【医药学论文】杜仲叶提取物中绿原酸的纯化及其体外抑菌效果的研究

来源： 2017-06-19 19:52中

摘要

本研究旨在确定杜仲叶提取物中绿原酸的纯化工艺，并通过指纹图谱的建立来对产品的质量进行控制，再考察其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、白色葡萄球菌、乳房链球菌、停乳链球菌的体外抑菌效果，为临床应用提供试验依据。试验所采用的纯化方法是大孔吸附树脂法，首先通过絮凝沉淀法来对样品进行预处理，然后再用高效液相色谱法建立绿原酸的指纹图谱；抑菌试验主要采用滤纸片法和连续梯度稀释法来观察和确定其抑菌效果和最小抑菌浓度；试验过程中绿原酸的含量测定则采用紫外分光光度和高效液相色谱两种方法。
综上所述，絮凝沉淀法和大孔吸附树脂法的连用可以有效的从杜仲叶绿原酸提取物中分离纯化出绿原酸，且分离出的物质对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乳房链球菌、停乳链球菌、蜡样芽胞杆菌、白色葡萄球菌均具有抑菌作用。

第一章文献综述
1.1 杜仲概述
杜仲是杜仲科杜仲属的落叶乔木。16世纪在李时珍的著作《本草纲目》中写到 "昔有杜仲（人名）服此得道，思仲、思仙皆有此义"。通过李时珍的介绍让我们后人了解到杜仲名字的由来。
1.1.2 杜仲叶的化学成分
1.2 绿原酸
1897年Osbome和Campbell在向日葵籽中发现的一种化学物质。1909年经Gorter等人最终确定了此物质为绿原酸。绿原酸化学结构的首次确定则在1947年，由Rudkin与Nelson研究得出[23]。绿原酸的分子式为C 16H 18O 9，分子量为354.30，化学结构式如图1。
图1 绿原酸结构式图
（1）抗菌、抗病毒
绿原酸还有一定的抗病毒效果。通过研究发现其对抗猪细小病毒[33]及疱疹病毒1型[34]的感染有一定对抑制作用，除此之外绿原酸有潜在治疗禽流感病毒H5N1[35]及HIV[36]病毒的作用。
研究发现，绿原酸具有抗氧化性。绿原酸的化学结构中含有很多R-OH基，这一特殊结构使得绿原酸形成了具有抗氧化作用的羟自由基。这些具有抗氧化作用的羟自由基则用于消除羟基自由基和超氧阴离子等自由基，发挥其抗氧化性。经报道，绿原酸抗氧化的能力要高于咖啡酸，丁香酸以及生育酚等常见的抗氧化剂[37]。
抗氧化剂在食品、医药及日化等行业中一直占据了重要的位置。随着社会的发展，人们对身体的健康越来越重视，因而开发天然无污染的抗氧化剂更成为了大家的研究热点。因而绿原酸的这种生物活性为食品、医药及日化提供了有利的参考依据。
绿原酸抗氧化作用的生物活性，使得绿原酸可以通过清除体内的自由基和抗脂质过氧化最终起到保护血管内皮细胞的作用。这是绿原酸具有预防动脉粥样硬化、高血压、血栓等心血管系统疾病作用的主要原因。通过Andersen等[40]研究结果，使我们知道绿原酸可以使钾离子的浓度升高，使三酰甘油及胆固醇等物质的水平降低，从而发挥其预防心血管系统疾病的作用。从Watanabe等[41]的研究我们知道，绿咖啡豆中分离得出的绿原酸提取物可以使鼠和人自发性高血压疾病的血压降低。
除以上生物活性外，绿原酸还具有抑制细胞的突变，以及对抗肿瘤的作用，因而绿原酸被认为是预防癌症的有效化学物质[42]。绿原酸还可以通过刺激胆汁的分泌从而达到利胆的功效。绿原酸还具有抗紫外线、抗辐射等功效，这为开发防晒等护肤品提供参考，现在已经有关于添加绿原酸的防晒霜的欧洲专利[43]产生。
（1）大孔吸附树脂法
分子极性的大小、样品的pH值、上样液的浓度和速度、以及洗脱溶液的选择等在大孔吸附树脂分离纯化中药药液的过程中都有一定的影响。熊硕等[44]从8种不同极性的大孔吸附树脂中最终筛选出了对杜仲叶中的绿原酸吸附及解析效果最好的NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂，采用单因素试验确定了正交试验的因素和水平，最终通过正交试验得出了NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂分离纯化杜仲叶中绿原酸的最佳工艺，工艺参数为：样品质量浓度为4 mg/mL、上样速度为4 BV/h、样品体积为5 BV，洗脱剂为80 %的乙醇、洗脱剂流速为3 BV/h。
（2）聚酰胺柱层析法
郝凤霞等[45]应用聚酰胺方法，从金银花中分离出了绿原酸、黄酮、榭皮素和木犀草素，它们的含量分别为68.2 %、95 %、7.5 %、16.9 %。杨敏丽[46]，筛选了聚酰胺柱层析法的最优的工艺参数，从金银花中分离出了纯度为70 %的绿原酸。刘军海等[47]，应用聚酰胺柱层析法，从杜仲叶提取物中纯化出了绿原酸，最终得到的绿原酸纯度高达77.04 %。该方法虽然可以得到纯度很高的绿原酸，但是由于其操作比较麻烦，且产量低，洗脱时间又长，所以并不适合进行大规模的生产使用，主要是应用于分析研究中。
超滤膜分离法兴起的时间是20世纪60年代。超滤膜其实是一种选择透过性膜，它的工作原理主要是，在外力的作用下，小分子的物质可以通过滤膜，大分子的物质则不能通过滤膜，从而达到分离纯化的目的。