荔枝草抗炎作用论文

1 材料与仪器 1.1 动物昆明种小鼠，雌雄兼用，体重（20±2）g，由南阳理工学院医学院动物饲养 中心提供。 1.2 药物及提取荔枝草(HerbaSalviaePlebeiae)HerbaSalviaePlebeiae)采自 6～7 月间田间、地头、沟畔， 将鲜草的地上部分洗净后晾干备用。荔枝草由我校生药学高级讲师杨转云鉴定。实验前加 10 倍水浸泡 30min，煎煮提取 2 次，2h/次，合并提取液，醇沉时间 72h，醇沉浓度为 60%［2］，浓缩成含鲜药材 1.0kg·L-1 的合剂，置冰箱冷藏室备用。 1.3 试剂二甲苯（湖北沙市化工试剂厂生产，批号 20000304），冰醋酸(HerbaSalviaePlebeiae)河南开封化 工厂生产,批号 20040905)，醋酸地塞米松片（天津天药药业有限公司，批号 060401）。 1.4 仪器 LDZ5-2 离心机(HerbaSalviaePlebeiae)北京医用离心机厂)，754 紫外-可见分光光度计(HerbaSalviaePlebeiae)上海精科)， 1810 紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器公司），FA1004N 型电子天平(HerbaSalviaePlebeiae)上海精密 科学仪器有限公司天平仪器厂)。 1.5 统计方法数据以±s 表示，总体间用单因素资料方差分析，两组间比较采用 t 检验。 2 方法及结果 2.1 对二甲苯诱导小鼠耳肿胀的实验［3］取健康昆明种小鼠 40 只，雌雄各半，称重， 随机分为 4 组，每组 10 只，即阴性对照组(HerbaSalviaePlebeiae)生理盐水组)，荔枝草提取液高、低剂量组 (HerbaSalviaePlebeiae)50，25g/kg),阳性对照组(HerbaSalviaePlebeiae)地塞米松,0.01g/kg)。以上各组给药方法均为灌胃，1 次/d， 连续 3d。末次给药后 1h，以 30μll 二甲苯涂于小鼠右耳两面致炎，左耳不涂，致炎后 60min 处死小鼠。分别在左、右耳同一部位用直径 9mm 的打孔器打下圆形耳片，精密称 重，以左右耳片间重量差作为肿胀度，数据进行组间 t 检验。 结果表明，二甲苯诱导的小鼠耳明显肿胀，与生理盐水组比较，荔枝草提取液高剂量 组对二甲苯诱导的小鼠耳肿胀有抑制作用(HerbaSalviaePlebeiae)P<0.05)。结果见表 1。 表 1 荔枝草提取液对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响（略） 与生理盐水组比较，﹡P＜0.05,＃P＞0.05；n=10 2.2 对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀的作用［4］取小鼠 40 只，称重，分组及给药剂量同 “2.1”项，阳性对照组用地塞米松 0.01g/kg，阴性对照组给予生理盐水，连续 5d。末次给 药后 1h，在每鼠右侧足跖皮下注射 1%角叉菜胶 0.05ml，5h 后沿踝关节剪下左右两足， 称重，以左侧足为正常对照，求肿胀度(HerbaSalviaePlebeiae)左右足重量差值)和抑制率。 抑制率（%）=（空白对照组肿胀度均值－用药组肿胀度均值）/空白对照组肿胀度均 值×100% 结果表明，荔枝草提取液高剂量组能明显抑制角叉菜胶所致小鼠足跖肿胀（P＜ 0.01），较地塞米松组弱；荔枝草低剂量组与生理盐水组比较无显著性差异(HerbaSalviaePlebeiae)P＞0.05)。 结果见表 2。 表 2 荔枝草提取液对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀度的影响（略） 与生理盐水组比较，**P＜0.01,＃P＞0.05；n=10 2.3 抗棉球肉芽肿的实验小鼠 40 只，称重，分组及给药剂量同“2.1”项，阳性组给予 醋酸地塞米松(HerbaSalviaePlebeiae)0.01g/kg)，阴性对照组给予生理盐水。动物麻醉后，将已高压灭菌过的 5mg 棉球植入腋下，缝合切口后外涂青霉素溶液抗感染。次日各组小白鼠分别灌胃给予相 应的药物，1 次/d,连续给药 7d，第 8 天处死小鼠，剥离肉芽组织的棉球，60℃烘烤 12h，称重，计算肉芽重量。 