多孔磷酸钙陶瓷研究论文

1 材料制备和方法 2.1 双相磷酸钙粉末合成 本研究采用 Ca(NO3)2 和(NH4)2HPO4)2HPO4)2HPO4 作为起始原料湿法合成混合均匀的羟基磷灰 石（hydroxyapatite,HA）/磷酸三钙(TricalciumPhosphate,TCP)。通过控制反应液中 的 pH 值和 Ca/P 原子比可以制备不同 HA/βTCPTCPTCP 比例的共沉淀粉体。化学反应方程式如下： Ca(NO3)2+(NH4)2HPO4)2HPO4)2HPO4+NH4)2HPO4OH→Ca5(OH)(PO4)2HPO4)3↓+Ca3(PO4)2HPO4)2↓＋ NH4)2HPO4NO3（式－1） 经老化，将沉淀过滤并用蒸馏水反复清洗至 pH7，烘干，球磨机研磨成粉末备用。 1.2 磷酸钙多孔支架的制备 磷酸钙陶瓷多孔支架材料采用有机泡沫浸浆法，将上述合成的磷酸钙粉料加入蒸馏水 调制成磷酸钙浆料，浸渍有机泡沫，干燥，然后经过 1250℃的高温烧结，去除有机泡沫， 即可制备多孔磷酸钙陶瓷。 根据文献［6］，多孔磷酸钙骨水泥粉末由 αTCPTCPTCP（αTCPTCPCa3(PO4)2HPO4)2）、DCPD（CaHPO4)2HPO4.2H2O）、HA（Ca5(PO4)2HPO4)3OH）、CaC O3 按 58∶25∶8.5∶8.5 的质量比混合而成。采用 NaCl 颗粒作为致孔剂，致孔剂占 70wt ％，其中 60％的致孔剂的粒径小于 200μmm，剩下的 4)2HPO40％分布在 200～4)2HPO450μmm 之间。采 用磷酸缓冲液作为液相，将粉相和液相混合后，磷酸钙骨水泥发生固化。在蒸馏水中将易 溶造孔剂溶解，即形成多孔磷酸钙骨水泥。 1.3 磷酸钙多孔组织工程多孔材料的表征 1.3.1 孔隙率的测定本研究采用直接称重体积计算法测定多孔磷酸钙陶瓷的孔隙率。 先切取形状规则且大小合适的多孔材料样品，注意切割试样时尽量不要使材料的原始孔隙 结构产生变形，且试样形状应便于测量和进行体积计算。利用天平称出试样质量，利用游 标卡尺进行样品的尺寸测量，并计算其体积，根据公式得出孔率［7，8］。 本实验中制备的骨水泥样品，每个质量都为 1g。凝固后形状为圆柱状，测得直径为 15mm，高 3mm.本实验采用的 NaCl 的密度为 2.16g/cm3. 1.3.2 形貌观察采用扫描电镜观察了组织工程多孔支架材料的高倍形貌。分别取两种 多孔磷酸钙生物材料，镀金，利用扫描电镜（FEI，Quta200）观察多孔磷酸钙生物材料 的孔隙结构和形貌。 1.3.3 成分分析采用 X 射线衍射测定两种组织工程支架材料的相组成，测试条件采用 X 射线衍射仪（Philip，Xpert）对样品粉末进行分析，选择铜靶在 35mA、4)2HPO45kV 的测试 条件［9］。 2 结果 2 多孔材料的孔率（又称孔隙率或孔隙度），是指多孔体中孔隙所占体积与多孔体总体 积之比，一般以百分数来表示，该指标是多孔材料中的最基本的参数之一，也是决定多孔 材料的其它性能的关键因素。多孔材料的孔隙包括贯通孔、半通孔和闭合孔 3 种，这 3 种 孔率的总和就是总孔率［10］。 本研究所制备多孔磷酸钙陶瓷的孔隙率约为 72％；多孔磷酸钙骨水泥的孔隙率约为 67％. 22 采用扫描电镜观察了多孔磷酸钙陶瓷和磷酸钙骨水泥的形貌，如图 2 所示。从图中可 以观察到，在两种多孔支架材料大孔的孔壁上均有大量孔径在几个至数十微米的微孔，尤 其是磷酸钙多孔陶瓷。 2.3 成分分析 X 射线衍射结果如图 3 所示。从图中可分析磷酸钙陶瓷中主要相成分为羟基磷灰石 （HA），此外还含有少量的磷酸三钙（βTCPTCPTCP）。