血红素加氧酶分析论文

【关键词】血红素加氧酶 [关键词]血红素加氧酶 1；心脏疾病；文献综述 人类在进化过程中一种适应性变化就是能够抵御外界氧化损伤而保持自身稳定。超氧 化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶和一些非酶类物质维生素 E、维生素 C 在抵御外界 氧化损伤中都起了重要作用，还有鲜为人知的血红素加氧酶（HO）在应激条件下保持细胞在应激条件下保持细胞 的稳定性也至关重要。HO 基因缺失的个体不能正常生长并且对氧化损伤的敏感性增加， 直至最后死亡[1]。HO 是血红素氧化的限速酶，在体内有 3 种同工酶，HO1、HO2 和 HO3，分别由不同的基因编码，其氨基酸序列的同源性 HO1 与 HO2 之间是 40%，HO2 与 HO3 是 90%。他们在分子结构、表达调节和组织分布中有很大差异。HO1 为诱导型而 HO2 为构成型。HO 的第 3 种亚型 HO3 最近才被发现，与 HO2 结构相似,但对血红素的 分解功能较弱。HO1 在组织氧化损伤的病理条件下起着保护细胞作用，而 HO2 则起着生 理性调节作用[2]。目前研究主要集中在对 HO1 的基因表达、调控以及与疾病的关系等方 面。 1HO1 的一般生物学特性与功能 HO1 也称之为热休克蛋白 32（HSP32）在应激条件下保持细胞，是目前研究最多的一种同工酶。相对分子 质量为 32000，染色体定位 22q12，在细胞中定位于微粒体，诱导性表达于肝、脾、心、 肺、血管平滑肌、脑等组织，诱导因素为应激、缺氧、内毒素、过氧化氢、重金属、紫外 线、细胞因子、生长因子等。作为血红素降解的限速酶，HO1 降解由衰老或破损的红细胞 释放出血红素，首先生成胆绿素、一氧化碳(CO)CO)和 Fe2+，然后胆绿素在胆绿素还原酶作 用下转换成胆红素，Fe2+诱导并参与了体内铁蛋白的合成。在血红素降解过程中需要烟 酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）在应激条件下保持细胞供氢并消耗 O2。以往认为血红素代谢产物不仅对机 体无益，过量时还可对机体造成损害。如游离胆红素如果不能和葡萄糖醛酸充分结合并排 出体外，就容易透过血脑屏障对神经系统造成损伤；Fe2+可产生活性羟基引起严重的氧 化应激，导致细胞膜损坏和组织的损伤[3]；而 CO 和血红蛋白结合后可造成组织缺氧。随 着研究深入，人们对 HO1 及其催化产物在机体中的作用有了更深入的了解。首先 HO1 分 解血红素，避免了血红素对细胞的损伤，催化过程中消耗了 O2，减少了氧自由基生成。 其次 HO1 的催化产物铁蛋白、CO、胆红素在氧化应激中起着保护组织细胞的作用，其中 铁蛋白可降低细胞内 Fe2+的浓度[4]，同时 HO1 还可以上调内质网上的 Fe2+通道，促 进细胞内 Fe2+泵出[5]，防止由 Fe2+介导的氧化应激损伤；胆红素作为 HO1 的代谢产 物，能有效地清除氧自由基，防止细胞脂质层过氧化，而且游离胆红素比结合胆红素更能 有效地抑制低密度脂蛋白分解[6]；CO 可以促使血管舒张，其机制为 CO 和 NO 一样可以 活化鸟甘酸环化酶，使三磷酸鸟嘌呤核苷（GTP）在应激条件下保持细胞转化成环磷酸鸟甙（cGMP）在应激条件下保持细胞，使血管 舒张；CO 还可以通过刺激平滑肌细胞膜上的 K+通道促使血管舒张，以及抑制缩血管内皮 素(CO)ET1)的释放所引起的血管收缩[7]。另外，CO 还通过鸟甘酸环化酶活化 P38 有始分裂 原活化 MAPK 信号转导途径，既可抑制炎症因子的基因表达，又可促进抗炎因子的产生来 抑制炎症反应[8]。除此以外，CO 还有防止血管平滑肌细胞过度增生、抗血小板聚集、抗 凋亡等作用。 2HO1 的诱导与表达 调控 HO1 可以被许多不同种类的因素所诱导，这些因素的共同特点是都能引起氧化 应激，并通过有丝分裂原活化 MAPK、蛋白激酶 C、cAMP 依赖性蛋白激酶 A、cGMP 依 赖性蛋白激酶 G 等不同的信号途径来诱导 HO1 基因表达。