肉芽重量=带肉芽组织的棉球重量-棉球原始重量 结果表明，荔枝草高剂量组能明显抑制小鼠棉球肉芽肿的生长,与生理盐水对照组比较, 差异显著(HerbaSalviaePlebeiae)P＜0.01),作用较地塞米松组弱；荔枝草低剂量组与生理盐水组比较无显著性差 异(HerbaSalviaePlebeiae)P＞0.05)。结果见表 3。 表 3 荔枝草提取液对小鼠棉球肉芽肿的影响（略） 与生理盐水组比较，**P＜0.01,＃P＞0.05；n=10 2.4 对冰醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响［5］小鼠 40 只，称重，雌雄各半， 分组及给药剂量同“2.1”项，ig 给药，连续 7d。末次给药后 1.5h，尾静脉注射 0.5%伊文 思蓝生理盐水溶液 0.1ml/10g，10min 后 ip0.7%冰醋酸 0.1ml/10g，20min 后脱颈椎 处死小鼠，每只 ip 生理盐水 5ml，轻揉腹部 3min，从腹腔中收集腹腔洗出液 3ml(HerbaSalviaePlebeiae)冲洗 液如被血液污染，则弃去不用)，1000r/min 离心 5min，取上清液用 754 紫外-可见分光 光度计，于 λ=590nm 处测吸光度(HerbaSalviaePlebeiae)A)值。结果表明，荔枝草高剂量组能明显抑制冰醋酸 所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加（P＜0.01）,低剂量组与生理盐水组比较无显著性差异 (HerbaSalviaePlebeiae)P＞0.05)。结果见表 4。 表 4 荔枝草提取液对冰醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响（略） 与生理盐水组比较，**P＜0.01,＃P＞0.05；n=10 3 讨论 各种组织发生的以多种原因引起炎症，其基本病理变化都包括变质、渗出和增生三项。 一般来说，炎症早期，主要表现是毛细血管扩张、通透性增加、渗出和水肿；炎症中期以 血小板黏附及白细胞游走为特点，与免疫反应紧密相关；而慢性炎症或炎症的后期则以纤 维组织增生、肉芽屏障形成等为特点［6］。本研究表明，荔枝草提取液对二甲苯引起的 小鼠耳廓肿胀、角叉菜胶引起的小鼠足跖肿胀和小鼠棉球肉芽肿的生长、醋酸所致的小鼠 腹腔毛细血管通透性增加均有显著的抑制作用，并有一定的剂量依赖性。 综上所述，荔枝草提取液具有一定的抗炎作用，与其清热解毒作用吻合。其作用机理 与减少毛细血管通透性、减少渗出有关，亦可能与其抗组织胺作用有关［7］，尚待进行 进一步研究。 1 材料与仪器 大白栓菌采于湖北宜昌，经湖北三峡科技学校王绍柏老师鉴定为大白栓菌 Trameteslactinea(HerbaSalviaePlebeiae)Berk.)Pat.。由天然产物开发与利用湖北省重点实验室纯化培养。 显微镜（OLYMPUSBH-2）；KYKY-3800 扫描电子显微镜（北京中科科仪技术发展 有限责任公司），超净工作台（苏州净化设备厂）；立式压力蒸气灭菌器（上海华线医用 核子仪器有限公司）；电热培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；恒温摇床（中 国科学院武汉科学仪器厂）。 2 方法与结果 2.1 大白栓菌形态特征取野生大白栓菌菌丝体进行人工培养，待大白栓菌子实体成熟 后，取子实体进行观察。见图 1。 担子果一年生，无柄，木栓质。菌盖半圆形，扁平，（4~16）cm×(HerbaSalviaePlebeiae)5.5~26)cm， 厚 0.4~2.7cm，表面白色，渐变乳白色或浅黄白色，具细微绒毛，后变光滑，有或无瘤 或疣，瓣裂成菊花状，裂片波状弯曲，形成众多蜂窝状菌管。基部菌管纵向层叠，排列紧 密，长 0.3~1.4cm，管口近圆形，管壁完整。菌肉白色，浅肉色至米黄色，厚 0.2~1.5cm。 2.2 大白栓菌显微特征人工培养大白栓菌，取不同生长时期的菌丝体水装片，显微镜 下观察菌丝形态。子实体成熟后，取子实体粉末过 80 目筛，分别用水、稀甘油、水合氯 醛透化装片，显微镜下观察粉末特征。见图 2~5。 图 1 野生大白栓菌（略） 图 2 人工培养大白栓菌（略） 营养菌丝纤细，直滑，可见横膈膜及分枝，常交织成白色的绒絮状菌丝体，直径 3~10μlm。生殖菌丝近透明，薄壁，有或无锁状联合，直径 7~13μlm。缠绕菌丝无色， 厚壁，狭窄，多分枝，不发达，在菌肉内插入其他菌丝之间，直径 4~15μlm。