瑶药葫芦钻提取物抗肿瘤作用分析论文

【摘要】目的研究葫芦钻提取物的抗肿瘤作用。方法体外抗肿瘤活性研究采用 MTT 比 色法，靶细胞采用人肝癌细胞 BLE740474047404；通过复制小鼠通过复制小鼠 S180，H22 腹水瘤和肉瘤动物 模型，观察葫芦钻提取物对小鼠平均生命延长率和肿瘤抑制率的影响来评价体内抗肿瘤作 用。结果葫芦钻水、醇提取物浓度为 20mg/ml 时，对体外培养的肿瘤细胞的抑制率均＞ 50%；通过复制小鼠葫芦钻水、醇提取物的最大耐受剂量均是 150g/kg；通过复制小鼠经 3 次实验，葫芦钻水、醇 提取物高、低剂量组对 S180 腹水瘤小鼠平均生命延长率均＞50%，葫芦钻醇提物高剂量 组对 H22 腹水瘤小鼠平均生命延长率＞50%。葫芦钻水、醇提取物高、低剂量组对 S180 肉瘤小鼠平均瘤重抑制率均＞30%，对 H22 肉瘤小鼠平均瘤重抑制率均＞50%。结论葫 芦钻水、醇提取物具有一定的抗肿瘤作用。 【关键词】葫芦钻；通过复制小鼠抗肿瘤 Abstract:ObjectiveToinvestigatetheantitumoractivityofYaoHerb-Huluzuan.MethodsTheantitumoractivityinvitroagainsthumancancercelllines-hepatocarcinomaBE7404L7404wasdeterminedbyMTTmethod.Theantitumoractivityinvivowasevaluatedby theprolongationratiosoflifespanandtheinhibitionratiosofthetumorweightoftransplantedmouseS180、H22s olidandascitescarcinomamodelfedonextractedsubstancesfromHuluzuan.Result sWhenthedoseofwater,alcoholextractedsubstancesfromHuluzuanwas20mg/ ml,theinhibitionratiosofthetumorcellinvitrowasinexcessof50%.Bothmaximumto lerateddoseofwater,alcoholextractedsubstancesfromHuluzuanwere150g/ kg.Inthreetimesoftheexperiment,prolongationratiosoflife7404spanathighandlowdo seofwater,alcoholextractedsubstancesexceed50%onmiceS180ascitescarcinom amodelinaverage,andathighdoseofalcoholextractedsubstancesexceeded50%o nmiceH22ascitescarcinomamodelinaverage,inhibitionratiosathighandlowdoseo fwater、alcoholextractedsubstancesexceed30%onmiceS180solidcarcinomamo delandexceed50%onmiceH22solidcarcinomamodelinaverage.ConclusionWater ,alcoholextractedsubstancesfromHuluzuanhasantitumoractivitytosomeextent. Keywords:Huluzuan；通过复制小鼠Antitumor 葫芦钻为天南星科植物石柑子 Pothoschinensis(Raf.)Merr.的全草，为广西瑶医老 班药“五虎、九牛、十八钻、七十二风”之一，瑶族传统治癌“打药”［1］，具有理气止痛， 清热解毒的功效。根据民间用药经验，开展抗肿瘤作用实验研究，作者通过体内药效实验 和体外药效实验评价葫芦钻提取物的抗肿瘤效果。 1 材料 1.1 药材葫芦钻采自广西金秀瑶族自治县，经广西民族医药研究所戴斌主任药师鉴定 为天南星科植物石柑子。 1.2 动物昆明种小鼠，体重 18～22g，雌雄兼用，SPF 级，购自广西医科大学实验动 物中心（生产许可证号：SCXK 桂 200374040003），动物分组分笼饲养，自由饮水，喂全价 颗粒饲料，动物室温度（24±2）℃，相对湿度 50%～60%。 1.3 主要药品与试剂 RPMI74041640 培养基为 Gibco 公司的产品；通过复制小鼠MTT 为 Sigma 公司 的产品；通过复制小鼠小牛血清为杭州四季清公司的产品；通过复制小鼠DMSO（二甲基亚砜）为 Sigma 公司的产 品；通过复制小鼠其余试剂均为分析纯。 