叶酸检测方法研究论文

1942 年，Stokstad 首次成功地合成了叶酸，并阐明了叶酸的化学结构。半个世纪过 去了，叶酸一直是学术界的研究热点。目前的研究证实，妇女孕前或妊娠早期缺乏叶酸是 神经管畸形发生的重要病因之一［1］。叶酸与同型半胱氨酸代谢关系密切，对预防心血 管疾病的发生具有重要的生物学意义［2］。 叶酸是一组化学结构相似，生化特性相近的化合物统称，是由喋啶、对氨基苯甲酸和 1 个或多个谷氨酸结合而成。食物中的叶酸绝大多数是以喋酰多谷氨酸(或称多谷氨酸叶 酸)的形式存在的。食物叶酸经小肠粘膜细胞内特异叶酰多谷氨酸水解酶的作用，水解为喋 酰单谷氨酸(或称单谷氨酸叶酸，PteGlu))后吸收。吸收后的单谷氨酸叶酸一部分又转变为 多谷氨酸叶酸，在肝脏、红细胞及其他组织细胞内贮存，其余部分则以单谷氨酸叶酸的形 式分布于血浆、组织液、胆汁及尿液中。肝脏的叶酸浓度是血浆的几百倍，但其单谷氨酸 叶酸浓度与血浆相近。 叶酸以 8 种辅酶形式存在于生物体内，为一碳单位的载体参与嘌呤、嘧啶等重要物质 的合成。用于评价人体叶酸营养状况最常用的检测指标是红细胞叶酸及血清或血浆叶酸。 目前，叶酸的检测方法已有多种，其中微生物法、同位素放射免疫法的使用最为广泛。 一、微生物法 微生物法是检测生物体内叶酸的经典方法，通常所用的微生物有干酪样乳酸杆菌 （L.casei)、粪链球菌和啤酒小球菌属。此 3 种微生物对不同形式叶酸的敏感度不同。粪 链球菌只对非甲基化叶酸敏感，如 PteGlu)、二氢叶酸(DHF))和四氢叶酸(THF))，可用于鉴 别分析各种形式叶酸在不同检测物的分布。L.casei 对单谷氨酸叶酸、含 2 或 3 个谷氨酸 叶酸(PteGlu)2、PteGlu)3)及其还原型衍生物均敏感，是 3 种微生物中反应谱带最宽的一 种，也是最为常用的菌种。它对含 7 个谷氨酸叶酸(PteGlu)7)的敏感度很小，约为对 PteGlu) 敏感度的 1％，故有人认为 L.casei 对超过 3 个谷氨酸基团的多谷氨酸叶酸无响应。 但有研究发现，L.casei 对 PteGlu)4、PteGlu)5、PteGlu)6 和 PteGlu)7 的敏感度分别为对 PteGlu) 的 65.6％、19.9％、3.5％及 2.4％，同时对某些形式的多谷氨酸叶酸的敏感度随 培养时间的延长而增加，其机理有两种可能：其一，微生物在培养过程中合成水解酶，随 培养时间延长，水解酶产量增加，促使部分长链谷氨酸水解断裂；其二，细菌在培养过程 中细胞壁对多谷氨酸叶酸的通透性增加。所以，尽管 L.casei 对叶酸的反应谱带较宽，但 如检测物中含有多谷氨酸叶酸须将样品在检测前加入多谷氨酸叶酸水解酶进行水解，使各 种形式叶酸均转变成单谷氨酸叶酸，否则检测结果不能代表其叶酸总含量。 传统的微生物学检测方法是试管法，操作繁杂。1987 年，Newman 和 Tsai［3］在 进行食物叶酸分析过程中，对传统的方法做了改良，将 96 孔酶标板和全自动酶标板读数 仪(酶标仪)引进方法中，大大减少了试剂的消耗，缩短了加样及人工读取检测结果的时间。 如使用在对数生长期冷冻保存的 L.casei 菌种或／及对抗生素耐药菌株，还可使检测方法 进一步简化。另有研究证实［4］，使用对数生长期 L.casei 菌种(ATCC7469)可使检测物 培养时间从 36～48 小时减至 18 小时。O′Broin 和 Kelleher［5］用 L.casei 氯霉素耐药 株(NCIB10463)对血清及红细胞叶酸进行检测，结果与传统的微生物法检测结果呈显著线 性相关(r 值分别为 0.975 和 0.96)。