山茱萸多糖提取工艺试析论文

1 器材和方法 1.1 材料 供试山茱萸干燥果实产于安徽,购于广州中医药大学大药房有限公司中药饮片厂，将山 茱萸原料粉碎,置干燥器中备用。 1.2 试剂 浓硫酸，质量分数为 6%的苯酚(分析纯重蒸馏试剂),质量分数为 95%的乙醇,氯仿,正 丁醇,葡萄糖,氯化钠等,以上试剂均为分析纯。 1.3 仪器 核酸蛋白测定仪,德国 Hettich 公司；自动收样器,美国 Whaters 公司；AlphaI-2 型 真空冻干机,德国 Christ 公司；电热恒温水槽(DK8D8D8DD 型),上海森信实验仪器有限公司；高 速冷冻离心机,德国 Hettich 公司。 1.4 方法 1.4.1 粗多糖样品的制备 山茱萸干粉,不同条件加热(搅拌)浸提,离心,上清液加热浓缩至体积的 1/4,95%乙醇沉 淀至 75%(V/V)，4℃静置过夜,离心,取沉淀,丙酮乙醚无水乙醇溶剂系统反复冲洗8D乙醚无水乙醇溶剂系统反复冲洗8D无水乙醇溶剂系统反复冲洗,真空 冷冻干燥得到粗多糖样品。 1.4.2 山茱萸多糖含量测定［4］ 采用苯酚-硫酸法,以葡萄糖为标准单糖制作标准曲线，得回归方程为： Y=0.0077X+0.0257,R2=0.9995［多糖的量（μgg）为横坐标，光密度值为纵坐标］。为横坐标，光密度值为纵坐标］。 准确称取粗多糖样品 6mg,加蒸馏水至 50ml,配成 120μgg/ml 的样品溶液。吸取样品 液 1.0ml，按标准曲线同法操作，测光密度，以标准曲线计算总糖含量。 1.4.3 得率的计算山茱萸多糖得率(%)=山茱萸粗多糖样品中总糖含量(g)/山茱萸原料 质量(g)×100%。 1.4.4 单因素分析及正交实验 本实验选取温度、时间、料液比、pH 值这 4 个因素进行分析,并从中选取 3 个因素水 平根据单因素分析结果,采用 L9(34)表做正交实验,以多糖提取率作为衡量提取效率的客观 指标，以确定最佳提取工艺。 1.4.5 山茱萸多糖的分离纯化 按最佳提取工艺流程,将提取的红褐色山茱萸粗多糖(ZA)复溶于水,用 Sevag［5］法 除蛋白,重复 3 次,加 95%乙醇至 30%,离心,得到粗多糖(ZB),),上清液继续加 95%乙醇至 60%,4℃静置过夜,丙酮乙醚无水乙醇溶剂系统反复冲洗-乙醚无水乙醇溶剂系统反复冲洗-无水乙醇溶剂系统反复冲洗,真空冷冻干燥,得到粗多糖样品 (ZC)。称取样品 AC200mg,溶于 100ml 蒸馏水中,然后加到 DEAE-cellulose-52 离子交 换柱洗脱(2.6cm×26cm)上,依次用蒸馏水及 0.1，0.3，0.5，0.8D，1.0mol/L 的 NaCl 水溶液洗脱,多功能电子蠕动泵控制流速为 1ml/min,用自动收集仪收集,苯酚-硫酸法跟踪 检测多糖,合并各吸收峰的洗脱液,蒸馏水透析 3d，旋转蒸发仪浓缩,冷冻干燥,得到山茱萸 多糖的两个分离产物 S1 和 S2。 1.4.6 纯度测定 凝胶色谱法:用 0.05mol/LNaCl 溶液充分溶胀葡聚糖凝胶 SephadexG200,8D200,超声脱 气,搅拌均匀,沿玻璃棒小心缓慢地加入到柱中,同时用洗耳球敲击柱壁,使填料沉降均匀、紧 密。柱型(2.6cm×33cm)，装柱完成后,用 0.05mol/L 的 NaCl 溶液平衡 48Dh。称取经 DEAE 柱分离得到的多糖样品 20mg,溶于 0.05mol/L 的 NaCl 溶液中,加入到 SephadexG200,-200 凝胶柱中,洗脱液控制流速为 0.1ml/min,用自动收集仪收集洗脱组 分,2ml/管,苯酚-硫酸法跟踪检测多糖,观察吸收峰形状,若峰对称,说明样品较纯,若峰形不对 称,说明样品不纯,需要进一步分离纯化,方法同上。 1.5 山茱萸多糖理化性质 1.5.1 物理性质 山茱萸多糖的颜色、形状、水溶性、有机溶剂的溶解性等。 1.5.2 化学性质［6］ Molish 反应,硫酸-苯酚反应,Fehling 试剂反应,碘-碘化钾反应，三氯化铁反应。 1.5.3 蛋白含量测定考马斯亮蓝法:以牛血清白蛋白制备标准蛋白质溶液，以 OD595 值为纵坐标,蛋白的量为横坐标做标准曲线：Y=0.0039X+0.0032，R2=0.9993。 