRAP 值为评 价指标，按正交设计原则，确定了石榴皮抗氧化物质提取的最佳溶剂和提取条件。另采用 细胞培养的方法研究石榴皮提取物抗氧化能力，结果显示石榴皮提取物能够提高氧化损伤 VEC(HPLC)Ox-LDL,诱导)的细胞活力，提高细胞抗氧化防御功能。 2.4 生物化学发光法清除氧自由基能力评价生物化学发光法测定氧自由基清除作用时， 一定浓度范围内发光强度(HPLC)CL)与氧自由基数量呈量效关系。清除氧自由基的物质则可以降 低 CL，根据 CL 的下降则可以判断某物质清除氧自由基的能力［18］。流动注射化学发光 技术是一种简单、快速和灵敏度高的方法，可对药物和植物性食物中活性成分含量及抗氧 化性进行测定。刘泽敏等［19］采用反相流动注射化学发光法研究了旱芹、西芹的抗氧化 性。实验结果表明旱芹和西芹提取液均能有效抑制超氧自由基诱导的鲁米诺化学发光，并 随着发光体系中提取液浓度的增大，发光强度呈现下降趋势，且具有较强的抗氧化性，并 对旱芹和西芹抗氧化性能进行了比较。吴拥军等［20］采用 Lumino-Ｈ是化学性质最活泼的活 2 Ｏ 2-Ｃｕ 2+化 学发光法测定巴戟天提取液的抗氧化活性,同时采用分光光度法分别测定了其对超氧阴离子 自由基和羟基自由基的抑制率。该方法灵敏度高、快速测定、操作简单和重复性好,因此可 用于抗自由基活性药物的筛选。 3 讨论 由于生物抗氧化剂在体内外的作用非常复杂，尽管一种抗氧化剂在某一种抗氧化体系 中抗氧化效果好，但在另一种体系中效果不一定好，故应该建立一套多方案评价体系来评 价中药的抗氧化能力，因此中药抗氧化作用研究还有大量工作要完成。 【摘要】综述了中药抗氧化作用的可能机理和中药抗氧化作用的评价方法；重点介绍 了二苯代苦味酰基自由基(HPLC)DPPH)法、硫代巴比妥酸（TBA）法、Fe3+还原/抗氧化能力 （FRAP）法和生物化学发光法 4 种目前常用的中药抗氧化作用评价方法及采用这些方法 所取得的研究结果。 【关键词】中药；抗氧化作用；机理；评价方法 1 中药抗氧化作用的可能机理 目前认为中药成分对机体氧化损伤的保护作用主要包括以下几方面: 1.1 直接清除活性氧自由基自由基又叫游离基,活性氧自由基是一些处于激发态的含氧 基团,如超氧阴离子自由基、羟基自由基、烷氧基自由基等。·ＯＨ是化学性质最活泼的活是化学性质最活泼的活 性氧，它带有一个不成对电子，是对人体毒性最大的自由基，它可以与活细胞中的任何分 子发生反应而造成损害，而且反应速度极快。Ｏ-2·是自由基引起机体中毒的主要原因，可 使核酸链断裂、多糖解聚和不饱和脂肪酸过氧化，进而造成膜损伤、线粒体氧化磷酸化等 影响。目前制备超氧阴离子自由基的经典方法是邻苯三酚自氧化法。如陈玫等［3］采用 连苯三酚自氧化法,研究浙贝母、茵陈等 8 种中药不同提取物的抗氧化活性。结果表明,其 中 7 种中药都可抑制连苯三酚自氧化,清除超氧阴离子自由基。 1.2 增强抗氧化酶活性细胞在生命活动过程内不断地产生自由基，机体的抗氧化酶通 过一系列的催化反应将其转化为 O2 和 CO2。细胞中的主要抗氧化酶是超氧化物歧化酶 （SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化氢酶（CAT）。SOD 是含有 Cu，Zn，Mn，Fe 等金属离子，是体内超氧阴离子的主要清除者，将其催化分解为 H2O2，H2O2 也具有氧化损伤作用，通过过氧化氢酶将其转化为 O2 和 H2O。同时 H2O2 也可通过 GSH-Px 的催化和还原型谷胱甘肽（GSH）反应生成 H2O,同时生成还原 型谷胱甘肽［4］。如槲皮素能减少胰岛 β 细胞的氧化损伤，同时还能恢复 Fe2+致肾细胞 损伤动物的 SOD，GSH-Px 和过氧化氢酶的活力［5］。