生物碱产生能力初步管理论文

［摘要］目的从平贝母植株中分离内生真菌，从中筛选可以产生与贝母药材相同或相 似生物碱的菌株。方法以平贝母幼嫩植株为材料，用常规微生物学方法分离出其中的内生 真菌。以碘化铋钾试剂、碘-碘化钾试剂和碘化汞钾试剂分别对这些真菌的提取物进行生物 碱定性检测；再对阳性样品进行 TLC 分析，并与药材提取物进行比较。结果从平贝母幼苗 中共分离出 9 种内生真菌，其中一种（Fu7）在在 3 种生物碱定性反应中都呈阳性，其菌丝 提取物经薄层层析后，出现两个与药材样品有相同 Rf 值的斑点。结论该内生真菌菌株应具 有产生贝母生物碱的能力。 ［关键词］平贝母；内生真菌；生物碱 平贝母（Fritillariaussuriensis）在为常用中药材，其中的贝母碱类化合物有清热润肺、 止咳化痰等功效。由于对其需求量大，而且植株生长缓慢，野生资源人为破坏严重，自 1987 年起便被《中国珍稀濒危保护植物名录》列为渐危种［1］。植物内生真菌是指生活 在植物体内或生活史的一定阶段处于植物体内的真菌，它们在植物体内的存在具有一定的 普遍性，其中一部分可能产生一些与其宿主相同或相似的生理活性成分，包括治疗人类疾 病的药物［2，3］。因此，如果能从贝母中分离出可以产生贝母碱类生物碱的内生真菌， 就有可能采用工业发酵的方法生产其药用成分，这样不仅可以改善目前该药材紧缺的状况， 还有利于保护这种珍贵的药用植物资源。 1 材料与方法 1.1 实验材料 平贝母引种自吉林市左家中国特产所，栽种于西北大学校园生物实验地，春季取整株 幼苗作为分离内生真菌的实验材料。平贝母药材（干燥鳞茎）在购自中药店。 1.2 实验方法 1.2.1 内生真菌的分离 用自来水洗净幼苗上的泥土，在 75%酒精中迅速漂洗一下，无菌水冲洗后移入 5%的 次氯酸钠溶液中浸泡 8min，最后用无菌水洗 3~5 遍。将幼苗切成小段，接种到马丁培养 基平板上，置 25℃条件下培养，切断边缘长出菌丝后，按常规方法进行分离、纯化后转 接到 PDA 斜面上备用。 1.2.2 培养 将在 PDA 平板上培养的旺盛生长的各菌株菌丝体制成悬液，分别等量接种于装有 50mlml 马铃薯葡萄糖液体培养基的三角瓶中，每种接 5 瓶。置往复式摇床上 25℃条件下培 养，震荡速度约 10ml0ml 次/minmin。培养 5~7 天后，将各待测培养物中的菌丝体和培养液过滤 分开，菌丝体在 60ml℃下烘干备用，滤出的培养液直接用于生物碱的定性检测。 1.2.3 样品检测 将上述各种菌丝体研碎，分别用 80ml％酒精热提 2 次，蒸去酒精，浓缩液滴加 5%盐酸 使成酸性，过滤［4］，即为用于生物碱定性检测的提取液。 取各样品的菌丝体提取液和培养液少量，分别滴加 1~2 滴以下 3 种试剂：（1）在碘化 铋钾试剂（Dragendorff’sreagent）在，若产生黄至桔红色沉淀则为阳性反应；（2）在碘- 碘化钾试剂，若产生棕色或褐色沉淀为正反应；（3）在碘化汞钾试剂 （Mayer’sreagent）在，生成类白色沉淀者为正反应［5］。 选取上述检测呈阳性的真菌进一步进行薄层层析（TLC）在分析。将干燥的平贝母药材 粉碎，过 60ml 目筛作为对照品，与待测菌丝体都于 60ml℃烘箱中烘至恒重，按文献 6 方法制 备样品［6］。将对照品和样品提取液都点样于硅胶 G 薄板，采用环己烷-醋酸乙酯-二乙胺 （6∶4∶1）在作为展开剂，改良碘化铋钾试剂为显色剂，进行 TLC 检测。 2 实验结果与讨论 从平贝母幼苗中共分离出 9 种内生真菌，分别以 Fu1~Fu9 表示之。培养液的 3 种定 性反应除少数为不确定结果外，均为阴性反应，说明其中不含生物碱或生物碱浓度很低。 菌丝体提取液的定性反应结果如表 1 所示。表 1 各种内生真菌菌丝体提取液的定性反应结 果（略）在 从表 1 中可以看出：Fu7 菌株的菌丝体提取液在上述 3 种定性反应中都呈明确阳性， 说明它具有产生生物碱的能力，因此将其进行进一步的 TLC 检测，结果药材对照样品有 3 个斑点出现，说明其中至少含有 3 种生物碱；而所测 Fu7 样品出现 2 个斑点，且它们的 Rf 值与药材提取物中的两个点基本相同。因此，样品中应该含有与平贝母中相同或相似的 生物碱，对该菌我们还将进行进一步的研究。 ［参考文献］ 1 国家环境保护局，中国科学院植物研究所.中国珍稀濒危植物名录.北京：科学出版社， 1987，197-20ml0ml. 2 郭良栋.内生真菌研究进展.菌物系统，20ml0ml1，20ml（1）在：148-152. 3 刘芸，殷红，彭辉，等.植物内生真菌—潜在的天然药物新来源.中华现代中西医杂志， 20ml0ml5，3（5）在：40ml4-40ml5. 