解放军文职招聘考试鱼类肠道中正常菌群的研究

 鱼类肠道中正常菌群的研究
时间：2008.06.10
前言：生物体肠道内存在各种各样的菌群，在实习中我们提取并培养了鱼肠道内的各种菌群，并坚定了其种类、形态及各种菌的产酶能力、运动性。
四种鱼肠道中的菌进行比较 其食性不同肠道中菌群种类不同 生活环境不同菌群种类也不同 并参考文献对其讨论。
研究方法：将不同种类鱼的肠子取出并捣碎，制成液体在无菌条件下将液体按一定倍数稀释后将不同倍数的稀释液接种到不同种类培养基中进行培养，之后观察分析培养基中各种菌的形态，特征进行坚定然后将不同菌种接种到四种培养基中观察其酶解能力。
研究内容：鱼肠道中各种菌群对正常德代谢有着重要作用，可产生消化酶的种类有：蛋白酶 脂肪酶 淀粉酶 纤维素酶等。消化酶的活性与生长阶段，健康状况的不同而有差异，同时也受水质 PH 盐度 温度等外界环境的影响。研究这些酶类，可用于指导筛选饲料配方，开发新的饲料源和合适的养殖条件。
材料准备：
（一）器材
1 培养皿（80套） 移液管（18个） 涂布器  样品处理瓶  剪 刀 镊用干热法灭菌
2 培养基：配置EMB培养基  改良MC培养基  孟加拉红培养基  VRB培养基
         营养琼脂培养基  半固体培养基   样品处理液（225ml）           无菌水（250ml）
用湿热法灭菌，各种培养基倒平板，样品稀释液分装20支大试管，半固体培养
基分装25个小试管。
（二）样品处理
1 采样  整个肠道   用乙醇给体表消毒后打开腹腔，取出肠道，消毒后再无菌室中操作，将肠道剪碎称取25g置于组织捣碎机中加入225ml样品处理液捣碎，制成液体。
2 接种  将样品液稀释不同倍数后，将不同浓度的菌液接种到不同培养基中，芽孢菌必须先煮沸，稀释后接种然后再30℃条件下培养48~72小时。
（二）计数和初步鉴定
将培养好的培养基中的细菌进行计数，记录结果，并进行初步鉴定，观察不同菌种的形态 特征和数量，以及在不同酶实验培养基的生长情况，挑取几种菌种制成装片，然后进行镜检，观察菌的形态特征，并通过酶实验培养基菌种的生长情况进行酶能力鉴定。
（三）产酶能力分析
1 蛋白酶：有透明水解环证明有产酶能力
2 淀粉酶：菌落上加入碘液，菌落周围不变蓝出现透明环的证明有产酶能力
3 脂肪酶：有红色水解的环证明有产酶能力
4 纤维素酶：菌落上加入5%的刚果红，染色5分钟后，再用5%的Nacl脱色1小时 ，若周围出现透明水解环证明有产酶能力。
（四）结果分析
1 鲤鱼  规格 ：体长36.8cm  体重2.6斤  肠道76.7cm
培养基 EMB VRB 营养琼脂 改良MC 孟加拉红 芽孢琼脂
种类 3 4 3 4 4 2
数目 192 多 30 多 13 60 3 3 10 2 2 1 27 1 2 多 26 4 多 3
菌落特征 菌落小表面隆起光滑粉色 菌落小表面隆起光滑兰紫色 菌落大光滑凸起有黄色 椭圆隆起光滑白色 圆光滑黄色 圆光滑钱紫色 圆光滑隆起粉红色 菌大粗糙隆起乳白色 菌大无规则黄色 菌小光滑隆起乳白色 菌大光滑凸起粉红色 菌大粗糙凸起黄绿色 菌大中间凹红色边缘白色 菌小光滑凸起白色 菌小圆形光滑粉红色 菌小椭圆光滑白色 菌大光滑凸起乳白 光滑凸起圆形红色 片状乳白色不透明 圆形光滑凸起
形态  短杆菌 短杆菌 杆状  球菌   短杆菌  链球菌 链球菌 杆状菌  杆状 链杆状 球菌 双杆菌 杆状 球菌