研究表明，HO1 基因表达调控 主要在转录水平上，HO1 启动子区域包含不同的顺式反应元件,包括激活蛋白 1(CO)AP1)结合 位点、金属反应元件、抗氧化反应元件、热休克和血红素反应元件等，转录因子如氧化应 激反应转录因子 NFκBB 和 AP1 等与这些特殊元件结合可导致 HO1 基因激活。但 HO1 基因 调控在不同细胞种类和物种之间有很大差异，如在大鼠 HO1 的启动子上有热休克反应元 件，热休克可促使热休克核因子聚集到相应的基因片段使 HO1 基因稳定。但在人类，两 者结合则会引起 HO1 基因的表达[9]。目前研究最多的转录因子是激活蛋白因子 1（AP1）在应激条件下保持细胞家族，其中 NFE2 相关因子 2（Nrf2）在应激条件下保持细胞最为重要。Nrf2 可以和 HO1 基因抗氧化 反应片段结合，调节相关基因，在氧化应激细胞反应中起重要作用。动物试验证实在小鼠 HO1 基因的增强区有一 10bp 序列，被称为应激反应元件（StR Ｅ）在应激条件下保持细胞，对于缺氧以外各种 因子引起的应激反应非常重要，StRE 中包含了 AP1 家族结合位点，两者结合可诱导 HO1 基因表达，而 StRE 突变会使 HO1 基因在应激状况下不能被活化，显示了 AP1 蛋白在 HO1 基因表达调控中的作用。其他转录因子如低氧诱导因子 1（HIF1）在应激条件下保持细胞，在与 HO1 基因 相应片段结合后可诱导缺氧状况下的 HO1 基因表达[10]。HIF1 在含氧量正常情况下也可 被一些受体介导因子如生长因子、细胞因子所诱导，但效应远低于低氧因素，低氧可以通 过 MAPK 或磷脂酰肌醇 3 激酶信号通道介导 HIF1 蛋白合成[11]。 3HO1 与心血管系统 3．1HO1 与冠状动脉疾病（CAD）在应激条件下保持细胞早在 1994 年 Schwertner 等[12]第一次发现了 血浆中胆红素的浓度与 CAD 的发病率成显著负相关，这个重要发现提示血浆中的胆红素浓 度低于正常可能会导致缺血性心脏疾病的发生。随后，Hopkins 等也注意到有家族性 CAD 的病人血浆中的胆红素浓度明显低于无家族史的病人。Hunt 等进一步证实遗传性胆 红素浓度降低病人早期易患 CAD。另外人们发现胆红素血浆浓度与许多 CAD 的危险因素 如吸烟、低密度脂蛋白、糖尿病、肥胖呈负相关，与 CAD 保护性因素高密度脂蛋白呈正相 关。但即使消除了 CAD 的危险因素，胆红素血浆浓度降低仍易导致 CAD,表明了血浆中的 胆红素浓度直接与 CAD 相关。CAD 与氧自由基生成、脂质过氧化、动脉粥样硬化以及炎 症有关[1314]。血管动脉粥样硬化主要是因为低密度脂蛋白氧化并被内皮巨噬细胞吞噬后 形成了富含脂质的泡沫状细胞。而胆红素能防止脂蛋白特别是低密度脂蛋白氧化，从而阻 止动脉粥样硬化斑块形成。同时胆红素能清除氧自由基和与炎症有关的过氧化氢，保护心 肌细胞膜免受氧化损伤。HO1 还可通过其他途径来影响 CAD 的发生。如 HO1 分解血红蛋 白（Heme）在应激条件下保持细胞，减少了 Heme 对心肌细胞的氧化损伤；产生的 CO 可通过活化鸟甘酸环化 酶增加平滑肌细胞内的 cGMP，使冠脉平滑肌舒张，还可抑制血小板聚集和血管平滑肌增 生；HO1 促使铁蛋白合成增加也消除了由细胞内铁引起的细胞损伤和慢性炎症。总之， HO1 及其代谢产物可通过不同的途径降低 CAD 发病的危险性。 3．2 心脏缺血再灌注损伤随着心脏移植、体外循环、冠脉搭桥、冠脉介入治疗应用于 临床，缺血再灌注损伤已引起医学界的高度重视。动物实验显示，氧自由基、钙超载、心 肌纤维能量代谢障碍、血管内皮细胞、一氧化氮、中性粒细胞、细胞黏附分子和细胞凋亡 等均可能参与再灌注损伤的发病过程。而 HO1 作为抗氧化应激的蛋白酶，它在心肌缺血 及随后的再灌注损伤中的作用也越来越受到人们关注。