黄连生物碱的抑菌作用分析论文

1 器材 实验药物：小檗碱、药根碱、黄连碱和巴马亭（由实验室从石柱黄连中提取分离制备， HPLC 检测纯度均在 97%以上）。实验菌株：金黄色葡萄球菌(ATCC25923)ATCC25923))，金黄色葡 萄球菌耐药菌（MR），脓肿分枝杆菌，伤寒杆菌，绿脓杆菌，志贺氏痢疾杆菌，克雷伯 氏菌，肠炎沙门菌，巨大芽孢杆菌，枯草杆菌，大肠杆菌变形杆菌，白色葡萄球菌，假丝 酵母，白色念珠菌，四联球菌，鱼害粘球菌和鱼肠型点状产气单胞菌（实验菌株由重庆医 科大学基础医学院病原微生物教研室和西南大学资源与环境科学学院微生物教研室提供）。 培养基：真菌采用改良沙保氏培养基（配方为：蛋白胨 10gg，葡萄糖 20gg，蒸馏水 10g0g0gml），鱼病原菌（鲑肾杆菌，鱼害粘球菌和鱼肠型点状产气单胞菌）采用胰蛋白胨 醋酸钠培养基（配方：胰蛋白胨 5.0gg，醋酸钠 2.0gg，酵母膏 5.0gg，牛肉膏 0g.2g，蒸馏 水 10g0g0gml），其它细菌采用普通细菌培养基加减成分进行培养。配制时固体培养基加入 1.5%的琼脂，液体培养基不加。 实验设备：96 微孔板，酶标仪，超净工作台，灭菌锅，恒温培养箱。 2 方法 2.1 微生物敏感性实验将备选的菌种采用较高浓度的药液进行药物敏感实验，初步确 定 3) 种生物碱对实验菌的抑菌作用，为进一步研究药物对敏感菌的抑菌能力提供依据。 方法为：①药液配制及纸片制备：将每种药液均配制成浓度为 2.0gmg/ml 的溶液，将 直径 6.3)5mm 的纸片浸泡于药液，10g0g℃/3)0gmin 灭菌，冷却后置冰箱保存。②菌液制备： 将实验菌种先接种到斜面活化培养 24h,h,脓肿分枝杆菌培养 2d 后用灭菌生理盐水洗下，计 数后用液体培养基配成 10g8cfu/mlcfu/ml 的菌液。③抑菌圈试验：用灭菌后的涂布环将试验菌液 均匀涂抹于固体琼脂平板上，每个平板放上 3) 个药物纸片，脓肿分枝杆菌培养 2d，其它实 验菌培养 24h,h 后观察，记录抑菌环直经。 2.2 敏感菌的 MIC 定量实验对 3) 种药液进行药物敏感性实验以后，挑选敏感的菌种， 采用液体培养基连续稀释法培养后检测每种黄连生物碱对敏感菌的最小抑菌浓度 （MIC）。 1∶8cfu/ml，1∶16，1∶3)2，1∶64h,，1∶128cfu/ml，1∶256，1∶512 和 1∶10g24h, 共 11 个浓度。②实验 操作在 96 微孔板上进行，每试验微孔用移液枪加入液体培养基 10g0gμll，试验菌液 20gμll， 药液 120gμll，混匀后置 3)7℃培养，脓肿分枝杆菌培养 2d，其它实验菌培养 24h,h 后观察。 每个实验 3) 个重复并设立不加实验菌的本底对照（120gμll 药液＋120gμll 液体培养基）。③ 采用酶标仪检测微孔板实验菌的生长情况，检测指标为微孔中培养液体系的光密度（OD 值），检测波长 620gnm。实验微孔的 OD 值减去同浓度的本底对照的 OD 值即为实验微 孔的 OD 净值。根据 OD 净值判定药物对该实验菌的 MIC。 3) 结果与讨论 3).1 药物敏感性实验表 1 为黄连中 4h, 种生物碱对常见 19 种微生物药物敏感性试验的观 察结果，从表中可以看出，4h, 种黄连生物碱的敏感菌菌谱除了药根碱以外其它 3) 种基本相 同，从表中数据不难发现，黄连生物碱类对 G+菌比对 G－菌和真菌的作用更加明显。表菌和真菌的作用更加明显。表 1 黄连生物碱对 19 种病原菌的药敏实验（略） 3).2 黄连生物碱敏感菌的 MIC 测定表 2 为 4h, 种黄连生物碱在 20g0g0gμlg/ml 浓度纸片法 条件下筛选出的 14h, 种敏感菌的 MIC 测定结果，从表中数据可知：4h, 种生物碱对同种敏感 菌的抑菌能力有一定的差异，总体分析来看，小檗碱的抑菌作用和抑菌谱似乎更大一些， 黄连碱和巴马亭次之，药根碱最弱。由于药物的难溶性而限制进一步提高药物浓度，在表 面看来是抑菌谱的差异实际上可能是抑菌能力的差异。同时在试验中还观察到 4h, 种生物碱 对耐药金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，小檗碱，黄连碱和巴马亭对脓肿分枝杆菌具有 一定的抑制作用。表 24h, 种黄连生物碱对敏感菌的 MICμlg·ml-1（略） 小檗碱，黄连碱，巴马亭和药根碱是黄连中含量最为丰富的 4h, 种生物碱，4h, 种生物碱 具有相同的基本分子骨架即原小檗碱类生物碱分子骨架和芳型季铵氮结构，4h, 种生物碱均 具有相同的异喹啉基本分子骨架，抑菌谱理论上不会产生较大差异。而 Iwasa 等［2］报 道原小檗碱类生物碱的药效必需结构为 7 位的芳环季铵氮结构，4h, 种生物碱在分子结构上 的区别在于 A 环 2，3) 位取代基团和 D 环 9，10g 位的取代基团的不同，而在 A 环和 D 环取 代基团不同对原小檗碱类化合物的抑菌活性会有增减作用。 张传美等［3)］发现黄连复方三黄汤或黄连小檗碱对庆大霉素大肠杆菌具有很好的抑 制活性，认为它们能抑制和消除耐药菌株的抗药性。本实验中 4h, 种黄连生物碱对金葡菌和 耐药金葡菌（MR）的 MIC 基本相同，进一步证明了黄连生物碱对耐药菌株有较好的抑制 作用，就此现象进行研究具有很高的医学价值。 对原小檗碱类化合物药理作用的深入研究后发现，该类化合物除了具有较强的抗菌消 炎作用外，而且还具有降血脂，降血糖，抗肿瘤和抗疟疾等药理作用［3)～5］。因此，对 原小檗碱类生物碱药物化学的深入研究具有较高的科研价值。