李波等研究表明杨梅素芸香苷对 氧化损伤性原代培养大鼠肝细胞具有明显保护作用，其保护作用机理是直接清除氧自由基， 增加原代培养肝细胞内抗氧化酶 SOD 和 GSH-Px 的活力。 1.3 抗脂质过氧化，维持细胞膜稳定性细胞中自由基对细胞的直接损伤作用主要是攻 击细胞膜上的脂质，自由基先和细胞膜上的磷脂或低密度脂蛋白（LDL）的不饱和脂肪酸 反应，该反应产物又攻击附近的不饱和脂肪酸，最终导致链式反应的产生。过氧化程度多 以其最终产物中丙二醛（MDA）为评价指标［6］。近来有研究认为，部分黄酮类化合物 以氢键形式与细胞膜结合，保护细胞膜上的不饱和键不与自由基接触，抗脂质过氧化 ［7］。 1.4 减少 DNA 损伤自由基学说认为，过剩的自由基可以攻击 DNA，引起 DNA 损伤， 从而引发多种疾病。对中药抗氧化作用的研究目前在某些方面已深入到 DNA 分子水平 ［8］。 1.5 对氧化酶系活力及表达的影响如对黄嘌呤氧化酶（XO）的影响。XO 可将黄嘌呤 催化生成尿酸盐，同时产生超氧阴离子。该过程是缺血/再灌注损伤的一个非常重要的途径。 在机体正常生理状态下，该酶以黄嘌呤脱氢酶形式存在，在机体处于缺血状态时，黄嘌呤 脱氢酶转化为 XO，当缺血组织再灌注时，XO 催化产生超氧阴离子，导致氧化损伤。因此 黄嘌呤氧化酶的含量可作为抗氧化研究的指标成分（2005 浙江大学硕士论文《八种中药 豆类荚果乙醇提取物及所含杨梅树芸香苷抗氧化作用研究》）。 另外,对一氧化氮（NO）及一氧化氮合酶的影响。正常生理状态下，NO 在舒张血管 内皮、维持机体血压平衡方面起重要作用。但高浓度却能和活性氧反应后产生氧化能力更 高的亚硝基自由基，同时 NO 也可看作是一种自由基，导致细胞氧化损伤。在缺血再灌注 损伤时，NO 主要合成酶，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活性增加，大量 NO 产生而导致 氧化损伤形成［9］。研究发现许多黄酮类化合物包括槲皮素、姜黄素在缺血再灌注损伤 时可抑制 iNOS 的活性，而起到抗氧化作用［10］。 2 中药抗氧化活性的评价方法 中药抗氧化活性的评价方法随着科学技术的发展和设备的更新而不断地发展和改变。 一些过程繁琐，准确性不高的评价方法逐渐被淘汰，下面重点介绍一些近年来出现的中药 抗氧化活性评价方法。 2.1 二苯代苦味酰基自由基（DPPH）法 1958 年,Blois 首次将 DPPH 法应用于抗氧化 剂的筛选研究，近年来该方法在抗氧化剂研究中受到普遍重视，它克服了传统方法的一些 缺陷，具有快速、简便、灵敏、易检测和直接可行的优点，被广泛用于抗氧化剂的研究， DPPH 在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其结构中含有 3 个苯环，1 个氮原子上有 1 个 孤对电子，其溶液呈深紫色，在 517nm 有强吸收。有自由基清除剂存在时，DPPH·的单 电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小，而且这种颜色变浅的程度 与配对电子数成化学剂量关系，从而用于评价实验样品的抗氧化能力。该反应必须在避光 条件下进行，另外反应体系的 pH 值应调至 7.4 左右，最好在缓冲液体系中进行。柳艳等 ［11］利用自由基反应模型观察丹酚酸 B 对 DPPH 自由基的淬灭效应，并结合高效液相色 谱(HPLC)HPLC)技术分别研究温度和 pH 值对丹酚酸 B 清除 DPPH 能力的影响。为丹酚酸 B 抗氧 化能力的另一作用途径及其影响因素的研究提供依据。胡博路等［12］采用 DPPH 法测定 30 种中草药乙醇提取液中的抗氧化活性。结果表明五倍子、诃子、大黄、槐花米等 9 种中 药具有很强的抗氧化活性。