使用氯霉素耐药株，可以省略试剂过滤消毒及无菌操 作等步骤。 尽管微生物法灵敏度高，结果准确，但也有许多局限性，如整个实验周期长，批间检 测结果重复性差，检测结果受样品中所含抗叶酸药物或抗生素成分的影响等。用 β-乳酰胺 酶处理样品后，可消除青霉素和先锋霉素等抗生素对叶酸检测结果的干扰［5］。 微生物法除可用于检测血清和全血叶酸外，还可用于检测纸血片叶酸［6］，检测结 果为叶酸与血红蛋白的比值。由于纸血片标本制备技术简单，纸血片叶酸稳定性较好，故 该法对大规模人群叶酸营养状况的流行病学调查具有重要的意义。 二、同位素放射免疫法 尽管微生物法得到各种改进，但仍因耗时大，操作复杂而不能得到广泛使用。70 年代 初，有学者提出同位素放射免疫法检测血清叶酸。该方法具有快速、简便的特点，同时由 于叶酸放射免疫试剂盒的出现，很快得到普及，尤其广泛应用于临床实验室。 放射免疫法与微生物法检测叶酸，除原理不同外，检测结果的意义也有所不同。对大 量标本总体而言，两种方法结果相关性较好，但对个体标本，两种方法结果的差异较大。 微生物法对多谷氨酸叶酸响应值低，不能直接用于检测叶酸含量。但微生物法对所有单谷 氨酸叶酸及其衍生物的反应灵敏度相同，故在用叶酸水解酶处理样品使所有叶酸形式转变 为单谷氨酸叶酸后进行检测，可得到准确的叶酸值。同位素放射免疫法对多谷氨酸叶酸反 应的相对灵敏度有较大的差别，随着叶酸浓度增加，反应的相对灵敏度增加，但多谷氨酸 叶酸的反应曲线不可能与单谷氨酸叶酸的反应曲线重合；另一方面，多谷氨酸叶酸与结合 蛋白的亲合性与单谷氨酸叶酸相比较高，不同的单谷氨酸叶酸衍生物反应灵敏度不同，放 射免疫法也不适用于检测单谷氨酸叶酸衍生混合物。由于上述原因，尽管放射免疫法可用 于检测和评价叶酸的营养状况，但从定量检测的角度来讲，难以得到准确的叶酸含量值。 目前用于检测叶酸的放射免疫试剂盒已有数种，其原理基本相同，但不同的试剂盒检 测结果也有差异［7］,主要区别有如下几方面：①竞争结合蛋白不同，或为猪血清结合蛋 白，或为牛奶结合蛋白，或为 β-乳球蛋白。(l)-5-甲基四氢叶酸与猪血清结合蛋白的亲合 力好于多谷氨酸叶酸，后者又略好于单谷氨酸叶酸的其他衍生物，而 5-甲基四氢叶酸的 d 型异构体不能与猪血清结合蛋白结合；牛奶结合蛋白与单谷氨酸叶酸和（d,l）-5-甲基四 氢叶酸具有相同的亲合力，但对单谷氨酸叶酸的其他衍生物的亲合力各不相同，对多谷氨 酸叶酸的亲合力高于对其单谷氨酸叶酸衍生物；β-乳球蛋白则对(d,l)-四氢叶酸的结合力较 差。②配制标准系列的溶液不同，主要有两种，即缓冲液和血清。用血清作配制溶液与用 缓冲液作配制溶液的试剂盒相比，检测结果偏低。③放射免疫法检测叶酸结果与试剂盒选 择哪一种形式叶酸作标准品有关，如选择的标准品为(d,l)-5-甲基四氢叶酸，则使用此类试 剂盒的前提便是假设检测物中绝大多数叶酸是以此单一辅酶形式存在的，从而使检测结果 与实际含量间的误差增大。以上所述的各种因素可能是造成目前各类试剂盒检测结果间差 别较大的主要原因。所以，尽管各类试剂盒均有其相应的正常值参考范围，但各实验室还 应结合与叶酸营养状况有关的其他指标，来确定本实验室的红细胞或血浆、血清叶酸正常 值。 三、其他方法 1.气相色谱-质谱检测：血清或红细胞叶酸是目前用于评价叶酸营养状况的两个重要指 标，且红细胞叶酸是反映体内叶酸贮存状况的客观指标，对诊断叶酸缺乏具有更为重要意 义。