骨架菌丝 近无色或淡黄色，厚壁，细胞腔狭窄或实心，不分枝，组成坚硬的子实体骨架，直径 11~34μlm。担孢子类圆形至近椭圆形，半透明，薄壁，平滑，直径 8~27μlm。电子显微 镜下可见孢子表面有众多皱纹及凹陷。 图 3 大白栓菌粉末特征图（略） 图 4 大白栓菌的孢子图（略） 图 5 大白栓菌孢子表面特征图（1.6KX）（略） 2.3 大白栓菌成分预试［3］取大白栓菌 5g 用 75％的乙醇提取，提取液趁热过滤， 浓缩至 5ml 进行成分预试。结果见表 1。 表 1 大白栓菌成分预试结果（略） “＋”表示阳性反应；“-”表示阴性反应 结果显示，大白栓菌不含生物碱、黄酮及蒽醌类化合物，含有甾体和（或）三萜类、 糖和（或）苷类、鞣质类化合物。 2.4 薄层层析分析取大白栓菌 5g 用 95％的乙醇提取，提取液趁热过滤，冷却后出现 大量沉淀，取沉淀 10mg，溶于 1ml 的三氯甲烷，再加几滴乙醇，超声使其充分溶解。点 于硅胶 G254 薄层板上。用三氯甲烷∶乙醇=10∶0.6 展开，以 3-氢化松苓酸 B(HerbaSalviaePlebeiae)TrametenolicacidB)为对照［4，5］（本实验室首次从该真菌中分离）。结果见图 6。 图 6 薄板层析图（略） 3 讨论 大白栓菌分布广泛，在多种阔木树上易于生长，但由于其出菇较困难，人们对其了解 较少。国内外缺少对大白栓菌研究，本实验室对大白栓菌的生物学特征、化学成分、人工 培养等进行了深入研究，为进一步开发利用大白栓菌奠定了基础。 研究表明，大白栓菌主要含有糖类和三萜类化合物，3-氢化松苓酸 B 是大白栓菌的主 要成分。此成分存在茯苓等真菌中，具有明显的调节免疫功能、促进生长作用［6］，有 良好的开发利用前景。 1 仪器与试药 核磁共振光谱用 BrukerAV-300、AV-500 型核磁共振光谱仪测定（TMS 内标）；红 外光谱用 ShimadzuIR-435 型红外分光光度计测定（KBr 压片）；熔点用 X4 型数字显示 显微熔点测定仪（未校正）测定；ESI-MS 在 Agilent1100LC/MSDSL 上测定； LABCONCO(HerbaSalviaePlebeiae)freezedrysystem/LYPHLOCK4.5)冷冻干燥仪。化合物纯度由 Agilent1100 高效液相色谱仪检测。柱色谱材料为 D101 型大孔吸附树脂、聚酰胺（100~200 目）、硅胶(HerbaSalviaePlebeiae)200~300 目)、RP-C18（YMC;12μlm）及 SephadexLH20（AmershamBiosciences），柱色谱试剂均为分析纯，高效液相色谱试剂均为色谱 纯。 2 方法与结果 2.1 提取与分离北柴胡干燥茎叶 15kg，粉碎后用 80%乙醇冷浸提取 2 次，合并提取 液，减压浓缩至无醇味，得总浸膏。总浸膏用正丁醇萃取，减压浓缩后得正丁醇部浸膏 320g，水溶解后上大孔吸附树脂换水洗脱后，分别用不同体积分数的 95%乙醇梯度 （φ=20%，30%，50%，70%）洗脱，20%乙醇洗脱得流分Ⅰ，30%乙醇洗脱得流分 Ⅱ，50%乙醇洗脱得流分Ⅲ，70%乙醇洗脱得流分Ⅳ。流分Ⅰ经硅胶干柱色谱，以氯仿甲醇-水（体积比为 4∶1∶0.5）洗脱得 15 个组分（Fr.1~Fr.15），其中，Fr.3 经 SephadexLH-20，甲醇洗脱得化合物 1（15mg）；Fr.5 经 RP-C18 反相柱色谱，水-甲 醇（1∶1）洗脱得化合物 2（12mg）；Fr.7-12 经 RP-C18 反相柱色谱，水-甲醇（9∶1） 洗脱得化合物 5（6mg）。流分Ⅱ经硅胶干柱色谱，氯仿-甲醇溶剂系统（7∶3）洗脱得化 合物 4(HerbaSalviaePlebeiae)7mg)。流分Ⅲ经硅胶干柱色谱，石油醚-醋酸乙酯溶剂系统（体积比 100∶0，90∶10，80∶20…）梯度洗脱，得 20 流分，流分 10 经反相柱色谱，水-甲醇（体 积比 3∶7）洗脱得化合物 3(HerbaSalviaePlebeiae)0.6g)。流分Ⅳ经聚酰胺色谱柱不同体积分数乙醇梯度洗脱， 得化合物 6(HerbaSalviaePlebeiae)0.5g)和 7(HerbaSalviaePlebeiae)3.0g)。 