产酶能力  淀粉纤维素酶 蛋白淀粉纤维素酶 蛋白淀粉纤维素  蛋白淀粉纤维素   淀粉酶 淀粉脂肪纤维素酶 蛋白淀粉酶 蛋白淀粉纤维素   淀粉脂肪纤维素 蛋白脂肪淀粉酶 蛋白淀粉酶 蛋白淀粉纤维素 蛋白淀粉纤维素 淀粉脂肪酶
运动性  有 有 有  无   无 有 有 有   无 有 有 有 无 有
G+/G-  G+ G+ G-  G-   G+ G+ G+ G+   G- G+ G+ G+ G- G-
共鉴定出20种菌全部为细菌，杆菌1/2 双杆菌1/14  球菌3/14  链球菌2/14
 链杆菌1/4  有运动10/14  无运动4/14  阴性菌5/14  阳性菌9/14
产蛋白酶11/14  产淀粉酶13/14  产脂肪酶4/14  产纤维素酶9/14
2 黑鱼   规格  体长：32.5cm  体重1.98斤  肠道长53.8cm 
肠道菌共32个菌株
 杆菌 球菌 其他形态
G-
 
G+ 产蛋白酶 产纤维素酶 产脂肪酶 产淀粉酶 有运动性 无运动性
比例 10/16 4/16 2/16 4/16 12/16 6/16 5/16 3/16 13/16 12/16 4/16
3 鲢鱼  规格  体长：39.4cm 体重：2.01斤  肠道长：147.6cm
  共鉴定出鲢鱼肠道内菌株17种，其中2种真菌，15种细菌
 杆菌 球菌 其他形态
G-
 
G+ 产蛋白酶 产纤维素酶 产脂肪酶 产淀粉酶 有运动性 无运动性
比例 8/13 3/13 2/13 3/13 10/13 11/13 2/13 5/13 9/13 8/13 5/13
4 草鱼  规格  体长：   体重：  肠道长： 
肠道有明显前肠交分界，粗短后肠道细长。
培养基 EMB VRB 改良MC 营养琼脂 孟加拉红
种数 3 3 6 2 4
特征
 菌大光滑凸起绿色 菌大光滑凸起紫红色 光滑凸起 菌大光滑乳白色 菌大光滑凸起浅蓝色 菌大平滑白色 有毛菌大白色 黄色菌大光滑 菌小粉红光滑 菌大 扁平白色 菌小白色光滑 白色表面褶皱 菌大浅黄色平滑 菌小浅黄色平滑 有毛菌大 菌小白色表面褶皱 菌大光滑凸起红色 菌大光滑凸起有白色花边
数目 67 多 29 多 13 2 1 3 多 多 80 8 184 3 7 3 142 13
形态 短杆菌 短杆菌  杆状 杆状 球菌      短杆菌 球菌 短杆菌 杆菌 球菌 杆状 球菌
产酶能力 蛋白淀粉纤维素 蛋白淀粉脂肪纤维素  淀粉纤维素 脂肪淀粉酶 淀粉酶      蛋白淀粉纤维 蛋白脂肪酶 蛋白淀粉酶 蛋白脂肪酶 脂肪淀粉酶 蛋白纤维素酶
运动性 无 有  有 无 有      无 有 无 有 有 有
G+/G- G+ G+  G- G- G-      G+ G+ G+ G+ G+ G+
 特征 数目 形态 产酶 运动性 G+/G-
芽孢
培养基 大片光滑乳白色 多不可记 杆菌 蛋白酶
淀粉酶 有 G-
 桔黄色 1 球菌 蛋白淀粉脂肪酶 无 G+
在草鱼肠道中共鉴定出20种菌其中18种细菌2种真菌，并鉴定出2种形态的菌
杆菌 9/14  球菌5/14  有运动性8/13  无运动性5/13  阴性菌5/13 
阳性菌8/13  产蛋白酶9/13  产淀粉酶10/14  产脂肪酶5/13  产纤维素酶6/13
试验结论：
鲤鱼：1 肠道菌群中杆菌数目居多