微生物法、放射免疫法可以实现血清或血浆及溶血液叶酸含量的检测，红细胞叶酸均 是通过某种数学公式，从溶血液叶酸、血清叶酸和红细胞压积等指标计算出来的。1995 年，Santhosh-Ku)mar 等［8］提出用气相色谱-质谱检测的方法(GC-MS)检测红细胞叶 酸含量，填补了直接检测样品红细胞叶酸浓度的空白，该方法特异性好，灵敏度高，且结 果准确。 2．色谱分析法:以上所述各种叶酸的检测方法，其检测结果均为单或／和多谷氨酸叶 酸及其衍生物混合物的总量。即使是微生物法也因不同微生物对不同形式叶酸的生物利用 率不同，无法进行某一种或某几种单谷氨酸叶酸衍生物的分析检测。70 年代，有学者提出 应用色谱分析法，包括高效离子交换层析、离子对分配层析和高效液相色谱分析(HPLC)技 术分离提取各种形式的叶酸，但由于叶酸浓度低于检测器检测下限，人们不得不在应用色 谱技术分离提取叶酸后，再用微生物学检测方法进行定量检测。因该方法费时，需要样品 量较大，故其实际应用受到限制。HPLC-电化学检测方法对单谷氨酸叶酸及其衍生物的检 测灵敏度高于紫外或荧光检测方法［9］，对四氢叶酸及 5-甲基四氢叶酸的检测灵敏度是 微生物法的 10～50 倍。此方法可用于人类及大鼠等多种生物样品叶酸检测，且检测前无 需样品浓缩处理。这项技术的应用对体内叶酸吸收、代谢及转运等基础理论的研究具有重 要意义。1996 年，Gu)nter 等［7］发现，HPLC 对全血叶酸的检测结果与 Bio-Rad 放射 免疫试剂盒对同份样品叶酸的测定结果相近，但血浆叶酸的测定结果仅为其他方法测定结 果的一半，作者认为尽管 HPLC 对 5-甲基四氢叶酸特异性好，但在洗脱过程中有叶酸丢失 的可能。HPLC 技术复杂，不适用于临床常规检测。 3．离子捕获法:Wilson 等［10］提出离子捕获法检测叶酸，该技术可谓叶酸检测技 术中的最新方法，即在实验中，样品加入变性剂后叶酸与内源性结合蛋白分离，释放后的 叶酸再与带有大量阴离子的亲合试剂结合，合成产物经过离子捕获池而与阳离子纤维结合， 最后通过碱性磷酸酶与喋酸(叶酸的类似物)结合物对叶酸结合蛋白上游离结合位点的探查， 定量分析样品的叶酸含量。该研究证实，离子捕获法测定血清或红细胞叶酸，其结果与同 位素放射免疫法的结果具有良好的相关性，相关系数分别为 0.96 和 0.93。 4．其他方法:80 年代后期～90 年代，有学者相继提出用非放射性标记蛋白结合技术 检测血液叶酸，其中包括克隆酶供体免疫测定法(CEDIA)［11］、酶联配体吸附试验 (ELLSA)［12］、化学发光受体实验等［13］。CEDIA 方法的原理在激素、地高辛及其 他维生素的检测中已有应用，其血清叶酸检测结果与放射免疫法相近，该方法检测速度约 为放射免疫法的两倍，又无离子辐射，操作简单，可作为一般实验室常规检查。不足之处 为费用高，约为放射免疫法的 2～3 倍。化学发光法检测重现性好，灵敏度较高，对低浓 度叶酸样品检测结果明显高于其他方法［7］。 20 家研究所或临床实验室对目前用于检测血清及全血叶酸的几种方法进行了比较研究 ［7］，结果显示，血清叶酸和全血叶酸检测结果平均变异系数分别为 27.6％和 35.7％， 部分样品用不同方法检测的结果可相差 2～9 倍，表明不同实验室的叶酸检测结果差异较 大，不同检测方法的检测结果之间可比性较差。这种差异不利于正确地客观地评价某人群 叶酸营养状况，同时也给制定每日膳食叶酸供给量带来困难。随着叶酸在巨幼红细胞贫血、 高同型半胱氨酸血症及神经管畸形的预防中的作用进一步明确，确定统一的检测方法和参 照标准，提高叶酸检测准确率的需求也日益紧迫。