解放军文职招聘考试生物化学——蛋白质工程

 生物化学——蛋白质工程
一,蛋白质工程的产生背景:
随着科学技术的迅猛发展，人类对不同层次(分子、亚细胞、细胞、组织、器官乃至生命体本身的生命过程)的控制和利用已成为可能。作为生物功能的基本物质的蛋白质， 由于其本身的多样性而为其多种应用提供了巨大潜能，人们一直在期待着对蛋白质功能的某种添加与除去的最终自主控制并希望制造出比天然蛋白质性能更为优越的新的蛋白质。于是基于近年来定位诱变D N A、基因全合成和高效基因表达等重组DNA技术的发展,蛋白质工程作为一个全新的开发领域被提出来.
二,蛋白质工程及其研究领域:
   蛋白质工程，是指在基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学，计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识通过对基因的人工定向改造等手段，对蛋白质进行修饰，改造和拼接以生产出能满足人类需要的新型蛋白质的技术。它是在重组DNA方法用于“操纵” 蛋白质结构之后发展起来的一个分子生物学分支不难看出， 蛋白质工程是蛋白质结构研究和基因工程研究相融合的产物.

   蛋白质工程的范畴很广,包括任何旨在把蛋白质知识变为实际应用的研究和方法，其中的主体是如何“操纵” 蛋白质， 以图搞清其结构与功能的关系，最终将之用于实际。目前的蛋白质工程主要包括四大类的研究。
(1)利用已知的蛋白质一级结构的信息作为应用研究， 这也是迄今蛋白质工程研究中最成功的方法。例如某些具有不同一级结构的多肽都可作为细胞内通道的信号和细胞识别信号而起作用，这些多肽分子都较小，推测可能具有特定的三级结构，故可作为有功能的一级结构单(functional  primary sequence element)，据此，有人利用原核细胞的信号肽直接指导牛胰蛋白酶抑制剂的分泌及适当的加工处理过程。此外，还有一类蛋白质，可对其氨基酸侧链进行改造而获得新的性质，例如，除去氧化敏感性侧链可使蛋白质趋于稳定态， 这可用于制备失活的、对氧化稳定的蛋白质变异体；
(2) 从混杂交异体库中筛选和选择具有一定结构---功能关系的蛋白质。蛋白质变异是蛋白质工程中很重要的研究内容和手段。人们可有目的地在特定位点上使蛋白质产生变异，然后研究其结构功能的关系，如果是一个混杂的变异体库，则可从中筛选出具有一定结构----功能关系的蛋白质。这一类研究的主要困难是变异体库的获得及筛选方法的建立。在这方面的一个成功例子是有人把热不稳 的酶的基因转移到嗜热生物体内，然后利用酶的某种标志筛选出对热稳定的酶，这就既保持 酶的原有性质，又增加了热稳定性。
(3)定量确定蛋白质结构与功能的关系，这是目前蛋白质工程的研究主体。它的内容包括蛋白质三维结构模型的建立， 配体结合(1igand binding)和酶催化的性质，蛋白质折叠和稳定性，蛋白质变异等。
(4)根据已知蛋白质结构与功能的关系，用人工方法合成蛋白质及其变异体， 这一类研究的目标是要达到完全由人工来控制蛋白质的性质， 目前还只能合成一些小肽.
三,实现蛋白质工程的途径与技术
基本途径如下:
从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的核糖核苷酸序列（RNA）→找到相对应的脱氧核糖核苷酸序列（DNA）
结构、功能的设计和预测
根据对天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数据库里的数据，可以预测一定氨基酸序列肽链空间结构和生物功能；反之也可以根据特定的生物功能，设计蛋白质的氨基酸序列和空间结构。通过基因重组等实验可以直接考察分析结构与功能之间的关系；也可以通过分子动力学、分子热力学等，根据能量最低、同一位置不能同时存在两个原子等基本原则分析计算蛋白质分子的立体结构和生物功能。虽然这方面的工作尚在起步阶段，但可预见将来能建立一套完整的理论来解释结构与功能之间的关系，用以设计、预测蛋白质的结构和功能。