      2 阴性菌多于无运动性菌
      3 有运动性菌种多于无运动性菌
      4 产淀粉酶>产蛋白酶>产纤维素酶>产脂肪酶
黑鱼：1 肠道菌中的杆菌多于其他菌
      2 阳性菌多于阴性菌
      3有运动性菌种多于无运动性菌
      4 产淀粉酶>产蛋白酶>产脂肪酶>产纤维素酶
鲢鱼：1肠道菌中的杆菌多于其他菌
      2阳性菌多于阴性菌
      3有运动性菌种多于无运动性菌
      4 产蛋白酶>产淀粉酶>产脂肪酶>产纤维素酶
草鱼：1肠道菌中的杆菌多于球菌数
      2阳性菌多于阴性菌
      3有运动性菌种多于无运动性菌
      4 产淀粉酶产>蛋白酶>产纤维素酶>产脂肪酶
根据上述分析：1 鱼类肠道以杆菌为主
              2 革兰氏阳性菌大于阴性菌
              3 运动性的菌多于无运动的菌，说明大多菌属于好养型或兼性厌氧型菌
              4 产淀粉酶能力：草鱼>鲢鱼>鲤鱼>黑鱼
                产蛋白酶能力：鲢鱼>鲤鱼>草鱼>黑鱼
                产脂肪酶能力：草鱼>鲢鱼>鲤鱼>黑鱼
                产纤维素酶能力：鲤鱼>草鱼>鲢鱼>黑鱼
5 黑鱼与草鱼比较：
黑鱼  产脂肪酶>产纤维素酶
草鱼  产纤维素酶>产脂肪酶
这说明两种鱼的食性是截然相反的，黑鱼为肉食性，草鱼为草食性
以上就是本次试验的总结，由于试验过程中难免出现错误所以请老师点评。
鱼类肠道菌群种类复杂多样我们所研究的只是一些浅淡的菌群，有待于我们更深入的去学习研究开发。
 
 
 
 
 
 
鱼类肠道细菌分析研究
——鲤鱼、鲢鱼、草鱼、乌醴肠道细菌的选择培养及鉴定
时间：２００８年０６月１５日
摘要： 本论文记述了鱼类肠道菌群的实验流程，实验结果，综合介绍了实验中四种鱼类的肠道菌群种类，形态以及各种菌的产酶能力、运动性，进一步对四种鱼类的肠道细菌进行了比较，并依据参考文献对各种肠道细菌进行了深入讨论。
关键词：四种不同食性鱼  肠道各种菌群  形态特征  产酶能力 运动性
研究方法：将不同四种鱼的肠道取出并捣碎，制成液体，并在无菌条件下操作，将其稀释一定倍数后接种到不同种类培养基上培养，观察分析培养基中各种菌的形态、特征、进行初步鉴定，然后再将培养基中不同种类的肠道再四种不同的培养基中接种，观察分析其产酶能力，在半固体培养基中穿刺观察其运动性。
内容：鱼类肠道中存在着各种菌群，这些细菌对鱼体的正常代谢有很重要的作用，由这些细菌主要可产生的消化酶有：蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶等，鱼类消化酶的活性随种类、生长阶段和健康状况的不同而有差异，同时也受水体、温度、ＰＨ、盐度等因素的影响，鱼类消化酶研究可用于知道筛选饲料配方，开发新的饲料和确定适宜的养殖条件。
动物体内微生态是一个及其复杂的体系，主要包括的微生物与宿主的免疫，营养生物的拮抗，急慢性感染有密切的联系，而动物体内含有微生物群最多的部分是肠道，肠道中微生物体系对维持肠道的微生态平衡有着深远的影响，因此，我们张开了对鱼类肠道正常菌群的分析，并对其中的优势菌株进行分离和鉴定，同时分析各菌群产酶能力和运动性等特征。
