医药学论文：谈乙肝多表位抗原基因非融合表达载体的构建和表达

1 材料和方法
1.2 方法
1.2.2 基因的克隆及阳性重组子的筛选 根据pMD18T载体和pBAD载体的结构特征, 设计两端带有Nco I和EcoR I酶切位点的引物: 5′GCCCATGGCAATGCAGTG GAACTCC3′（上游引入Nco I酶切位点）; 5′GCGAAT TCCACCCAGACGAGCTAC3′（下游引入EcoR I酶切位点）。以CAG176为模板［1］, PCR扩增出乙型肝炎预防治疗性疫苗基因BPT(扩增条件: 94℃变性5 min, 94℃ 1 min, 55℃ 50 s, 72℃ 55 s, 扩增30个循环, 最后72℃延长10 min)。PCR扩增产物以冻融法割胶回收, 与T载体15℃连接过夜后转入大肠杆菌DH5α, 涂板培养, 挑取单菌落培养, 抽提质粒T/BPT, 以Nco I和EcoR I酶切T/BPT及载体pBAD, 冻融法回收小片段和大片段, 两者15℃连接过夜, 转化入大肠杆菌Top10, 涂板培养。挑取单菌落抽提质粒, 以Nco I和EcoR I双酶切, 并以该质粒为模板, 上述引物和PCR扩增条件进行扩增, 酶切产物及扩增产物均以10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定, 以筛选出阳性重组子。
1.2.4 蛋白的纯化 使用SPSepharose阳离子柱层析纯化HiTrap , SPSepharose HP 5 mL 预装柱经20 mmol/L、 pH9.0的Tris.CL缓冲平衡液, 将透析液上SP柱, 用20 mmol/L、 缓冲液及含1 mol/L NaCl的 TrisHCl缓冲液（ pH9.0）进行梯度洗脱并分步收集洗脱峰。
2 结果