康文艺等［13］采用 DPPH 自由基体系对茜草提取部位进行抗 氧化筛选。结果从有活性的氯仿部位分离得到 11 个化合物,其中 3 个化合物具有抗氧化活 性。 2.2 硫代巴比妥酸（TBA）法 TBA 法是测量脂肪酸，细胞膜和生物组织脂质过氧化的 最古老也是应用最多的方法，它还是最容易应用于粗提生物体系的方法，氧化的油脂多生 成丙二醛，一分子的丙二醛可同两分子的硫代巴比妥酸（TBA）作用生成有色化合物，该 有色化合物在吸光度 530nm 左右有吸收。因此，可通过测定丙二醛的量来评价油脂的氧 化程度。夏晓凯等［14］通过 TBA 法测定大鼠肝匀浆自发和诱导的脂质过氧化产物 MDA 含量，研究黄精多糖(HPLC)PSP)体外抗氧化作用。邓胜国等［15］采用ＴＢＡ法测定和评价荷法测定和评价荷 叶黄酮的抗氧化效果。结果表明荷叶黄酮具有良好的清除自由基能力，能有效抑制亚油酸 的氧化。 2.3Fe3+还原/抗氧化能力（FRAP）法 FRAP 法原理为在较低 p Ｈ是化学性质最活泼的活环境下，Fe3+－ 三吡啶三吖嗪（tripyridyl-triazine,TPTZ）可被样品中还原物质还原为二价铁形式，呈现 出蓝色，并于吸光度 593nm 处具有最大光吸收，根据吸光度大小计算样品抗氧化活性强 弱［16］。吴青等［17］采用 Folin-Ciocalteu 方法测定 15 种中草药不同提取物总酚含 量；用ＤＰＰＨ是化学性质最活泼的活和ＦＲＡ法测定和评价荷Ｐ法评估了不同提取物的抗氧化活性。结果表明大花紫薇叶的抗 氧化活性最高，其甲醇提取物中酚类物质的含量最高。李云峰等(HPLC)2004 军事医学科学院博 士论文《石榴皮抗氧化物质提取及其抗氧化抗动脉粥样硬化作用研究》）以 FRAP 值为评 价指标，按正交设计原则，确定了石榴皮抗氧化物质提取的最佳溶剂和提取条件。另采用 细胞培养的方法研究石榴皮提取物抗氧化能力，结果显示石榴皮提取物能够提高氧化损伤 VEC(HPLC)Ox-LDL,诱导)的细胞活力，提高细胞抗氧化防御功能。 2.4 生物化学发光法清除氧自由基能力评价生物化学发光法测定氧自由基清除作用时， 一定浓度范围内发光强度(HPLC)CL)与氧自由基数量呈量效关系。清除氧自由基的物质则可以降 低 CL，根据 CL 的下降则可以判断某物质清除氧自由基的能力［18］。流动注射化学发光 技术是一种简单、快速和灵敏度高的方法，可对药物和植物性食物中活性成分含量及抗氧 化性进行测定。刘泽敏等［19］采用反相流动注射化学发光法研究了旱芹、西芹的抗氧化 性。实验结果表明旱芹和西芹提取液均能有效抑制超氧自由基诱导的鲁米诺化学发光，并 随着发光体系中提取液浓度的增大，发光强度呈现下降趋势，且具有较强的抗氧化性，并 对旱芹和西芹抗氧化性能进行了比较。吴拥军等［20］采用 Lumino-Ｈ是化学性质最活泼的活 2 Ｏ 2-Ｃｕ 2+化 学发光法测定巴戟天提取液的抗氧化活性,同时采用分光光度法分别测定了其对超氧阴离子 自由基和羟基自由基的抑制率。该方法灵敏度高、快速测定、操作简单和重复性好,因此可 用于抗自由基活性药物的筛选。 3 讨论 由于生物抗氧化剂在体内外的作用非常复杂，尽管一种抗氧化剂在某一种抗氧化体系 中抗氧化效果好，但在另一种体系中效果不一定好，故应该建立一套多方案评价体系来评 价中药的抗氧化能力，因此中药抗氧化作用研究还有大量工作要完成。 【摘要】综述了中药抗氧化作用的可能机理和中药抗氧化作用的评价方法；重点介绍 了二苯代苦味酰基自由基(HPLC)DPPH)法、硫代巴比妥酸（TBA）法、Fe3+还原/抗氧化能力 （FRAP）法和生物化学发光法 4 种目前常用的中药抗氧化作用评价方法及采用这些方法 所取得的研究结果。 【关键词】中药；抗氧化作用；机理；评价方法