主要依据为○1选择性培养基就对大肠杆菌、乳酸菌、真菌等细菌的定性选择培养○2运用鉴别培养基对产酶能力进行分离鉴别○3革兰氏染色对细菌进行G+和G—的分辨○4芽孢染色分辨特殊菌群○5淀粉酶可分解培养基中的淀粉，用碘液进行检测，蛋白酶分解培养基中的酪蛋白，菌落周围产生一个透明环，纤维素酶可分解培养基中的纤维素，加入刚果红（5%）染色5min，再用5%Nacl脱色1h后观察周围是否有一个透明环，脂肪酶观察菌落周围是否有一个红色的环来判断产酶性。
 淡水鱼类肠道正常菌群，对鲤鱼、鲢鱼、草鱼、乌醴四种食性不同的鱼进行分析，有鱼食性不同，所以它们肠道中正常菌群也有一定的差距。分别对四种鱼的整个肠道取样，捣碎，采用稀释滴法对肠道稀释液进行接种，分别接种于选择性培养基尹红美蓝、改良MC、孟加拉红、琼脂、VRB以及营养琼脂上，进行定向培养，依次为：大肠杆菌群、乳酸细菌、真菌、G—菌和异养菌同芽孢细菌的选择。将培养基中的16中优势细菌接种鱼半固体培养基中对其运动性、对氧的需求和形态进行观察分析，并将这16中优势菌分别接种于含有酪蛋白，脂肪，纤维素，可溶性淀粉的鉴别培养基中，对其产酶能力进行分析。
研究材料与方法
1． 实验鱼类  鲤鱼、鲢鱼、草鱼、乌醴
2． 鱼样处理：
每种鱼取生活状态良好，体长、体重相近的三尾，对鱼体表面用酒精做消毒处理，在无菌条件下进行解剖，去出完整的肠道，用无菌水进行消毒，记录长度，在无菌工作台中将其剪碎，置于培养皿中，称出25g，再加入225ml样品处理液放入捣碎机中捣
配碎。
3． 选择性培养基的配制：
ＥＭＢ：选择培养大肠杆菌
改良ＭＣ：选择培养乳酸菌
孟加拉红：选择培养真菌
ＶＲＢ：选择培养Ｇ—
配制完成后，对其进行湿热灭菌，倒平板，配制鉴别运动性的半固体培养基。
４．选择性培养基对菌株的分离
（１）将肠道原液（１０-１）用生理盐水处理：去１ｍｌ原液置于９ｍｌ（灭菌生理盐水的大试管中，此时溶液的浓度是１０-２，将１０-２溶液摇匀，去１ｍｌ转入另一支试管中，得到稀释液１０-３，将１０-１、１０-２、１０-３三个浓度接种鱼改良ＭＣ、ＥＭＢ、孟加拉红培养基上进行培养。
（２）　上述方法将１０-１原液稀释为１０-２、１０-３、１０-４、１０-５、１０-６，将１０-３、１０-４、１０-５接种于ＶＲＢ培养基中（０．１ｍｌ），倒置培养，再把１０-４、１０-５、１０-６稀释液接种于营养琼脂（０.１ｍｌ）导致培养。
（３）将１０-１原液稀释倒１０-２，煮沸５ｍｉｎ，迅速冷却，分别稀释到１０-３.、１０-４，把１０-３、１０-２、１０-４稀释液接种鱼营养琼脂培养基上（０.１ｍｌ），倒置培养。再恒温２８摄氏度培养４８到７２小时。
５．半固体培养基对菌株运动性的鉴定
从上述培养基中选取１６中优势菌株或菌落特征明显的菌株用穿刺法接种鱼半固体培养基中，２８摄氏度恒温培养４８到７２小时。
６．鉴别培养基的配制
 (3)分析：在草鱼肠道中共鉴定出20中菌。2中真菌，18中细菌，大多形态为杆菌、球菌，其中杆菌占9/14，球菌占5/14,有运动性的占5/13,阳性菌占8/13，其产酶能力：产蛋白酶能力9/13，产淀粉酶10/13,产脂肪酶5/13，产纤维素酶6/13。
（一）鲤鱼
（1）规格 
体长：36.8cm  体重：2.6kg  肠道长：76.7cm
（2）观察结果：
培养基 营养琼脂(芽孢) VRB MC 孟加拉红 EMB 营养琼脂
种类 2 4 4 4 3 3
特种 片状
