深海微生物研究论文

【关键词】深海微生物；,,研究；,,开发 摘要：深海微生物是地球生物系统的重要组成部分，深海微生物由于其在生态、资源、 环境等方面的重要性，越来越受到人们的重视。本文对深海微生物研究开发的历史和进展 进行概述。 关键词：深海微生物；研究；开发 Researchanddevelopmentofdeepseamicrobes ABSTRACTDeepseamicrobesaretheimportantcomponentsofearthbiological system.Deepseamicrobeshavereceivedmoreandmoreintensiveattentionastheir importanceintheresearchandapplicationinecology,resources,environments,and soon.Inthisstudy,thehistoryandmainachievementsindeepseamicrobialresearch anddevelopmentswerebrieflyintroduced. KEYWORDSDeepseamicrobes;Research;Development 深海的概念通常指 1000 米以下的海洋，占到海洋总面积的 3/4，而其中深海沉积物 覆盖了地球表层的 50%以上。深海及深海沉积物中的微生物生存面临高压，低温或高温、 黑暗及低营养水平等几个主要极端环境，长期以来一直被认为是一片“荒芜的沙漠”。20 世 纪中期，深海测量技术发现深海洋底也有高山峻岭，全世界有 8 万公里长的山脊蜿蜒在各 个大洋，大洋中山脊的发现使人们认识到海洋环境与陆地环境的统一性。1977 年美国“阿 尔文”号深潜器最早在太平洋上的加拉帕戈斯群岛附近 2500 米的深海热液区发现了完全不 依赖于光合作用而独立生存的独立生命体系。位于生命体系金字塔底部的是微生物，能直 接利用深海火山口喷出的硫化物、氮化物、甲烷等低分子化合物作为食物和能源，合成各 种生物大分子如蛋白质、糖等。位于金字塔上部的是一些大型生物包括长管虫、蠕虫、蛤 类、贻贝类，还有蟹类、水母、藤壶等特殊的生物群落。有人将这样五彩缤纷、生机勃勃 的海底生物世界称为海底“生命绿洲”。目前已经有几十个深海热液区生物体系被研究，这 种依靠地球内源能量支持，在深海黑暗和高温的环境下，通过化合作用生产有机质的“黑暗 食物链”的发现使人类对深海环境以及生物圈有了更进一步的了解。在目前已发现的各种极 端环境中深海蕴藏着的生物资源极为丰富，其中最主要的是深海微生物，但这些微生物大 部分还鲜为人知。深海环境下极端微生物的研究不仅是目前生命科学最前沿的领域之一， 也是海底深部生物圈研究和海底流体活动研究重要的组成部分。该项研究将回答生命起源、 生物进化、外太空生命探索等生命科学的重大问题并带动包括 21 世纪地球科学内的其它 学科领域的重大发展。2001 年美国国家科学基金(NSF)NSF))在其题为 “OceanScienceattheNewMillenium”的科学发展展望报告中，将海底流体活动研究列 为海洋科学今后十年最重要、最有可能取得重大突破和科学发现的前沿研究方向之一，生 命科学与海底地球物理、地球化学等在上述研究中将占据重要地位。于 2003 年 10 月份 开始的整合大洋钻探计划(NSF)IODP))将深部生物圈和洋底、海底列为该计划中三大科学课题之 一。深海深部生物圈的发现是对“生物圈”广泛范围的进一步了解。虽然海底采集沉积柱状 样已经有近 80 年的历史，大规模的系统研究开始于 1968 年的深海钻探计划。