创造和改造
蛋白质的改造,若采用基因重组技术或人工合成DNA，不但可以改造蛋白质而且可以实现从头合成全新的蛋白质.
方法: 在蛋白质空间结构和功能研究的基础上，进行计算机分子结构设计， 设计一个新的具有人们所期待的性质的蛋白质氨基酸序列，然后通过对编码该蛋白质的基因进行定位突变或盒式突变，再用遗传工程的方法产生出预期的新的蛋白质.
技术支持
定位突变: 将待研究的基因插入载体噬菌体M13，制得单链模板，人工合成一段寡核苷酸（其中含一个或几个非配对碱基）作为引物，合成相应的互补链，用T4连接酶连接成闭环双链分子。经转染大肠杆菌，双链分子在胞内分别复制，因此就得到两种类型的噬菌斑，含错配碱基的就为突变型。再转入合适的表达系统合成突变型蛋白质。
盒式突变: 盒式突变1985年Wells提出的一种基因修饰技术——盒式突变，一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行“饱和性”分析。利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧造成两个原载体和基因上没有的内切酶切点，用该内切酶消化基因，再用合成的发生不同变化的双链DNA片段替代被消化的部分。这样一次处理就可以得到多种突变型基因。

PCR技术: 以研究基因为模板，用人工合成的寡核苷酸（含有一个或几个非互补的碱基）为引物，直接进行基因扩增反应，就会产生突变型基因。分离出突变型基因后，在合适的表达系统中合成突变型蛋白质。这种方法直接、快速和高效。
高突变率技术: 有两种新的突变方法具有较高的突变率：①硫代负链法：核苷酸间磷酸基的氧被硫替代后修饰物（α－（S）－dCTP）对某些内切酶有耐性，在有引物和（α－（S）－dCTP）存在下合成负链，然后用内切酶处理，结果仅在正链上产生“缺口”，用核苷酸外切酶III从3｀→5｀扩大缺口并超过负链上错配的核苷酸，在聚合酶作用下修复正链，就可以得到二条链均为突变型的基因；②UMP正链法：大肠杆菌突变株RZ1032中缺少脲嘧啶糖苷酶和UTP酶，M13在这种宿主中可以用脲嘧啶（U）替代胸腺嘧啶（T）掺入模板而不被修饰。用这种含U的模板产生的突变双链转化正常大肠杆菌，结果含U的正链被寄主降解，而突变型负链保留并复制。
蛋白质融合技术: 将编码一种蛋白质的部分基因移植到另一种蛋白质基因上或将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达，产生出新的融合蛋白质。这种方法可以将不同蛋白质的特性集中在一种蛋白质上，显著地改变蛋白质的特性。现在研究的较多的所谓“嵌合抗体”和“人缘化抗体”等，就是采用的这种方法。
四,蛋白质工程的应用及进展
1提高蛋白质的稳定性 2　蛋白质活性的改变 3治癌酶的改造 4　嵌合抗体和人缘化抗体
当前，蛋白质工程是发展较好、较快的分子工程。这是因为在进行蛋白质分子设计后，已可应用高效的基因工程来进行蛋白的合成。最早的蛋白工程是福什特（Forsht）等在1982—1985年间对酪氨酰—t—RNA合成酶的分子改造工作。他根据XRD（X射线衍射）实测该酶与底物结合部位结构，用定位突变技术改变与底物结合的氨基酸残基，并用动力学方法测量所得变体酶的活性，深入探讨了酶与底物的作用机制。佩里（Perry）1984年通过将溶菌酶中Ile(3)改成Cys(3)，并进一步氧化生成 Cys(3)-Cys（97）二硫键，使酶热稳定性提高，显著改进了这种食品工业用酶的应用价值。   1987年福什特通过将枯草杆菌蛋白酶分子表面的Asp（99）和Glu（156）改成Lys，而导致了活性中心His（64）质子pKa从7下降到6，使酶在pH＝6时的活力提高10倍。工业用酶最佳pH的改变预示可带来巨大经济效益。蛋白工程还可对酶的催化活性、底物专一性、抗氧化性、热变性、碱变性等加以改变。由此可以看出蛋白工程的威力及其光辉前景。上述各例是通过对关键氨基酸残基的置换与增删进行蛋白工程的一类方法。另一类是以某个典型的折叠进行“从头设计”的方法。1988年杜邦公司宣布，成功设计并合成了由四段反平行α—螺旋组成为73个氨基残基的成果。这显示，按人们预期要求，通过从头设计以折叠成新蛋白的目标已是可望又可及了。预测结构的模型法，在奠定分子生物学基础时起过重大作用。蛋白的一级结构，包含着关于高级结构的信息这一点已日益明确。结合模型法，通过分子工程来预测高级结构，已成为人们所瞩目的问题了。
蛋白质工程汇集了当代分子生物学等学科的一些前沿领域的最新成就，它把核酸与蛋白质结合、蛋白质空间结构与生物功能结合起来研究。蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭新的时代，为蛋白质和酶在工业、农业和医药方面的应用开拓了诱人的前景。蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时期。