乳白色
不透明 圆形
光滑
突起 菌落小，椭圆型，光滑，黄色 圆形，表面隆起，光滑，黄色 圆形，表面隆起，光滑，浅紫色 圆形，光滑，凸起，粉红色 菌落大，光滑，凸起，粉红色 菌落大，粗糙，凸起，黄绿色 菌落大，中间凹陷，边缘乳白色中间红色 菌落小，光滑，凸起，白色 菌落小，圆形，光滑，粉红色 菌落小，椭圆形，光滑，凸起，白色 菌落大，光滑，凸起，乳白色 光滑，凸起，圆形，红
色 菌落小，表面隆起，光滑，粉红色 菌落小，表面隆起，光滑，蓝紫色 菌落大，光滑，凸起，有白点，黄色 菌落大，粗糙，凸起，乳白色 菌落无规则，黄色 菌落小，光滑，凸起，乳白色
数目 多不可
计 3 多不可
计 13 60 3 2 1 27 1 2 多不可
计 26 4 192 多不可
计 30 3 10 2
形态 杆状 球状 杆状  球菌  链球菌 链球菌 杆状 杆状 杆状 链球菌 球菌 双杆菌  短杆菌 短杆菌  短杆菌
产酶能力 蛋白酶，淀粉酶，纤维素酶 淀粉酶，脂肪酶 蛋白酶，淀粉酶，纤维素酶  蛋白酶，淀粉酶，纤维素酶  淀粉酶，脂肪酶，纤维素酶 蛋白酶，淀粉酶 蛋白酶，淀粉酶，纤维素酶  蛋白酶，脂肪酶，纤维素酶 蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶 蛋白酶，淀粉酶 蛋白酶，淀粉酶，纤维素酶  淀粉酶，纤维素酶 蛋白酶，淀粉酶，纤维素酶  淀粉酶
运动性 无 有 有  无  有 有 有  无 有 有 有  有 有  无
G+/G— G— G— G—  G—  G+ G+ G+  G— G+ G+ G+  G+  G+  G+
（3）分析
鲤鱼肠道中鉴定出20种菌，全部为细菌，杆菌占1/2 ，双杆菌占1/14，球菌占3/14 ，连杆菌占1/14，链球菌占2/14；
有运动性的占10/14，无运动性的占4/14；
阴性菌占5/14，阳性菌占9/14；
产蛋白酶的占11/14，产淀粉酶的占4/14，产脂肪酶的占4/14，产纤维素酶的占9/14；
(4) 结论
1. 肠道菌群中杆菌多于其他形态的菌
2. 肠道菌群中阳性菌多于阴性菌
3. 肠道菌群中有运动性的菌多于无运动型的菌
4. 产酶能力：产淀粉酶> 产蛋白酶>产纤维素酶>产脂肪酶
（二）黑鱼
1. 规格：　
体长：３２.５ｃｍ　　体重：１.98斤  肠道长： 53.8 cm
观察结果及分析：
杆菌
 球菌 其他形态 G+ G-  产蛋白酶 产淀粉酶 产脂肪酶 产纤维素酶 有运动性 无运动性
10/16 4/16 2/16 12/16 4/16 6/16 13/16 5/16 3/16 12/16 4/16
（三）鲢鱼  规格  体长：39.4cm 体重：2.01斤  肠道长：147.6cm
  共鉴定出鲢鱼肠道内菌株17种，其中2种真菌，15种细菌
 杆菌 球菌 其他形态
G-
 
G+ 产蛋白酶 产纤维素酶 产脂肪酶 产淀粉酶 有运动性 无运动性
比例 8/13 3/13 2/13 3/13 10/13 11/13 2/13 5/13 9/13 8/13 5/13
（四） 草鱼  规格  体长：   体重：  肠道长： 
肠道有明显前肠交分界，粗短后肠道细长。
培养基 EMB VRB 改良MC 营养琼脂 孟加拉红
种数 3 3 6 2 4
特征