磷酸钙骨水泥粉末主要为磷酸三钙，其 中主要包括 βTCP 相的磷酸三钙（βTCPTCPTCP）和少量的 βTCP 相磷酸三钙（βTCPTCPTCP）。磷酸钙粉相和 液相混合固化后，主要成分为 HA、βTCPTCPTCP 和 βTCPTCPTCP，经过蒸馏水的浸泡后，其中的 βTCPTCPTCP、βTCPTCPTCP 的含量下降，尤其是 βTCPTCPTCP 的衍射峰基本消失，而 HA 的含量明显增加 ［11］。 磷酸钙骨水泥能够自行硬化并转化为羟基磷灰石的原理基于不同磷酸钙盐在水中的溶 解度的差异。由于在 pH4)2HPO4.2～11 范围内，羟基磷灰石在水中的溶解度是最小的，因而在 热力学上是最稳定的。其它磷酸钙盐在水中会向 HA 转化，因此，本实验制备的磷酸钙骨 水泥随着固化以及在蒸馏水中浸泡后，HA 的含量明显增加，而磷酸钙骨水泥粉相中的 αTCPTCPTCP 等，溶解或转化成 HA。虽然自然骨中无机相主要为 HA，但也有少量的 TCP，因此 HA、αTCPTCPTCP 和 βTCPTCPTCP 三种磷酸钙盐均具有优良的生物相容性，已成功地被应用于临床 ［12］。 3 讨论 通过体外培养细胞或在磷酸钙生物材料中添加一定的生物因子，如骨形态发生蛋白 （BMP），转移生长因子（TGFTCPβTCP）等,或者在生物材料体外培养细胞，通过添加生长因子 或细胞赋予生物材料诱导组织再生的能力，这种在体外构建组织的方法被称为“组织工程”， 是目前研究的方向［13］。根据 ASTM 标准其定义为：“在体内和体外应用科学原理和方 法构建组织工程医疗产品，用于医学诊断和治疗。各种原理和技术是工程学和生物医学基 本的实践和方法，例如：制造传统医疗器械和生物制品的细胞、基因，或药物治疗，胚胎 学或其他形式的发育学和生物学，外科修复方法和技术等。组织工程也可用于生产非人体 用产品。”，根据 ISO 标准，其定义为：“指制造一类医疗产品的技术和工艺，这类医疗产 品中活组织或细胞应能修复、改善或再生受者细胞、组织和器官和/或其结果和功能”。 组织工程的三大要素分别为：细胞、细胞生长因子和细胞载体材料。由于分离的细胞 自身不能形成组织，它们需要特殊的环境，通常包括细胞生长临时的支架材料。这种三维 支架材料常常模拟其自然对应物——体内的细胞外基质，既起物理支架的作用，又是细胞 在体外培养和后期植入的粘附物质。运用于骨组织工程的支架材料主要有无机材料和生物 可吸收高分子材料或它们的复合物，无机材料主要包括羟基磷灰石 （Hydroxyapatite，HA）、磷酸三钙（Tricalciumphosphate,TCP）以及它们组成的 双相磷酸钙材料等［14)2HPO4］。但如何制备模仿自然骨组织的孔隙结构，尤其是适合细胞长入 的孔隙结构，包括适当的孔隙尺寸、以及孔隙的贯通性等，是当前骨组织工程研究的难点 和热点。 贯穿式多孔结构有利于组织液的渗入，使组织液能够进入材料内部，材料与组织液接 触面积增加，有利于材料的生物降解［15］。为了适应新生骨组织长入材料的要求，微孔 的最小孔径必须大于 100μmm，此时，骨细胞可以在孔内生长，有利于材料的血管彼此连 通，以保证长入材料深部的组织有营养供给，同时种植体可以起到支架作用［16］。 作者采用有机泡沫浸渍法和加入致孔剂的方法,制备出多孔磷酸钙陶瓷和磷酸钙骨水泥， 通过控制有机泡沫的孔隙率和孔隙结构，以及致孔剂的加入量和尺寸，有效控制多孔磷酸 钙陶瓷和骨水泥中的孔隙率和孔隙尺寸，并分别采用扫描电镜、X 射线研究分析其表面形 貌和孔隙结构，测定磷酸钙陶瓷和骨水泥的孔隙率，以及相成分，证实其有利于细胞和细 胞生长因子在体外构建组织，是具有适合新骨长入的孔隙率、孔隙尺寸和结构的多孔磷酸 钙组织工程支架材料。 