“深海钻探 (NSF)DSDP)，1968～1983)”、“大洋钻探(NSF)ODP)，1985～2003)”和“综合大洋钻探 (NSF)IODP)，2003～至今)”等深海研究的三部曲，是国际地球科学历时最长、规模最大，也是 成绩最为突出的合作研究计划。大洋钻探计划 ODP) 以独特的视角为我们呈现出另外一个 生命世界――掩埋在洋底沉积物中和地壳中的生物圈。在数千米深海海底存在着由微小的 原核生物组成，数量极大的生物群，有人估计其生物量相当全球地表生物总量的 1/10。与 热液口“自养”的微生物不同，深部生物圈的原核生物依靠地层里的有机物实行“异养”。深海 大洋中生物圈的发现，让人类认识到地球生态系统的真正基础在于原核生物。正是这些原 核生物多种多样的新陈代谢过程，产生了多种多样生物地球化学效果，在此基础上建立了 地球的生态系统。微生物总是出现在它们能够生存的一切物理、化学、地质环境中，这似 乎是一条基本规律。那些在极端环境中生长并通常需要这种极端环境正常生长的微生物被 统称为极端微生物。极端环境涵盖了物理极端环境(NSF)如温度、辐射、压力、磁场、空间、时 间等)、化学极端(NSF)如干燥、盐度、酸碱度、重金属浓度、氧化还原电位等)和生物极端(NSF)如 营养、种群密度、生物链因素等)，海底被认为是上述极端环境中的极端。在深海环境中广 泛存在着嗜酸(NSF)pH3 以下)、嗜碱(NSF)pH10 以上)、嗜盐(NSF)25mol/L 以上)、嗜冷(NSF)可达 0℃以下)、 嗜热(NSF)120℃以上)、嗜压(NSF)500 大气压以上)微生物。深海环境下极端生物特征的研究也为 生命极限的研究提供了良好的生物材料并对外太空生命探索不断提供新的线索和依据。科 学家们设想：既然在如此严酷的极端环境下微生物还能很好地生存，那么在火星上也会有 生命存在。深海微生物学的建立应该追溯到上世纪 70 年代，美国 Scripps 海洋研究所 Yayanos 教授设计、改进高压培养罐并于 1979 年首先分离出深海嗜压菌，1989 年 Bartlett 首先分离出压力调控的外膜蛋白(NSF)OmpH)。1990 年日本三菱重工和三洋公司开 始为日本海洋科学技术中心研制深海微生物高温/高压培养系统，1994 年才完成，耗资七 亿五千万日元。该系统的建设和深潜、采样系统的建设极大地推动了深海生物圈的研究进 步。1995 年 Kato 等分析了一个压力调控基因簇，1999 年 Nogi 等从马里亚纳海沟分离、 鉴定出极端嗜压菌 Moritellayayanosii［1～3］；2003 年日本、美国和意大利相继展开 了深海嗜压菌 ShewanellaviolaceaDSS12 和 P)hotobacteriumprofundumSS9 全基因 组测序［4，5］；2005 年 3 月 P).profundumSS9 全基因组序列及初步分析在 Science 上发表［6，7］。除了巨大的科学研究价值，深海微生物研究还具有极大的经济、社会价 值而引起广泛的关注。深海生物处于独特的物理、化学和生态环境中，在高静水压、剧变 的温度梯度、极微弱的光照条件和高浓度的有毒物质包围下，它们形成了极为特殊的生物 结构、代谢机制系统。由于这种极端的环境，深海生物体内的各种活性物质，特别是酶， 具有高度的温度耐受性，高度的耐酸碱性、耐盐性及很强的抗毒能力。这些特殊的生物活 性物质是深海生物资源中最具应用价值的部分。除了发展、改进海洋微生物的分离培养方 法获得新的海洋微生物，筛选活性物质外，应用基因组学研究方法，构建海洋微生物基因 组文库，通过研究，操作海洋微生物遗传基因，来获得新的海洋微生物活性物质，这是探 索海洋特别是深海微生物资源，研究开发海洋新药物的必然而有效的选择，也是目前深海 微生物资源开发的热点。