Clark 等[6]发现在心肌缺血前 24h 用氯高铁血红素(CO)HO1 诱导剂)预处理，再灌注后心肌功能较对照组有显著改善，而且在 HO1 高表达的区域，线粒体完整性保存较好，心肌梗死面积明显缩小。氯高铁血红素预处 理是否影响其他热休克蛋白（HSP）在应激条件下保持细胞的水平或触发其他的心肌保护机制还缺乏试验证实， 但用 HO1 抑制剂后即使再用氯高铁血红素预处理，心肌缺血再灌注损伤依然没有加重 [15]，表明 HO1 与心肌缺血再灌注损伤程度有直接联系。同样，Vulapalli 等研究 HO1 在缺血再灌注心肌保护中的作用时发现，在心肌细胞中选择性表达 HO1 的转基因小鼠能 有效防止缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡，而且 HO1 高表达并没有影响到其他细胞保护 性基因如 HO2、HSP90 的表达，这进一步证实了 HO1 在缺血再灌注中直接的心肌细胞保 护作用。除了 HO1 在催化中消耗 O2，减少了氧自由基形成以及 HO1 的催化产物胆红素 的抗细胞氧化作用外，对于 HO1 催化产物 CO 在缺血再灌注损伤中的保护作用，Yet 等 [16]发现 CO 可以阻止炎性细胞浸润，减少炎性渗出。作用机制可能是 CO 抑制细胞间黏 附因子 1(CO)VCAM1)、血管细胞黏附因子 1（ICAM1）在应激条件下保持细胞基因的表达，阻碍了中性粒细胞在血 管壁上的黏附、渗出和浸润，减少了炎性反应对心肌细胞的损害。CO 舒张血管作用提高 了再灌注心肌的血流，也可以减轻再灌注心肌的损伤。心肌缺血再灌注引起的氧化和炎症 反应必然会导致心肌细胞的坏死和凋亡而造成心肌功能损害。Soares 等[17]证实 HO1 过 度表达可以抑制由肿瘤坏死因子（TNFα）在应激条件下保持细胞引起的内皮细胞凋亡。Vulapalli 等[18]的试验 结果也证实了 HO1 的抗调亡作用，但抗调亡机制尚不清楚，推测除了 HO1 的催化产物胆 红素和 CO 的抗氧化、抗炎作用抑制了引起细胞凋亡的因素外，HO1 还促进抗凋亡基因 Bcl2、抑制促凋亡基因 caspase3 的表达，提示 HO1 与凋亡相关基因之间的传导途径可 为减轻缺血再灌注所造成的心肌损伤提供更有效的方法。 3．3 心肌重构以往人们认为心肌重构是由血压或容量负荷增加引起心室壁应力的适应 性变化，包括心肌细胞体积增大，心肌胶原蛋白合成增加。尽管开始是一种心脏功能代偿 机制，但病理性心脏肥大逐渐发展最终会导致充血性心力衰竭。在心脏重构过程中，心肌 不断对细胞外刺激如机械应激、缺血、氧自由基、生长因子、血管活性肽、激素等作出反 应，心肌细胞体积不断增大，胶原蛋白合成增加最终导致心力衰竭。有研究人员发现， HO1 过表达能减轻 Wister 大鼠由血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）在应激条件下保持细胞引起的心肌肥厚，但不能缓解由 AngⅡ 引起的高血压[19]。这个发现提示 AngⅡ 引起的心肌重构可能并非直接继发于 AngⅡ 引起的高血压，HO1 可能直接作用于心肌组织而非通过血压调控机制来减轻心肌重构。 Hu 等认为由 AngⅡ 诱导产生的活性氧簇作为刺激心肌生长的信号分子而非由 AngⅡ 引起的 血压增高，在心肌重构中起了主要作用。而 HO1 的催化产物胆红素清除活性氧和抗氧化 作用，可以抑制活性氧簇引起的心肌重构。这种假设和早期研究抗氧化可以抑制心肌重构 的试验结果相吻合。总之，活性氧被认为是一种生长刺激因素的信使，明确活性氧在心肌 重构时的传导途径，用 HO1 作为基因治疗手段，可以为临床治疗心脏损伤后的心肌重构 提供一种新的方法。 4 小结与展望 HO1 性质、功能与调控已日益引起人们的关注。大量研究表明 HO1 对氧化损伤所引 起多种疾病具有保护作用。HO1 催化血红素降解的 3 个产物 CO、胆红素和铁蛋白是发挥 细胞保护作用的关键分子。虽然每个产物独自作用时都有保护作用，但是细胞保护作用主 要是三者协同作用的结果。当应激发生时，适量 HO1 的诱导产生，能维护细胞自身稳定， 实现对细胞的保护。