2.2 结构鉴定 2.2.1 化合物 1 无色针晶（醋酸乙酯），mp210~212℃，溴甲酚绿显色反应阳性 (HerbaSalviaePlebeiae)示存在羧基)，三氯化铁-铁氰化钾反应阳性(HerbaSalviaePlebeiae)示有酚羟基存在)， 1HNMR(HerbaSalviaePlebeiae)300MHz，DMSO-d6)：δ12.46(HerbaSalviaePlebeiae)1H，brs，COOH)，9.81(HerbaSalviaePlebeiae)1H，brs，ArOH)，7.43(HerbaSalviaePlebeiae)1H，d，J=2.0Hz,H2)，7.45(HerbaSalviaePlebeiae)1H，dd，J=8.7，2.0Hz，H-6)，6.84(HerbaSalviaePlebeiae)1H，d，J=8.7Hz，H5)，3.81(HerbaSalviaePlebeiae)3H，s，OCH3)。NOESY 谱中，3.81(HerbaSalviaePlebeiae)3H，s，OCH3)与 7.43(HerbaSalviaePlebeiae)1H，d，J=2.0Hz,H-2)有 NOE 效应。经与文献［1］对照，确定化合物 1 为香草酸。 2.2.2 化合物 2 无色针状结晶（乙醇），mp151~154℃，溴甲酚绿显色反应阳性 (HerbaSalviaePlebeiae)示存在羧基)，三氯化铁-铁氰化钾反应阳性(HerbaSalviaePlebeiae)示有酚羟基存在)， 1HNMR(HerbaSalviaePlebeiae)300MHz，DMSO-d6)：δ6.97(HerbaSalviaePlebeiae)1H，d，J=7.9Hz，H3)，7.54(HerbaSalviaePlebeiae)1H，dd，J=7.9，1.7Hz，H-4)，6.94(HerbaSalviaePlebeiae)1H，t，J=7.9Hz，H5)，7．80(HerbaSalviaePlebeiae)1H，dd，J=7.9，1.7Hz，H-6)，12.65（1H，s，OH），15.87（1H，s，-COOH）。13CNMR(HerbaSalviaePlebeiae)125MHz，DMSO-d6)：δ112.9(HerbaSalviaePlebeiae)C1)，161.1(HerbaSalviaePlebeiae)C-2)，117.0(HerbaSalviaePlebeiae)C-3)，135.6(HerbaSalviaePlebeiae)C-4)，119.1(HerbaSalviaePlebeiae)C-5)，130.2(HerbaSalviaePlebeiae)C-6)，171.8(HerbaSalviaePlebeiae)C7)。以上氢谱与碳谱数据与文献［2］基本一致，确定化合物 2 为水杨酸。 2.2.3 化合物 3 无色针晶(HerbaSalviaePlebeiae)甲醇)，mp142~143℃，IRcm-1：3430(HerbaSalviaePlebeiae)OH)，1660(HerbaSalviaePlebeiae)C=O)，1622(HerbaSalviaePlebeiae)C=C)，1602，1590(HerbaSalviaePlebeiae)Ar)，1042(HerbaSalviaePlebeiae)CO-)。1HNMR(HerbaSalviaePlebeiae)500MHz，DMSO-d6)：δ7.04(HerbaSalviaePlebeiae)1H，d，J=2.1Hz，H2)，6.75(HerbaSalviaePlebeiae)1H，d，J=8.2Hz，H-5)，7.00(HerbaSalviaePlebeiae)1H，dd，J=8.2，2.1Hz，H6)，6.25(HerbaSalviaePlebeiae)1H，d，J=15.9Hz，=C-H)，7.46(HerbaSalviaePlebeiae)1H，d，J=15.9Hz，=CH)，4.15(HerbaSalviaePlebeiae)2H，q，-CH2)，1.24(HerbaSalviaePlebeiae)3H，t，CH3-)，9.09(HerbaSalviaePlebeiae)1H，s，-OH)，9.54(HerbaSalviaePlebeiae)1H，s，OH)。ESI-MS(HerbaSalviaePlebeiae)m／z)：208(HerbaSalviaePlebeiae)M+)，180(HerbaSalviaePlebeiae)M+-CH2CH3+H)，163(HerbaSalviaePlebeiae)M+OCH2CH3)。