1.4 细胞系人肝癌细胞 BE7404L74047404 引自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库；通过复制小鼠用 RPMI74041640 培养液（含 10%的小牛血清，100ku·L-1 青霉素，100mg·L-1 链霉 素）37℃，5%CO2，相对湿度 100%培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。 1.5 瘤株小鼠 S180，H22 腹水瘤株和小鼠 S180，H22 肉瘤株均由广西中医药研究 所引进，本实验室冷冻保存，用昆明种小鼠接种传代。 2 方法 2.1 葫芦钻提取物的制备葫芦钻水提物：取药材加 10 倍量水水煎两次，1h/次，滤液 合并浓缩，4℃冰箱保存备用；通过复制小鼠葫芦钻醇提物：取粗粉加 5 倍量 95%乙醇回流提取 3 次， 第 1 次 2h，第 2，3 次各 1h，合并滤液减压回收乙醇至无醇味，浓缩，4℃冰箱保存备用。 2.2 体外药效实验 MTT 法测定：BE7404L74047404 经胰蛋白酶处理制成单细胞悬液，接种 96 孔板，每孔接种 3000 个细胞/100μll，含 10%FBS 的 RPMI74041640 培养液，培养 24h 后，实验组分别加入最终浓度为 1，5，10，20mg/ml 葫芦钻水提物和醇提物的培养液， 对照组则加入等体积溶剂的培养液。每组均设 7 个平行孔。置 37℃，5%CO2 培养箱培养 5d 后，加入 MTT20μll，4h 后弃上清，每孔加入 DMSO100μll，1h 内在 Bio7404Rad550MicoplateReader 上用波长 546nm 比色，测定 OD 值，按下式计算药物对 肿瘤细胞生长的抑制率［2］。 肿瘤细胞生长抑制率(%)=（17404实验组平均 OD 值/对照组平均 OD 值）×100% 2.3 急性毒性实验在预试验基础上，取 40 只昆明种小鼠，体重 18～22g，雌雄各半， 随机分为两组。以动物能耐受的最大浓度，最大容积的剂量，灌胃给药，葫芦钻水提物 3.75g 生药/ml，葫芦钻醇提物 3.75g 生药/ml，0.4ml/10g 体重。给药后连续观察 7d， 逐日观察记录动物反应情况［3］。 2.4 体内药效实验［4］ 2.4.1 对 S180，H22 腹水瘤小鼠生存天数的影响在无菌条件下，抽取小鼠腹腔内连 续传代的 S180，H22 细胞，从右下腹部注入受体动物腹腔内，每鼠 0.2ml。接种 24h 后 随机分组，每组 10 只。接种次日葫芦钻水提物高、低剂量组（37.5，12.5g/kg），葫芦 钻醇提物高、低剂量组（37.5，12.5g/kg），模型对照组（蒸馏水），连续 ig 给药 10d 后，停止给药，正常饲养，直到自然死亡，逐日记录荷瘤小鼠的存活状况，按下式计算各 组平均生命延长率。 生命延长率=治疗组平均存活天数-对照组平均存活天数对照组平均存活天数×100% 上述实验均重复 3 次，并计算 3 次的平均值。 2.4.2 对 S180，H22 肉瘤小鼠的抑瘤作用分别选择接种 7d 后的 S180，H22 肉瘤 （腹水型）小鼠，颈椎脱臼致死，固定于板上，消毒腹部皮肤，用无菌空针抽吸含瘤细胞 腹水，接种于受体动物右前肢腋部皮下，每鼠 0.2ml。24h 后将已接种的小鼠随机分为对 照组、治疗组（高，低剂量组），每组 10 只。治疗组每天 ig 给药 1 次，连续 10d，对照 组 ig 等量的蒸馏水。于停药后第 2 天处死，称体重和瘤重，按下式计算抑瘤率。 肿瘤抑制率=对照组瘤重－给药组瘤重对照组瘤重×100% 上述实验均重复 3 次，并计算 3 次的平均值。 2.5 统计学处理应用 t 检验进行统计学分析，数据以±s 表示。 3 结果 3.1MTT 法不同浓度葫芦钻水、醇提取物对人肝癌细胞株 BE7404L74047404 的抑制。结果见 表 1。 表 1 不同浓度葫芦钻水、醇提取物对体外培养的人肝癌细胞 BE7404L74047404 的影响（略） 结果显示，葫芦钻水、醇提取物对体外培养的人肝癌细胞 BE7404L74047404 增殖都表现较强 的抑制作用，抑制率与提取物浓度正相关。当葫芦钻水、醇提取物浓度为 20mg/ml 时， 抑制率均＞50%，且葫芦钻醇提取物作用效果强于葫芦钻水提物。 3.2 葫芦钻水提物日总剂量为 150g/kg，葫芦钻醇提物日总剂量为 150g/kg，给药当 天动物出现便溏现象，其后观察 7d，对小鼠体重、行为、进食、皮毛、眼和黏膜、呼吸、 四肢活动均无任何影响。