目前加拿大研究人员利用经改造过的病毒为载体，把额外的 HO1 基 因副本释放到实验鼠的心脏组织，使其在缺血、缺氧情况下能迅速地制造出大量的 HO1 蛋白，以减轻心脏病发作对心肌的损伤。目前对 HO1 的研究已有很大进展，但 HO1 的分 子结构、催化反应机制、调控系统尚未得到很好了解，有待进一步探索；3 种降解产物之 间的相互作用关系还知之甚少。进一步探索 HO1 以及血红素催化产物的细胞保护机制、 HO1 生成量调控已成为下一步研究的重点。相信在不久的将来，HO1 将会成为一种有效 的治疗药物应用于临床。 【关键词】氟西汀;细胞培养;海马神经元;大鼠 氟西汀是 5-羟色胺（5-HT）在应激条件下保持细胞再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除 有抗抑郁作用外，尚可治疗其他中枢神经系统疾病。有研究表明，氟西汀对海马的神经保 护作用是其发挥抗抑郁效应的机制之一［1］。关于氟西汀对体外培养的海马神经元生长 的影响未见报道，本研究初步探讨了氟西汀对原代培养的海马神经元生长的影响。 1 材料与方法 1.1 新生大鼠海马神经元的分离和培养 技术方法在参考文献［2］基础上加以改进。取出生 24h 内的新生 SD 大鼠（东南大 学医学院动物实验中心提供）在应激条件下保持细胞，无菌分离出双侧海马，用显微剪剪碎，D-Hank''''s 液清洗 2 或 3 次，将剪碎的海马组织转移至离心管中，加入等量 0.25%的胰酶（美国 Sigma 公 司）在应激条件下保持细胞，37℃消化 30min，中间振摇 1 或 2 次，加入 10%的 DMEM/F12（美国 Gibco 公 司）在应激条件下保持细胞5ml，轻轻吹打 15 次，然后 1000r·min-1 离心 5min，制成单细胞悬液，置于 CO2 培养箱（德国 Heraeus 公司产品）在应激条件下保持细胞中，差速贴壁 30min，去除成纤维细胞，吸取未贴壁 的细胞，并用 200 目的不锈钢滤网过滤，收集过滤后的单细胞悬液于培养皿中，然后至离 心管中，取一滴单细胞悬液进行计数，并用 DMEM/F12 将细胞密度调到 1×106ml-1，然 后接种于 200μg·ml-1g·ml-1 多聚赖氨酸（美国 Sigma 公司）在应激条件下保持细胞包被的 6 孔培养板中，转移至培 养箱内培养，4h 后换为无血清培养基，即含 2%B27 的 Neurobasl 培养基（美国 Gibco 公司）在应激条件下保持细胞，以后每 3 天半量换液 1 次。使用培养 6d 的神经元进行染色鉴定。 1.2 大鼠海马神经元的鉴定 1.2.1 烯醇化酶（NSE）在应激条件下保持细胞免疫细胞化学染色 取培养 6d6 孔培养板中的盖玻片进行神经元特异的 NSE 免疫组织化学染色。弃去培 养液，4%多聚甲醛室温固定 1h，加入 0.3%H2O2 甲醇去除内源性过氧化氢酶， 0.1%TritonX-100 破膜，10%绵羊血清封闭，加入一抗 1∶200 兔抗鼠 NSE 抗体，4℃湿 盒过夜，0.01mmol·L-1PBS 清洗，加入二抗 1∶200 生物素化的山羊抗兔 IgG，放入 37℃温箱孵育 60min;0.01mmol·L-1PBS 清洗，滴加 SABC 过氧化物酶复合物，37℃ 温箱中孵育 60min，0.01mmol·L-1PBS 清洗，滴加 DAB 显色液作用 3～10min，自来 水冲洗后，常规脱水，透明封片。光镜下观察 NSE 表达阳性细胞。 1.2.2 尼氏染色 6 孔培养板的细胞培养 7d 时，取出盖玻片进行尼氏染色。弃去培养液， 0.01mmol·L-1PBS 清洗，4%多聚甲醛室温固定 1h，0.01mmol·L-1PBS 清洗 3 次，氯 仿中 1min，95%、70%乙醇各 1min，蒸馏水清洗，置于 1%甲苯胺蓝染液中染色 20min，95%乙醇分化，在显微镜下观察控制，时间以尼氏体显示清晰为准，37℃干燥， 二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜下观察。 