概括来说，深海生物在以下几个方面具有潜在的应用价值： 1 工业应用 工业生产常常要求一些特殊的反应温度、酸碱度并加入一些有机溶剂，在这种条件下， 普通酶无法保持活性，因此，依赖酶的工业必须花费大量资金采取特殊的工艺以保持这些 酶的活性，从而大大提高了成本，而极端酶在普通酶失活的条件下仍然能保持较高的活性， 所以在工业上有着广泛的的应用前景。目前已经有高温聚合酶、糖酶、淀粉酶、蛋白酶等 几种极端酶开始工业化生产，并且已经创造了数十亿美元的经济效益。 2 医药应用 从生物体内研制药物治疗人类的各种疾病由来已久。由于越来越多的病原菌或病毒对 目前的药物产生了抗药性，并且不断产生新的疾病。因此从海洋中筛选新的生物药物成为 海洋药物研究开发的方向。深海生物由于环境的独特性而成为新型特效药物、抗肿瘤、抗 病毒、降压降脂等药物的来源。目前国际上在深海药物的筛选方面还未见太多报道，但是 可以预料它的前景将是十分广阔的。 3 环境保护 在海底，由于动物尸体聚集、火山喷发等原因造成有毒物质及硫化物等对陆地生物有 害物质的浓度较高，而生存在这里的微生物能分解这些物质并以其为能源繁衍生息，因此， 这些生物在清除地球表面的重金属、石油等污染物方面具有重要的应用价值。目前日本科 学家已经从深海中筛选到具有较高的石油分解能力的菌株，并已开展了应用研究。从 20 世纪后期开始，随着深海技术能力的提高，越来越多的国家投身于深海研究的前沿领域。 目前的深海载人潜器下潜深度达到 6500m，无人缆控潜器 ROV 则可达到 11000m 水深， 并获得最深处马里亚纳海沟深海沉积物样本，研究发现其微生物含量达到 103～104/g 的 水平。实验室深海环境模拟也取得突破进展，已分离鉴定出嗜压、嗜碱、嗜酸、嗜盐、嗜 冷、嗜热等极端微生物。目前国际上进行深海微生物研究的国家主要分布在欧洲，美洲及 亚洲，其中美国、日本、德国和法国都是深海微生物研究的主力军。目前，在深海微生物 的分离培养、多样性调查、功能基因研究和适应性机制研究(NSF)如深海嗜压菌的嗜压机制)等 方面取得了一定的进展；各类极端微生物在工业用酶、工具酶、环境修复以及生物活性物 质等方面的开发应用也有了突破，使人们看到了深海微生物开发的巨大潜力和广阔的应用 前景。深海生物资源尤其是微生物资源越来越得到人类的重视。随着科学的发展进步，水 下工程技术和探测技术的改进和完善，人类对深海微生物的研究和开发有了更大的空间和 可能性。我国深海生物基因的系统研究起步时间较晚，从本世纪初开始主要得到了国家科 技部和中国大洋专项的资助。中国大洋协会依托国家海洋局第三海洋研究所成立了中国大 洋生物基因研究开发基地，研制、配备了一批船载和实验室深海微生物培养专用设备。在 深海设备的支持下，真正意义的深海微生物研究得以开展。到目前为止，基础研究主要开 展了深海微生物在物质循环中的作用；极端微生物分离、培养；微生物遗传、代谢研究， 深海极端环境下微生物适应性机理的研究等。成功分离、鉴定出各类深海嗜压、嗜热、嗜 冷、嗜盐、嗜碱、嗜酸微生物，从中发现了多个未经报道的新种。以此为基础，正在建设 国内第一个深海微生物菌株资源库。克隆了多种深海极端酶基因，进行了基因表达和分析。 深海微生物抗菌、抗肿瘤活性物质筛选工作也已经开展。深海耐压菌 ShewanellacomraWP)3 已基本完成全基因组序列测定，正在开展后基因组研究。开展了 深海沉积物宏基因组文库的构建，成功构建了一个深海 5000 米水深沉积物的 cosmid 基 因文库，通过对克隆子的分析发现文库中微生物来源主要是一些不可培养的微生物新种， 部分克隆子序列测定发现克隆子上大部分基因是新基因。目前已筛选到多个能表达生物活 性物质的克隆子，正在进行序列测定。