13CNMR(HerbaSalviaePlebeiae)125MHz，DMSO-d6)：125.5（C-1），114.8（C2），145.5（C-3），144.9（C-4），115.7（C-5），121.2（C6），114.0（=C），148.3（=C），166.4（-C=O），59.6（CH2），14.2（CH3-）。以上氢谱与碳谱数据与文献［3］基本一致，确定化合物 3 为咖 啡酸乙酯。 2.2.4 化合物 4 无色针晶（甲醇），mp204~206℃，溴甲酚绿显色反应阳性(HerbaSalviaePlebeiae)示存 在羧基)，三氯化铁-铁氰化钾反应阳性(HerbaSalviaePlebeiae)示有酚羟基存在)，1HNMR(HerbaSalviaePlebeiae)500MHz，DMSOd6)：δ7.35（1H，d，J=2.0Hz，H-2），6.79(HerbaSalviaePlebeiae)1H，d，J=8.2Hz，H5)，7.30(HerbaSalviaePlebeiae)1H，dd，J=8.2，2.0Hz，H-6)，9.26(HerbaSalviaePlebeiae)1H，s，-OH)，9.63(HerbaSalviaePlebeiae)1H，s，OH)，12.27(HerbaSalviaePlebeiae)1H，s，-COOH)。13CNMR(HerbaSalviaePlebeiae)125MHz，DMSO-d6)：δ121.7(HerbaSalviaePlebeiae)C1)，116.6(HerbaSalviaePlebeiae)C-2)，144.9(HerbaSalviaePlebeiae)C-3)，150.0(HerbaSalviaePlebeiae)C-4)，115.1(HerbaSalviaePlebeiae)C-5)，121.9(HerbaSalviaePlebeiae)C-6)，167.3(HerbaSalviaePlebeiae)COOH)。以上氢谱与碳谱数据与文献［4］基本一致，确定化合物 4 为原儿茶酸。 2.2.5 化合物 5 淡黄色针晶(HerbaSalviaePlebeiae)甲醇)，三氯化铁-铁氰化钾反应阳性(HerbaSalviaePlebeiae)示有酚羟基存在)， 溴甲酚绿显色反应阳性(HerbaSalviaePlebeiae)示存在羧基)。1HNMR(HerbaSalviaePlebeiae)500MHz，DMSOd6):δ6.67(1Hδ6.67(HerbaSalviaePlebeiae)1H，s，H-3)，6.19(HerbaSalviaePlebeiae)1H，d，H-6)，6.46(HerbaSalviaePlebeiae)1H，d，H8)。13CNMR(HerbaSalviaePlebeiae)125MHz，DMSO-d6)：δ160.7(HerbaSalviaePlebeiae)C-2)，109.0(HerbaSalviaePlebeiae)C-3)，183.2（C4），161.4（C-5），98.8（C-6），161.6（C-7），93.99（C-8），157.6（C9），104.5（C-10），164.6（-COOH）。以上氢谱与碳谱数据与文献［5］基本一致， 确定化合物 5 为柴胡色原酮酸。 2.2.6 化合物 6 淡黄色针晶(HerbaSalviaePlebeiae)甲醇)，mp275~276℃，三氯化铁-铁氰化钾反应阳性 (HerbaSalviaePlebeiae)示有酚羟基存在)，盐酸-镁粉反应阳性，Molish 反应阴性。与山萘酚标准品共薄层，Rf 值一致。与标准品混合后熔点不下降。1HNMR(HerbaSalviaePlebeiae)500MHz,DMSOd6):δ6.67(1Hδ12.47,10.75,10.07,9.35(HerbaSalviaePlebeiae) 各 1H,s,D2O 可交换,5-OH,7-OH,3-OH,4′OH),8.04(HerbaSalviaePlebeiae)2H,d,J=8.7Hz,H-2′,H-6′),6.93(HerbaSalviaePlebeiae)2H,d,J=8.7Hz,H-3′,H5′),6.44(HerbaSalviaePlebeiae)1H,d,J=2.0Hz,H-8),6.19(HerbaSalviaePlebeiae)1H,d,J=2.0Hz,H-6)。以上氢谱数据与文献［6］基 本一致，确定化合物 6 为山萘酚。