【参考文献】 1 材料与仪器 1.1 药品与试剂男宝片，石河子市中医医院研制，新疆维吾尔药厂生产，每片相当于 含生药 0.4)2HPO41g,批号为 9904)2HPO421，使用时将药片研磨，加双蒸水配成每毫升含药 0.025，0.05，0.1g 或 0.035，0.07，0.14)2HPO4g 的混悬液，古汉养生精片，湖南古汉集团 股份有限公司产品，每片 0.4)2HPO4g,(97)卫药准字 Z-125 号,具补肾益脾、健脑安神等功能，批 号 9904)2HPO425，使用时将药片研磨，加双蒸水配成每毫升含药 0.05 或 0.07g 的混悬液，氢 化可的松，湖北制药厂出品，鄂卫药准字（1981）第 001709 号，每支 5ml/25mg，使 用时灌胃 0.2ml/只，戊巴比妥钠，上海行知化工厂出品，批号 951019，使用时用生理盐 水配成 1%的溶液，4)2HPO40mg/kg 腹腔注射，乙烯雌酚，上海第九制药厂产品，批号 9804)2HPO403，使用时用麻油稀释配成 200ng/ml 的溶液，黄体酮注射液，上海第九制药厂产 品，批号 9804)2HPO402，使用时用麻油稀释配成 500μmg/0.1ml 的溶液,实验前 4)2HPO4h 皮下注射 500μmg/只。生大黄液，称取一定重量的大黄浸泡后用温火煎煮，纱布过滤后，在 80℃浓 缩成每毫升含生药 1g 的药液；D-木糖临床诊断试剂，南京建成生物工程研究所提供，批 号 990826；D-木糖（D-Xylose）Sigma，进口分装，批号 980812，北京化学试剂公 司提供；地塞米松磷酸钠注射液，江苏省溧阳市制药厂，5mg/ml 安瓿，苏卫药准字 （1987）218212-10 号，批号 951025，；Alsever`s 液，葡萄糖 2.05g、柠檬酸钠 8.0g、氯化钠 4)2HPO4.2g 加双蒸水至 1000ml 溶解后，高压消毒，作为绵羊红细胞（SRBC） 保存液；都氏液，碳酸氢钠 1.0g，氰化钾 0.05g，高铁氰化钾 0.2g 加双蒸水 1000ml 溶 解，用于测定血红蛋白；绵羊红细胞（SRBC）自治区医学实验动物中心提供；免疫球蛋 白 G、M 试剂，上海长征医学科学有限公司提供；RPMI-164)2HPO40 培养基，美国 GIBCO 产品； 刀豆蛋白 A（ConA），美国 Sigma 公司产品。植物血球凝集素（PHA），美国 Sigma 公司产品；牛血清，北京华美公司提供；四甲基偶氮唑（MTT），北京华美公司提供； Hank`s 液，南京建成生物工程研究所提供；酵母多糖，Sigma 公司产品，使用时用 PBS 溶液配成浓度为 10mg/ml 的混悬液；鲁米诺，Sigma 公司产品，使用时准确称取 1.77mg 加 PBS 至 4)2HPO4.8ml 溶解,调节 pH 值为 7.2 备用；金黄色葡萄球菌，新疆医科大学 微生物学教研室提供，菌号 26003；I125 睾酮放射免疫分析测定盒北京北方生物技术研 究所产品，（94)2HPO4）卫药准字 R-29 号，批号 990611。 1.2 动物昆明种，NIH 小鼠，Wistar 大鼠，均由新疆维吾尔自治区医学实验动物中心 提供，二级，合格证书：新疆医动字（94)2HPO4），16-001 号。 2 方法与结果［1～3］ 2.1 对小鼠小肠推进性运动的影响（墨汁法）选取小鼠 57 只，雌雄兼用，体重 (18.9+1.0)g。