总之，深海生物研究是一个依赖于工程技术的高投 入项目，我国深海生物基因资源开发利用研究的快速发展还需要更多资金和人才的不断投 入。 【关键词】头孢菌素类抗生素；,,母核；,,结构修饰；,,研发思路 摘要：本文阐明了头孢菌素类抗生素其母核来源为 7ACA，7ADCA，GCLE；并对其 C2，C3，C7 结构修饰方法进行了综述。针对我国走仿创结合的产品研发思路提出了建议。 关键词：头孢菌素类抗生素；母核；结构修饰；研发思路 Studyonthedevelopmentandcurrentproductionstatusofthecephalosporins 1 世界范围内已开发头孢菌素类品种分析 1.1 头孢菌素类已开发品种所指范围 R1：H、Na 或与 COOH 形成酯的相关的化合物； R2：H、OCH3、CH2R5； R3：为改变本类化合物所引入的侧链； R4：H、OCH3； A：巯基杂环、氮杂环、含稠环及其他 图 1 头孢菌素类的基本结构（略） 基本构效关系：R1：注射用药改造为口服用药。头孢呋辛头孢呋辛酯，头孢替安头孢 替安酯。R2：扩大抗菌谱，增强抗菌活性，改变药物通透性，影响药动学性质，克服其不 稳定性。R3：扩大抗菌谱，增强抗菌活性，对酶稳定。R4：增强对酶的稳定性。 1.2 临床应用已开发品种的分类自 1964 年，美国 E.Lilly 开发成功头孢噻吩以来，四 十年间，世界范围内已上市品种多达 50 余种，他们分属于第一代～第四代。第一代头孢 噻吩(NSF)注射)、头孢噻啶(NSF)注射)、头孢来星(NSF)口服)、头孢氨苄(NSF)口服)、头孢唑林(NSF)注射)、头孢 拉定(NSF)口服、注射)、头孢匹林(NSF)注射)、头孢乙腈(NSF)注射)、头孢羟氨苄(NSF)口服)、头孢替唑(NSF)注 射)、pivcefalexinausocef(NSF)口服)、头孢西酮(NSF)注射)、头孢沙定(NSF)口服)、头孢硫脒(NSF)注射)； 口服 6 种，注射 9 种。第二代头孢孟多(NSF)注射)、头孢呋辛(NSF)注射)、头孢呋辛酯(NSF)口服)、头孢 西丁(NSF)注射)、头孢克洛(NSF)口服)、头孢曲嗪(NSF)口服)、头孢美唑(NSF)注射)、头孢替安(NSF)注射)、头孢 替安酯(NSF)口服)、头孢磺啶(NSF)注射)、头孢替坦(NSF)注射)、头孢雷特(NSF)注射)、头孢尼西(NSF)注射)、头 孢普罗(NSF)口服)；口服 5 种，注射 9 种。第三代头孢噻肟(NSF)注射)、头孢哌酮(NSF)注射)、头孢曲松 (NSF)注射)、头孢甲肟(NSF)注射)、头孢唑肟(NSF)注射)、头孢他定(NSF)注射)、头孢匹胺(NSF)注射)、头孢拉宗 (NSF)注射)、头孢咪唑(NSF)注射)、头孢克肟(NSF)口服)、头孢米诺(NSF)注射)、头孢特仑酯(NSF)口服)、头孢泊 肟酯(NSF)口服)、头孢地嗪(NSF)注射)、头孢地尼(NSF)口服)、头孢唑南(NSF)注射)、头孢他美酯(NSF)口服)、头 孢卡品酯(NSF)口服)、头孢妥仑酯(NSF)口服)、头孢布烯(NSF)口服)；口服 8 种，注射 12 种。第四代头 孢吡肟(NSF)注射)、头孢匹罗(NSF)注射)、头孢噻利(NSF)注射)、头孢唑南(NSF)注射)、头孢克定(NSF)注射)；全 为注射。此外，非典型头孢菌素类品种有氟氧头孢、拉氧头孢、氨曲南和卡芦莫南，均属 第三代注射品种。 1.3 国外开发品种给我们的启示通过上述品种介绍，可以得到以下认识：(NSF)1)第一代头 孢菌素类以 7ACA、7ADCA 为母核，C7 位改造多以 α 氨基苯乙酸为主；C3 位有少数改 造，即吡啶及衍生物或巯基噻二唑及巯基三氮唑或以甲氧基取代；C2 位以 H 为主，少数 成钠盐，个别成酯。