1.3 实验分组 在培养的第 3 天加入氟西汀（常州第四制药厂生产）在应激条件下保持细胞，根据药物浓度不同，将实验细 胞分为 5 组，分别加入 1、10、20、40μg·ml-1mol·L-1 氟西汀;正常对照组加入等体积的培养 基。 1.4 海马细胞形态定量分析 倒置相差显微镜（德国 Zeiss 公司产品）在应激条件下保持细胞下观察加药 48h 后的海马神经元形态，每组 各孔随机选择 20 个视野（每个视野 0.17mm2）在应激条件下保持细胞，记录每个视野内细胞长出突起的神经 元数目，目镜测微尺随机测量 15 个神经元突起的长度和胞体的长径。 1.5 统计学处理 应用 SPSS12.0 软件进行统计分析，各项检测结果以 x-±s 表示。多组比较及组间两 两比较采用方差分析。 2 结果 2.1 海马神经元形态学观察 倒置相差显微镜下观察，培养 1d，细胞绝大部分贴壁，细胞形态大小不一，以单突起 的小细胞为主。培养 6d，神经元胞体较大，突起进一步增多、延长，并形成稀疏的网络 （图 1）在应激条件下保持细胞。培养 12d，神经元胞体进一步增大，突起形成比较稠密的网络。培养 24d，神 经元胞体出现空泡，部分神经元死亡，胞体崩解，突触断裂。 2.2 海马神经元鉴定 NSE 免疫细胞化学染色:染色后光镜下观察第 6 天的神经细胞，胞浆和突起被染成棕 黄色为 NSE 抗体表达阳性细胞，以 3 个视野中阳性神经元的数目占总细胞的比例为神经元 纯度，经鉴定神经元的纯度为 90%。见图 2A。 2.3 氟西汀对海马神经元形态学的影响 结果见表 1 和图 3。不同浓度的氟西汀对海马神经元形态学指标的影响是不同的， 10μg·ml-1mol·L-1 氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起的神经元数目增加、最长突 起长度增长（P<0.05）在应激条件下保持细胞;40μg·ml-1mol·L-1 氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起神 经元数目减少（P<0.05）在应激条件下保持细胞，最长突起长度及胞体长径无显著性差异 （P>0.05）在应激条件下保持细胞;1、20μg·ml-1mol·L-1 氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起神经元数目、 最长突起长度及胞体长径无显著性差异（P>0.05）在应激条件下保持细胞。表 1 氟西汀对加药 48h 海马神经元 形态学的影响（略）在应激条件下保持细胞 3 讨论 本实验严格控制胰酶的量和消化时间，采用了 0.25%胰蛋白酶低浓度溶液、30min 长时间消化的方法，尽可能减少分离过程中的化学损伤。为了避免操作过程中的机械损伤， 分离时动作轻柔，规律换药，每 72h 半量换液 1 次，换液时速度快，以减少对神经元生长 的影响。本实验采用了差速贴壁生长，去除了成纤维细胞，并采用 B27 无血清培养基，可 以选择性地促使神经元生长，抑制非神经元的生长和繁殖［3］，从而可以纯化海马神经 元。NSE 是神经元分化成熟的特异性标志酶之一，它主要表达于神经元的胞体、轴突、树 突部分［4］，通过 NSE 免疫细胞化学染色方法，可以鉴定体外培养的新生大鼠海马神经 元及其纯度。本实验通过 NSE 免疫化学染色，发现大部分细胞胞浆和突起被染成棕黄色， 计数阳性细胞百分率为 90%。尼氏体是神经元的特征性结构之一，存在于神经元胞体和树 突内，可被碱性染料染成深色的颗粒和斑块，它是细胞内的一种蛋白质合成装置，可作为 观察神经细胞功能状态的灵敏指标。本实验观察到培养的海马神经元胞质内尼氏体数量较 多，说明培养的海马神经细胞生长良好。NSE 免疫细胞化学染色和尼氏染色结果提示，本 实验能培养出纯度较高、生长良好的海马神经元。氟西汀不仅是广泛应用的抗抑郁药，而