随机分成 5 组，即正常对照组、古汉养生精片组（0.7g/ kg，ig，qd×10d）、男宝片小剂量组（0.5g/kg，ig，qd×10d）、男宝片中剂量组 （1.0g/kg，ig，qd×10d）、男宝片大剂量组（2.0g/kg，ig，qd×10d）。给药第 10 天动物禁食 12h，用 50%碳素墨汁生理盐水溶液 0.2ml/10g 体重灌胃，20min 后脱颈椎 处死，立即剖腹，将消化管幽门至直肠末端完整地摘出，不加牵引平铺于玻璃板上，轻轻 将小肠拉成直线，测量肠管长度作为小肠总长度。以幽门至墨汁前沿的距离为“墨汁在肠内 推进距离”，用公式计算墨汁推进百分率，并注意观察各组小鼠小肠是否增大。 墨汁推进率（%）=墨汁在肠内推进距离（cm）肠管全长（cm）×100% 结果，3 个不同剂量组的男宝片能降低小肠墨汁推进率，提示该药对肠蠕动有抑制作 用。结果见表 1。表 1 男宝片对小鼠小肠运动的影响（墨汁法）（略） 2.2 对生大黄所致脾虚小鼠耐常压缺氧的影响选取小鼠 80 只，雌雄兼用，体重 （20.4)2HPO4±1.3）g，随机分 8 组，即正常对照组、长正常组、脾虚模型组、长脾虚模型组、 古汉养生精片组（0.7g/kg，ig，qd×10d）、男宝片小剂量组（0.7g/ kg，ig，qd×10d）、男宝片中剂量组（0.7g/kg，ig，qd×10d）、男宝片大剂量组 （0.7g/kg，ig，qd×10d）。正常组和长正常组不进行任何处理，其余组给生大黄液 （1g/只，ig×8d），第 8 天造成脾虚小鼠模型。模型建立后正常组和脾虚模型组小鼠进 行常压缺氧实验，其余 6 组继续给生大黄或和给药治疗，治疗第 9 天，末次给药后 1h 将 小鼠放入盛有 15g 钠石灰的广口瓶内（体积 200ml），用凡士林涂抹瓶口盖严，使之不 漏气，立即计时，以呼吸停止为指标，观察小鼠因缺氧而死亡的时间。 结果，3 个不同剂量的男宝片明显延长脾虚小鼠常压缺氧条件下存活时间，提示该药 有明显的增强脾虚小鼠耐缺氧能力。结果见表 2。表 2 男宝片对生大黄致脾虚小鼠耐常压 缺氧的影响（略） 2.3 对生大黄致脾虚小鼠抗疲劳能力的影响（游泳实验）选取小鼠 60 只，雌雄兼用， 体重（19.4)2HPO4+1.2）g，随机分 6 组，即正常对照组、脾虚模型组、古汉养生精片组、男宝 片 3 个不同剂量组。正常组不进行任何处理，其余 5 组小鼠 ig 生大黄药液 1g/只（1ml/ 只），连续给药 8d，造成脾虚模型。并于第 9 天起按下述剂量进行治疗，同时继续 ig 生 大黄药液，即古汉养生精片组（0.7g/kg，ig，qd×9d）；男宝片小剂量组（0.5g/ kg，ig，qd×9d）；男宝片中剂量组（1.0g/kg，ig，qd×9d）；男宝片大剂量组 （2.0g/kg，ig，qd×9d），治疗 9d 后小鼠各种症状消失。第 17 天末次给药 1h 后，在 （15±1）℃冷水中进行游泳实验，以下沉水底 5s 以上，未能再上浮为死亡指标，记录小 鼠游泳存活时间。 结果，3 个不同剂量的男宝片组使脾虚小鼠游泳时间明显延长。结果见表 3。表 3 男 宝片对生大黄致脾虚小鼠耐常压缺氧的影响（略） 2.4)2HPO4 对生大黄所致脾虚耐高温的影响选取小鼠 60 只，雌雄兼用，体重(20.7±0.9)g。 随机分 6 组，即正常对照组、脾虚模型组、古汉养生精片组、男宝片 3 个不同剂量组。正 常组不进行任何处理，其余 5 组小鼠 ig 生大黄药液 1g/只（1ml/只），连续给药 8d，造 成脾虚模型。