目前美国疾病控制中心(CDC)、美国国 家标准与技术研究院和美国农业部等机构已开始这方面的工作。 目前，我国特殊环境鼠害防制工作虽然取得明显成绩，但由于此类环境复杂，食源丰 富，气候温和，栖居条件良好，有利于鼠类加快繁殖，加之管理工作不善，灭鼠方法不妥， 因而鼠害仍然十分严重，不但给国家、集体的经济造成很大损失，而且使群众身体健康受 到极大威胁。为有效控制鼠害，促进灭鼠工作的深入发展，进一步提高人群环境、卫生及 生活的质量，作者根据自己多年灭鼠体会，并选择我国近 10 年各地有关特殊环境灭鼠经 验材料，整理出我国若干特殊环境鼠害防制研究概况，供灭鼠工作者参考。 1 车站与列车鼠害防制 火车站一般多与市区相连，鼠类数量多，交窜频繁。主要鼠种为褐家鼠、小家鼠和黄 胸鼠等。有关研究资料表明〔1〕，车站行李房、寄存处、仓库、车库、下水道、股道、 食品店、办公室、候车室和宿舍等是鼠患重要场所，亦是灭鼠重点地方，宜采用防灭相结 合措施〔1〕：(1)首先搞好防鼠建筑，防止老鼠乱窜；(2)用药物毒饵与捕鼠器械毒捕； (3)必要时设立固定毒饵盒(站)，并定期轮换使用药饵，不断提高与巩固灭鼠效果。 列车上的鼠患也很严重，常见鼠种有褐家鼠、黄胸鼠和小家鼠，还有黑线姬鼠和大仓 鼠等野栖鼠种。大量研究资料显示〔1，9〕，控制列车上鼠害以毒饵法和粘捕法较好。白 玉起等以 0.0375%杀鼠迷和 3%磷化锌分别与玉米配成毒饵，投放在旅客列车上灭鼠，结 果前者的灭效优于后者〔2〕。杜祥等以 0.05%毒鼠磷花生仁、苹果块和莜麦毒饵，分别 放在列车车厢四角、乘务室和顶蓬天窗侧窗内，让鼠自由摄食，连续观察 9 个月，灭效达 100%〔3〕。彭诚开等将 0.005%溴敌隆毒米装于毒饵盒内，布放在快、慢客车上，每季 度更换一次新的药饵(同时堵塞鼠洞)，经 18 个月观察灭效达 100%〔4〕。樊增荣等把粘 鼠板布放在特快、直快和普快列车上做粘鼠试验，粘捕率达 83%〔5〕。 2 港口与船舶鼠害防制 港口环境复杂，鼠害严重。主要鼠种为褐家鼠、黄胸鼠、小家鼠和黑家鼠等；还因船 舶远行各地，也可见到黑线姬鼠、臭NF)DA9NF)DA5等。港口的鼠患以各种食品 仓库、物质堆积站和食堂为多，而船舶上的鼠患以厨房、食物贮藏间和卧室最为严重。港 口和船舶的灭鼠以综合治理为主〔1〕。如港口灭鼠，室内外先用 0.05%杀鼠迷大米或稻 谷毒饵，待达标后用粘、捕等方法消灭残存鼠〔6〕。船舶上，重点在于防鼠，如在缆绳 上安装防鼠挡板(直径＞70cm)，夜间不放扶梯、桥板，必要时用强光照射，防止老鼠跑 到船上；货物要事先检查，以防将鼠带入船内。若发现船上有鼠活动，可用药物毒饵灭鼠。 梁卓报告〔7〕，在远洋船上以 0.1%敌鼠钠盐毒谷进行突击灭鼠，灭效达 99%。宋星飞 等在集装箱内以环氧乙烷和甲醛为原料，加入氟里昂作为发射剂组成混合气体，在 26～ 30℃、相对湿度 78%～85%条件下，施药 50g/m3，灭鼠率达 100%〔8〕。另外，有 的在集装箱内用二氧化碳和磷化铝熏蒸灭鼠，也有很好效果〔1〕。 3 机场与飞机鼠害防制 机场一般位于城郊空旷地带，面积较大，环境较好。但其周围多为茂密的杂草或农田 作物，往往鼠害较重。主要鼠种有褐家鼠、黄胸鼠、小家鼠，其次为黑线姬鼠、黄毛鼠和 大仓鼠等。机场鼠害防制措施主要有 4 点〔9〕：(1)建立鼠情监测制度，即以粉迹法和夹 日法每月测定 1 次鼠密度，发现密度回升，及时组织杀灭；(2)清除卫生死角，恶化鼠类栖 息场所，绿化与美化环境，使鼠无处藏身；(3)在鼠害重点场所设置毒饵站，每月查补 1 次 毒饵；(4)在机场围墙周围，每间隔 20～30m 设立防护带，以防外来鼠入侵。 