 菌大光滑凸起绿色 菌大光滑凸起紫红色 光滑凸起 菌大光滑乳白色 菌大光滑凸起浅蓝色 菌大平滑白色 有毛菌大白色 黄色菌大光滑 菌小粉红光滑 菌大 扁平白色 菌小白色光滑 白色表面褶皱 菌大浅黄色平滑 菌小浅黄色平滑 有毛菌大 菌小白色表面褶皱 菌大光滑凸起红色 菌大光滑凸起有白色花边
数目 67 多 29 多 13 2 1 3 多 多 80 8 184 3 7 3 142 13
形态 短杆菌 短杆菌  杆状 杆状 球菌      短杆菌 球菌 短杆菌 杆菌 球菌 杆状 球菌
产酶能力 蛋白淀粉纤维素 蛋白淀粉脂肪纤维素  淀粉纤维素 脂肪淀粉酶 淀粉酶      蛋白淀粉纤维 蛋白脂肪酶 蛋白淀粉酶 蛋白脂肪酶 脂肪淀粉酶 蛋白纤维素酶
运动性 无 有  有 无 有      无 有 无 有 有 有
G+/G- G+ G+  G- G- G-      G+ G+ G+ G+ G+ G+
 特征 数目 形态 产酶 运动性 G+/G-
芽孢
培养基 大片光滑乳白色 多不可记 杆菌 蛋白酶
淀粉酶 有 G-
 桔黄色 1 球菌 蛋白淀粉脂肪酶 无 G+
在草鱼肠道中共鉴定出20种菌其中18种细菌2种真菌，并鉴定出2种形态的菌
杆菌 9/14  球菌5/14  有运动性8/13  无运动性5/13  阴性菌5/13 
阳性菌8/13  产蛋白酶9/13  产淀粉酶10/14  产脂肪酶5/13  产纤维素酶6/13
试验结论：
鲤鱼：1 肠道菌群中杆菌数目居多
      2 阴性菌多于无运动性菌
      3 有运动性菌种多于无运动性菌
      4 产淀粉酶>产蛋白酶>产纤维素酶>产脂肪酶
黑鱼：1 肠道菌中的杆菌多于其他菌
      2 阳性菌多于阴性菌
      3有运动性菌种多于无运动性菌
      4 产淀粉酶>产蛋白酶>产脂肪酶>产纤维素酶
鲢鱼：1肠道菌中的杆菌多于其他菌
      2阳性菌多于阴性菌
      3有运动性菌种多于无运动性菌
      4 产蛋白酶>产淀粉酶>产脂肪酶>产纤维素酶
草鱼：1肠道菌中的杆菌多于球菌数
      2阳性菌多于阴性菌
      3有运动性菌种多于无运动性菌
      4 产淀粉酶产>蛋白酶>产纤维素酶>产脂肪酶
根据上述分析：1 鱼类肠道以杆菌为主
              2 革兰氏阳性菌大于阴性菌
              3 运动性的菌多于无运动的菌，说明大多菌属于好养型或兼性厌氧型菌
              4 产淀粉酶能力：草鱼>鲢鱼>鲤鱼>黑鱼
                产蛋白酶能力：鲢鱼>鲤鱼>草鱼>黑鱼
                产脂肪酶能力：草鱼>鲢鱼>鲤鱼>黑鱼
                产纤维素酶能力：鲤鱼>草鱼>鲢鱼>黑鱼
5 黑鱼与草鱼比较：
黑鱼  产脂肪酶>产纤维素酶
草鱼  产纤维素酶>产脂肪酶
这说明两种鱼的食性是截然相反的，黑鱼为肉食性，草鱼为草食性
六、综合分析
通过对以上四种鱼的综合整理分析可知，各种鱼类因食性、种类、生长度以及温度、PH的影响，使其肠道中菌群的数量、产酶能力、运动性、G+/G-各有不同，但是，肠道中都存在四种消化酶，即产淀粉酶、产脂肪酶、产纤维素酶以及产蛋白酶，因鱼的食性不同，产酶能力也有所不同。
参考资料
《鲤科鱼肠道菌分布及共生关系研究》（赵志新、谭远德 著）
《鱼类消化道菌群的作用与影响因素研究进展》（曹来安、甘淳等 著）