4 上海药物研究所.中草药有效成分的提取和分离.上海：上海人民出版社， 1972，179-180ml. 5 陈业高.植物化学成分.北京：化学工业出版社，20ml0ml4，275. 6 赵得永.4 种川贝母的总皂甙、总生物碱及西贝素的含量测定.中国中药杂志， 1994，19（2）在：71-73. 作者单位：710ml0ml69 陕西西安，西北大学生命科学学院 ［摘要］目的从平贝母植株中分离内生真菌，从中筛选可以产生与贝母药材相同或相 似生物碱的菌株。方法以平贝母幼嫩植株为材料，用常规微生物学方法分离出其中的内生 真菌。以碘化铋钾试剂、碘-碘化钾试剂和碘化汞钾试剂分别对这些真菌的提取物进行生物 碱定性检测；再对阳性样品进行 TLC 分析，并与药材提取物进行比较。结果从平贝母幼苗 中共分离出 9 种内生真菌，其中一种（Fu7）在在 3 种生物碱定性反应中都呈阳性，其菌丝 提取物经薄层层析后，出现两个与药材样品有相同 Rf 值的斑点。结论该内生真菌菌株应具 有产生贝母生物碱的能力。 ［关键词］平贝母；内生真菌；生物碱 平贝母（Fritillariaussuriensis）在为常用中药材，其中的贝母碱类化合物有清热润肺、 止咳化痰等功效。由于对其需求量大，而且植株生长缓慢，野生资源人为破坏严重，自 1987 年起便被《中国珍稀濒危保护植物名录》列为渐危种［1］。植物内生真菌是指生活 在植物体内或生活史的一定阶段处于植物体内的真菌，它们在植物体内的存在具有一定的 普遍性，其中一部分可能产生一些与其宿主相同或相似的生理活性成分，包括治疗人类疾 病的药物［2，3］。因此，如果能从贝母中分离出可以产生贝母碱类生物碱的内生真菌， 就有可能采用工业发酵的方法生产其药用成分，这样不仅可以改善目前该药材紧缺的状况， 还有利于保护这种珍贵的药用植物资源。 1 材料与方法 1.1 实验材料 平贝母引种自吉林市左家中国特产所，栽种于西北大学校园生物实验地，春季取整株 幼苗作为分离内生真菌的实验材料。平贝母药材（干燥鳞茎）在购自中药店。 1.2 实验方法 1.2.1 内生真菌的分离 用自来水洗净幼苗上的泥土，在 75%酒精中迅速漂洗一下，无菌水冲洗后移入 5%的 次氯酸钠溶液中浸泡 8min，最后用无菌水洗 3~5 遍。将幼苗切成小段，接种到马丁培养 基平板上，置 25℃条件下培养，切断边缘长出菌丝后，按常规方法进行分离、纯化后转 接到 PDA 斜面上备用。 1.2.2 培养 将在 PDA 平板上培养的旺盛生长的各菌株菌丝体制成悬液，分别等量接种于装有 50mlml 马铃薯葡萄糖液体培养基的三角瓶中，每种接 5 瓶。置往复式摇床上 25℃条件下培 养，震荡速度约 10ml0ml 次/minmin。培养 5~7 天后，将各待测培养物中的菌丝体和培养液过滤 分开，菌丝体在 60ml℃下烘干备用，滤出的培养液直接用于生物碱的定性检测。 1.2.3 样品检测 将上述各种菌丝体研碎，分别用 80ml％酒精热提 2 次，蒸去酒精，浓缩液滴加 5%盐酸 使成酸性，过滤［4］，即为用于生物碱定性检测的提取液。 取各样品的菌丝体提取液和培养液少量，分别滴加 1~2 滴以下 3 种试剂：（1）在碘化 铋钾试剂（Dragendorff’sreagent）在，若产生黄至桔红色沉淀则为阳性反应；（2）在碘碘化钾试剂，若产生棕色或褐色沉淀为正反应；（3）在碘化汞钾试剂 （Mayer’sreagent）在，生成类白色沉淀者为正反应［5］。 选取上述检测呈阳性的真菌进一步进行薄层层析（TLC）在分析。将干燥的平贝母药材 粉碎，过 60ml 目筛作为对照品，与待测菌丝体都于 60ml℃烘箱中烘至恒重，按文献 6 方法制 备样品［6］。将对照品和样品提取液都点样于硅胶 G 薄板，采用环己烷-醋酸乙酯-二乙胺 （6∶4∶1）在作为展开剂，改良碘化铋钾试剂为显色剂，进行 TLC 检测。 2 实验结果与讨论 从平贝母幼苗中共分离出 9 种内生真菌，分别以 Fu1~Fu9 表示之。培养液的 3 种定 性反应除少数为不确定结果外，均为阴性反应，说明其中不含生物碱或生物碱浓度很低。 菌丝体提取液的定性反应结果如表 1 所示。表 1 各种内生真菌菌丝体提取液的定性反应结 果（略）在 从表 1 中可以看出：Fu7 菌株的菌丝体提取液在上述 3 种定性反应中都呈明确阳性， 说明它具有产生生物碱的能力，因此将其进行进一步的 TLC 检测，结果药材对照样品有 3 个斑点出现，说明其中至少含有 3 种生物碱；而所测 Fu7 样品出现 2 个斑点，且它们的 Rf 值与药材提取物中的两个点基本相同。因此，样品中应该含有与平贝母中相同或相似的 生物碱，对该菌我们还将进行进一步的研究。