飞机上应保证绝对无鼠，否则会带来极大的危害。万一发现有鼠活动，要千方百计地 设法消灭。目前较快的处理方法是用 100ppm 磷化氢在机内封闭熏蒸 1h，即可将鼠全部 致死［10］。李新民报告〔11〕，在波音 737 货仓和座仓内各放 1 个 200g 的烟雾罐， 熏蒸 16h 后发现机上试鼠全部死亡。要做到飞机上始终无鼠的办法，即在飞机起飞和装货 之前要坚持认真检查有无老鼠存在，一旦发现有鼠，立即消灭。 4 粮仓、食品厂、冷库和宾馆鼠害防制 这些场所食源丰富，环境稳定，鼠害严重。主要鼠种为褐家鼠、小家鼠和黄胸鼠等。 除宾馆外，这些场所的最大弱点是缺乏水源，但多数家鼠要经常饮水。所以，灭鼠时应将 含水份多的食物与药物制成毒饵或毒水投放，以提高灭鼠效果。据王宝才报告〔12〕，在 某粮仓与食品仓库，将 0.005%溴敌隆毒水装入容器内投放灭鼠，观察 21d 后灭鼠率为 88.69%～100%。有人以 0.0375%杀鼠迷分别与红薯、苹果配成毒饵放在食品厂灭鼠， 灭效达 90.9%〔13〕。尹强等用 0.05%敌鼠钠盐分别与蔬菜、玉米、鱼、肉配成毒饵在 粮油仓灭鼠，灭效为 95.38%〔14〕。此外，还应做好经常性的防鼠工作，特别是粮食要 存放在密闭场所，货物要垫高(50cm)离墙(30cm)存放，以防鼠盗食。 宾馆灭鼠，由于环境复杂，安全要求高，难度较大，但只要讲究灭鼠方法，亦可收到 理想的效果。目前，最佳方法是采取药物杀灭和环境治理等综合性防制措施〔15〕。如在 环境整治的基础上，用药物毒饵进行全方位、立体、饱和投饵灭鼠。赵承善等〔16〕曾用 0.5%c 型肉毒梭毒菌素面团毒饵进行一次性灭鼠，不但灭效高(灭鼠率为 99.11%～ 100%)，而且安全性好。汪诚信等〔17〕报告，如果经常用成品毒饵灭鼠效果不佳，需在 现场现配现用灭鼠毒饵，即将灭鼠药母粉按一定比例(药物用量为诱饵的 5%)均匀地撒在 诱饵(油条、胡萝卜丁或玉米花)上投放灭鼠，可取得良好灭效。有的在客房、歌舞厅使用 粘鼠胶、鼠夹灭鼠，也取得很好灭效。此外，要注重环境卫生，做到厨余、垃圾日产日清。 5 农贸市场与商场鼠害防制 农贸市场的结构与环境简单，但食源与水源却很丰富，这给鼠类生存提供了良好条件。 据调查，蔬菜和肉食摊位鼠患为轻，而生熟食摊点上鼠患较重，主要为褐家鼠和小家鼠。 针对此特点，应将灭鼠的重点放在市场摊点上。另外，由于场内食品种类多，且较新鲜， 老鼠很爱吃。因此，在此类场所灭鼠没有诱力强的饵料难以奏效。为此，必须首先用几种 诱力强的饵料布放在场内，让鼠自由取食 1～2d 后，再根据其最喜食的饵料与药物配成毒 饵灭鼠，方可取得理想灭效。 商场内部结构与环境均较复杂，气候条件稳定，各种物品、食物种类多，更易招诱老 鼠。主要害鼠有褐家鼠、黄胸鼠和小家鼠。其具体灭鼠方法可参照粮仓与食品厂的措施进 行。 6 医院与托儿所鼠害防制 医院鼠害重点是伙房、配餐间、食品库、服务社、儿科、妇产科等。主要有褐家鼠、 小家鼠等。常用“一药多饵法”灭鼠。作者近几年来在广州驻军某医院，以 0.04%杀鼠迷和 0.005%溴敌隆分别与大米、玉米、快餐面和肉食等配成毒饵灭鼠，均取得明显灭效，灭 鼠率在 98%以上〔9〕。 托儿所灭鼠，必须注意安全。首先将食物收藏起来，在儿童离开后投放药物毒饵。最 好将毒饵放入上锁的毒饵箱内，让鼠自由摄食。 7 禽畜养殖场和动植物园鼠害防制