未形成系统的改造思路，品种为窄谱，不耐酶。第二代头孢菌素品种 在母核上引入 GCLE；C7 位伯胺改造外，同时还引入甲氧基。仍未形成系统的改造思路， 品种抗菌谱增宽，耐酶性有所提高。在第一、二代基础上，第三代头孢菌素品种 C7 位改 造上引入 2(NSF)2 氨基 4 噻唑基)乙酰基，且在乙酸的 α 位上进行多种尝试，以(NSF)Z)2(2)2(NSF)2 氨基 4 噻唑基)2(NSF)甲氧亚胺)乙酰基最成功，进而衍生到相关化合物，如图 2 表示，而 C3 位的改 造仅起互补的作用。因而品种发展到广谱、高效耐酶的水平。进入 20 世纪 90 年代后，第 四代头孢菌素发展快，已上市三、四个品种均为 C7 引入氨噻肟侧链后，对 C3 位直接引入 含氮杂环或含氮稠环，如 N 甲基吡咯烷酮、2，3 环戊烯吡啶等，由于 C3 位引入含正电荷 的季胺基团，增加了药物对细胞膜的穿透力，因此显示出比第三代头孢菌素更强的活性。 由此启示药物工作者，是否在 C7、C3 的改造上运用由第三代、第四代结构改造的成功之 处，以研发更有效的新品种。 图 2 第三代头孢菌素侧链变化（略） 2 国内头孢菌素类品种研究开发现状 2.1 国内研究开发以仿制为主我国自 20 世纪 70 年代起开始研发头孢菌素类品种，目 前仍以品种的仿制研发为主，在仿制研发中，至多只是一些工艺上的改进和创新，对产品 的精细研究仍然较少。 2.2 国内创新研究天发成功品种头孢硫脒在仿制过程中，上海医药工业研究院研制成 功头孢硫脒。据发表的临床引用文章显示，分别用头孢唑林(NSF)一代)、头孢呋辛(NSF)二代)、头 孢噻肟(NSF)三代)作对照，头孢硫脒的临床疗效分别优于头孢唑林［1］、头孢呋辛［2］，与 头孢噻肟［3］相近。 3 头孢菌素类品种的主要母核 3.1 由青霉素扩环得到 7ADCA7ADCA 所制备的头孢菌素类品种有 C3 位未改造品种， 第一代到第三代加头孢氨苄、头孢他美酯等。青霉素出路之一是精加工生产 6AP)A、7ADCA，2002 年一季度国内生产 7ADCA 即达 210 吨以上。 3.2 由头孢菌素 C 裂解制备 7ACA 以 7ACA 为母核所制备的头孢菌素类品种占绝大多 数，如：头孢噻吩、头孢呋辛、头孢曲松、头孢吡肟等。近几年国内的 7ACA 已得到长足 发展，已能满足大量出口，2005 年一季度即生产 620 吨(NSF)医药经济报，2005629)。但头 孢菌素 C 裂解后的产物，应综合利用，其中的去乙酰 7ACA 是某些头孢菌素类品种的重要 中间体，如制备头孢呋辛中 C3 位即要去乙酰基。 3.3 由青霉素 G 钾盐制备 GCLE(NSF)或 GCLH)目前头孢菌素类品种的制备除运用 7ADCA、7ACA 母核合成目标物以外，还有一重要母核即 GCLE，它是某些 C3 修饰品种 必不可少的原料，用 GCLE(NSF)或 GCLH)可制备头孢菌素类品种见图 5。 图 3 青霉素扩环裂解得到 7ADCA（略） 图 4 头孢菌素 C 裂解制备 7ACA（略） 图 5GCLE(NSF)或 GCLH)制备不同头孢菌素及重要中间体（略） 4 头孢菌素类品种化学合成主要方法的解剖 4.1C7 位氨基改造化学合成 现有文献及实际生产时所用的方法有：(NSF)1)酰氯法(NSF)包括改进的酰氯法)： 其中：氯化剂有 P)Cl5、SOCl2、P)OCl3 等。(NSF)2)混合酸酐法： 其中：成酐剂有特戊酰氯、氯甲酸异丙酯等。(NSF)3)活性酯法： 本方法用 P)h3P)/促进剂 DM、(NSF)C2H5O)3P)、(NSF)CH3O)3P)。 本活性酯制备用 DCC/HOBT。此方法用得最多。上述三种方法中，以活性酯法为最好， 此法可以避免另外二种方法的不利因素。