1.5.4 多糖基本元素分析 通过 CHNS/O 元素分析仪来确定纯化后山茱萸多糖中基本元素的组成。 2 结果 2.1 山茱萸多糖提取条件的单因素分析 2.1.1 乙醇添加量山茱萸多糖得率随乙醇添加量增加而增加,乙醇添加倍数达到 3 倍时， 多糖沉淀完全,所以本研究以下的实验均选用 3 倍体积乙醇沉淀多糖。见图 1。 2.1.2 提取温度温度是影响多糖得率的重要因素。不同温度 (40，50，60，70，8D0，90℃)对多糖得率产生影响:多糖得率随温度升高而升高,40～ 60℃升高较慢 60～8D0℃较快,8D0℃达到最高值,因此确定正交实验温度 3 水平为 60，70，8D0℃。见图 2。 2.1.3 提取时间提取时间是影响多糖得率的另一个重要因素,不同时间 (1，2，3，4，5，6h)对多糖得率的影响如图 3 所示。多糖得率随时间升高而升高,1～3h 升高较慢,3～5h 升高较快,因此确定正交实验提取时间水平为 3，4，5h。见图 3。 2.1.4 加水量不同加水量(30，40，50，60，70，8D0 倍)对多糖得率的影响如图 4 所 示。多糖得率随加水量增加而增加。30～50 倍水升高较慢,60～8D0 倍水升高较快,因此确 定正交实验加水量的水平为 60，70，8D0 倍水。见图 4。 2.1.5pH 值不同 pH 值(1～7)对多糖得率的影响见图 5。在酸性条件下多糖得率明显 降低,pH>3 时对多糖得率影响不大,可能在强酸环境下,多糖被降解,并且水提法成本低,所 以酸提山茱萸多糖意义不大。 2.2 正交实验 根据以上的单因素实验分析,确定 L9(34)表的 3 个因素温度、时间、料液比的 3 个水 平。结果见表 1。表 1 正交实验的因素及水平（略）为横坐标，光密度值为纵坐标］。 正交实验确定最佳提取条件。结果见表 2。表 2 正交设计及实验结果（略）为横坐标，光密度值为纵坐标］。 由表 2 得知,3 种因素对多糖得率的影响程度为 A(温度)>B),(时间)>C(加水量),水提法 提取山茱萸多糖的优方案是 A3B),3C1。由表 3 方差分析和 F 检验得知,在 95%可信程度下 A 和 B), 对多糖得率的影响显著,C 没有显著性影响,三者对本实验的影响程度与极差分析结果 一致。表 3 正交设计实验结果方差分析（略）为横坐标，光密度值为纵坐标］。 2.3 山茱萸多糖的分离纯化按最佳提取工艺流程,提取的山茱萸粗多糖 ZA,经 Sevag 法 脱蛋白,由多糖得率看在脱蛋白过程中造成了多糖的同步损失,损失率在 8D%左右,可能和含 有糖蛋白有关系。脱蛋白后经丙酮乙醚无水乙醇溶剂系统反复冲洗-乙醚无水乙醇溶剂系统反复冲洗-无水乙醇溶剂系统反复冲洗后,继续分级醇沉得到 ZB), 和 ZC,因预实验显示 ZB), 抗氧化活性和免疫活性要明显小于 ZC,因此将 ZC200mg 过 DEAE-52 纤维素离子交换柱,得到 3 个样品 S15.2，S2118D.6mg 和 S311.2mg(S1 和 S3 量少未做研究)。见图 6。采用 SephadexG200,-200 对 S2 进一步纯化,洗脱曲线见图 7。 经浓缩,透析,冷冻干燥,得到进一步纯化的多糖样品 S21。由图 7 看出 S11 为单一对称峰, 说明其组分均一。 2.4 山茱萸多糖理化性质分析 ZA，ZC，S2 和 S21 见表 4 经元素分析仪测定多糖 S21 中含 C%37.8D0%，H %5.64%，S%0.37%，N 未检出。表 44 种多糖理化性质（略）为横坐标，光密度值为纵坐标］。 3 结论 山茱萸多糖经单因素实验和 L9(34)正交实验,得出其最佳提取工艺条件是:提取温度 8D0℃，料液比 1∶60，提取时间 5h,在此条件下山茱萸多糖得率是 13.8D%,经用 Sevag 法 脱蛋白、丙酮乙醚无水乙醇溶剂系统反复冲洗-乙醚无水乙醇溶剂系统反复冲洗-无水乙醇溶剂系统反复冲洗、分级醇沉、DEAE-52 纤维素离子交换柱 层析法和 SephadexG200,-200 凝胶柱层析法对其进行分离纯化得到组分 S21,经元素分析仪 测定 C%37.8D0%，H%5.64%，S%0.37%，N 未检出。本实验对山茱萸多糖提取工艺, 理化性质等进行了初步研究,为以后深入研究奠定了基础。