说明葫芦钻水、醇提取物的急性毒性小。 3.33 次实验结果显示，葫芦钻水、醇提取物高、低剂量组对 S180 腹水瘤小鼠平均生 命延长率均＞50%，葫芦钻醇提物高剂量组对 H22 腹水瘤小鼠平均生命延长率＞50%。 结果见表 2。 表 2 葫芦钻提取物对 S180 和 H22 腹水瘤小鼠存活期的影响（略） 与模型组比较，※P<0.05，※※P<0.01；通过复制小鼠n=10 3.43 次实验结果显示，葫芦钻水、醇提取物高、低剂量组对 S180 肉瘤小鼠平均瘤重 抑制率均＞30%，对 H22 肉瘤小鼠平均瘤重抑制率均＞50%，结果见表 3。 表 3 葫芦钻提取物对 S180 和 H22 肉瘤小鼠的抑制作用（略） 与模型组比较※P<0.05※※P<0.01;n=10 4 讨论 寻找具有抗癌作用强，抗癌谱广，副作用小的天然活性化合物是抗癌药物研究的重要 途径。近年来对传统瑶药开展抗肿瘤作用的筛选研究，发现瑶药葫芦钻具有一定的抗肿瘤 作用。本研究结果显示，通过 MTT 法检测葫芦钻水、醇提取物对人肝癌细胞生长有抑制作 用。当药物浓度低于 5mg/ml 时，对肿瘤细胞的抑制作用不明显。随着药物浓度升高至 20mg/ml，药物对肿瘤细胞生长的抑制较明显，抑制率在 50%以上。且葫芦钻醇提物的 作用效果强于水提物。急性毒性实验中，葫芦钻水、醇提取物的最大耐受剂量均是 150g/ kg，急性毒性较小。从实验结果可以看出，葫芦钻水、醇提取物在改善 S180 腹水瘤小鼠 存活率方面作用非常明显，生命延长率为 73.65%～97.43%，与模型组比较，平均生存 期延后 10d 以上。葫芦钻醇提物高剂量组在改善 H22 腹水瘤小鼠存活率方面作用明显， 生命延长率为 54.75%。葫芦钻水、醇提取物对 S180 肉瘤和 H22 肉瘤均具有明显的抑制 作用，对 S180 肉瘤平均抑制率＞30%，对 H22 肉瘤平均抑制率＞50%，与模型组比较 有显著性差异（P<0.01）。这些说明葫芦钻提取物具有较强的体内和体外抗肿瘤作用， 有进一步研究的价值。本研究结果为葫芦钻的临床抗肿瘤应用及抗肿瘤活性成分的进一步 分离筛选提供了依据和资料。 【摘要】目的为进一步探讨独一味滴丸的安全性，观察了独一味滴丸的一般药理作用， 以供临床用药参考。方法观察 Bealge 犬麻醉状态下，独一味滴丸对 Bealge 犬血压、呼 吸频率、呼吸振幅和心电图标准Ⅱ导联的影响；独一味滴丸对小鼠自发活动的影响；对戊Ⅱ导联的影响；独一味滴丸对小鼠自发活动的影响；对戊导联的影响；通过复制小鼠独一味滴丸对小鼠自发活动的影响；通过复制小鼠对戊 巴比妥钠阈剂量致小鼠睡眠时间的影响；通过复制小鼠对戊巴比妥钠阈下剂量致小鼠催眠有无明显协同 作用；通过复制小鼠对小鼠的转棒运动有无明显的影响。结果独一味滴丸在 516mg（原料药）/kg 体重 给药剂量内，对麻醉 Bealge 犬心血管系统和呼吸系统均无明显影响；通过复制小鼠在 688mg（原料 药）/kg 体重给药剂量范围内，对小鼠的中枢神经系统没有明显的抑制作用，对小鼠的机 能协调运动也无明显影响。结论一般药理作用研究表明，独一味滴丸对动物心血管系统、 呼吸系统及中枢神经系统均无明显影响，提示其不良反应小。 【关键词】独一味滴丸；通过复制小鼠药理作用；通过复制小鼠心血管系统；通过复制小鼠呼吸系统；通过复制小鼠中枢神经系统 Abstract： ObjectiveTofurtherstudythesafetyofDuYiweiDrippingPillandtoobservethegener alpharmacologicaleffectsforthereferenceofclinicaltherapy.MethodsToobserveth eeffectsofDuYiweiDrippingPillonBealgecaninebloodpressure,respiratoryandE7404C G.Inthestateofparalysis,andtheeffectsofDuYiweiDrippingPillonratscentralandso maticmotionnerves.ResultsWithinadoseof516mg/ kg,ithadnoobviousactiononcaninecardiovascularsystemsandrespiratorysystem .Withinadoseof688mg/ kg,itdidn''''tinhibitthecentralnervoussystem(CNS)ofratsclearly,anditdidn''''taffe