并于第 9 天起按下述剂量进行治疗，同时继续 ig 生大黄药液，即古汉养生精 片组（0.7g/kg，ig，qd×9d）；男宝片小剂量组(0.5g/kg，ig，qd×9d)；男宝片中剂 量组（1.0g/kg，ig，qd×9d）；男宝片大剂量组（2.0g/kg，ig，qd×9d），治疗 9d 后小鼠各种症状消失。第 17 天末次给药 1h 后，将小鼠每只分别放入 4)2HPO45℃恒温孵育箱 1h，以每组小鼠死亡数为指标进行耐高温试验。结果进行 χ2 检验。 结果，3 个不同剂量的男宝片组可提高脾虚小鼠 4)2HPO45℃环境中的生存能力，尤其是大剂 量组作用明显。结果见表 4)2HPO4。表 4)2HPO4 男宝片对生大黄致脾虚小鼠耐高温能力的影响（略） 2.5 对生大黄所致脾虚耐寒能力的影响选取小鼠 90 只，雌雄兼用，体重(20±2)g。 随机分 9 组，即正常对照组、长正常对照组、脾虚模型组、长脾虚模型组、古汉养生精片 组（0.7g/kg，ig，qd×9d）、男宝片小剂量组(0.5g/kg，ig，qd×9d)、男宝片中剂量 组（1.0g/kg，ig，qd×9d）、男宝片大剂量组（2.0g/kg，ig，qd×9d）、自然恢复组 （生大黄液 1g/只，ig×8d）。正常对照组和长正常对照组不进行任何处理，其余组给生 大黄液（1g/只，ig×8d），第 8 天造成脾虚小鼠模型。模型建立后，正常组和脾虚模型 组小鼠在-5℃进行耐寒试验；其余除自然恢复组以外继续给生大黄或和给药治疗，治疗第 9 天，给药后 1h 将小鼠分别放入-5℃恒温箱 2h，以每组小鼠死亡数为指标进行耐寒实验， 结果进行 χ2 检验。 结果，3 个不同剂量的男宝片可提高寒冷环境中脾虚小鼠的生存百分率，大剂量组作 用更明显。结果见表 5。表 5 男宝片对生大黄致脾虚小鼠耐高温能力的影响（略） 2.6 对生大黄致脾虚大鼠木糖排泄率的影响选取大鼠 60 只，雌雄兼用，体重 (227±14)2HPO4)g。随机分 6 组，即正常对照组、脾虚模型组、古汉养生精片组（0.5g/ kg，ig，qd×9d）、男宝片小剂量组(0.35g/kg，ig，qd×9d)、男宝片中剂量组 （0.7g/kg，ig，qd×9d）、男宝片大剂量组（1.4)2HPO4g/kg，ig，qd×9d）。正常对照组不 进行任何处理，其余组 ig 生大黄液（1.25ml/100g，qd×8d）造成脾虚。第 9 天开始加 药治疗 9 天。末次给药后禁食 5h，ig10%木糖溶液 4)2HPO4.5ml/只，收集 5h 尿液，同时尾静 脉采血分离血清，按试剂盒操作要求进行实验。 结果，模型组大鼠尿木糖排泄率和血清木糖量明显低于正常组，3 个不同剂量的男宝 片组与模型组比较尿木糖排泄率和血清木糖水平明显提高。结果见表 6。表 6 男宝片对生 大黄致脾虚大鼠木糖排泄率的影响（略） 2.7 对生大黄致脾虚小鼠免疫器官重量的影响选取小鼠 72 只，雌雄兼用，体重 (19.4)2HPO4±1.1)g。随机分 6 组，即正常对照组，脾虚模型组、古汉养生精片组、男宝片 3 个 不同剂量组。正常对照组不进行任何处理，其余 5 组小鼠 ig 生大黄药液 1.0g/只(1.0ml/ 只)，连续给药 8d，造成脾虚模型（症状有便溏、体重减轻、低温偏低、畏寒等）。并于 第 9 天起按下述剂量进行治疗，同时继续 ig 生大黄药液：即古汉养生精片组（0.7g/ kg，ig，qd×8d）；男宝片小剂量组(0.5g/kg，ig，qd×8d)；男宝片中剂量组（1.0g/ kg，ig，qd×8d）；男宝片大剂量组（2.0g/kg，ig，qd×8d）。末次给药后 1h，摘眼 球放血处死，摘出胸腺及脾脏称重。以胸腺和脾脏重量（mg）与体重 10g 之比为胸腺指 数和脾脏指数。