cttheharmoniousmotionofrats''''functioneither.ConclusionTheresultindicatesth atwithintheabovementioneddoseofDuYiweiDrippingPill,ithasnoeffectonanimal''''scardiovasculars ystems,respiratorysystemandCNS.ItexertsthatthesystematicsideofDuYiweiDrip pingPillislittle. Keywords：DuYiweidrippingpill；通过复制小鼠Pharmacologicaleffects；通过复制小鼠 Cardiovascularsystems；通过复制小鼠Respiratorysystems；通过复制小鼠Centralnervoussystem 独一味，藏语称“打布巴”，是我国藏、蒙、纳西等民族民间常用草药之一。具有止血、 镇痛消肿、活血化瘀、补髓、行气、续筋接骨等功效［1～3］，临床主要用于治疗软组织 损伤、关节扭伤、骨折的镇痛，止痛效果显著［4,5］。为进一步探讨独一味滴丸的安全 性，笔者观察了该药对麻醉 Bealge 犬心血管系统、呼吸系统和小鼠中枢神经系统的一般 药理学作用。现报道如下。 1 材料 1.1 受试药物及试剂独一味滴丸（原料药），由成都中医药大学中试中心提供，批号： 050710；通过复制小鼠戊巴比妥钠，含量≥95.0%，批号：F20030816，中国医药（集团）上海化学 试剂公司进口分装，实验用氯化钠注射液配制成 3%浓度备用；通过复制小鼠肝素钠注射液，批号： 20040205，12500 单位/ml/支，天津市生物化学制药厂生产，用氯化钠注射液配制成 50U/ml 备用；通过复制小鼠艾司唑仑片,天津太平洋制药有限公司生产,国药准Ⅱ导联的影响；独一味滴丸对小鼠自发活动的影响；对戊字 H2020291,规 格:1mg/片,批号:050302。 1.2 动物 Bealge 犬 24 只，雌雄不拘，体重 4.8～6.1kg，由四川省医学科学院实验 动物研究所提供，实验动物生产许可证号：SCXK（川）2004-15。ICR 小鼠，体重 18～ 22g，雌雄各半，由四川省医学科学院实验动物研究所提供。实验动物生产许可证号： SCXK（川）2004-16。 1.3 仪器 BIOPACMP150 多道生物信号分析系统，BIOPACSS13L 有创血压传感器， BIOPACSS5LB 呼吸绑带，均为美国 BIOPAC 公司产品；通过复制小鼠心电图记录仪（E7404CG-6511）， 上海光电医用电子仪器有限公司产品；通过复制小鼠YLS-1A 多功能小鼠自发活动记录仪，YLS—4C 转 棒式疲劳仪，均由山东省医学科学院设备站生产。 1.4 统计方法用 SPSS11.5 统计软件进行统计分析。以(±s)表示结果的数据用单因数 方差分析进行组间比较，以（%）表示结果的数据用 χ2 检验检测其组间差异的显著性。 2 方法与结果 2.1 对麻醉 Bealge 犬血压、呼吸系统及心电图的影响［6，7］健康 Bealge 犬，雌 雄不拘，体重 4.8～6.1kg，随即分为 4 组：空白对照组和独一味滴丸高、中、低 3 个剂 量组［分别为 516，258，129mg(原料药)/kg］。灌胃给药，给药体积均为 1ml/kg。实 验时用戊巴比妥钠(30mg/kg)Bealge 犬隐静脉注射麻醉，分离股动脉，插入动脉插管， 动脉插管通过盛有 50U/ml 肝素溶液的密闭橡皮管与血压换能器相连。将心电的导联电极 与动物的皮下相连，用标准Ⅱ导联的影响；独一味滴丸对小鼠自发活动的影响；对戊Ⅱ导联的影响；独一味滴丸对小鼠自发活动的影响；对戊导联测量心电各项指标。将呼吸绑带绑于犬的胸部，测量呼 吸频率和呼吸深度。开启十六道生物机能实验系统，记录血压、心电、呼吸的波动曲线。 待血压、心电、呼吸的波动曲线稳定后，描记一段给药前正常曲线，将导尿管经口缓慢插 入食管和胃，灌胃给予受试药，分别记录给药后 0.5，1，1.5，2，3h 等时间点血压、心 电及呼吸值。结果见表 1～5。由表 1～5 显示，独一味滴丸上述 3 剂量对麻醉 Bealge 犬 的血压、呼吸振幅、呼吸频率及心电图（Ⅱ导联的影响；独一味滴丸对小鼠自发活动的影响；对戊导联）的心率、P，T 波和 QRS，QT 间期、 PR 间期、ST 间期均无明显影响，给药前及给药后各检测时间点的检测值与空白对照组比 较其差别均无显著意义（P＞0.05），心律均为窦性。提示在 516mg/kg 给药剂量范围内， 该药对麻醉 Bealge 犬血压、呼吸系统、心电图（Ⅱ导联的影响；独一味滴丸对小鼠自发活动的影响；对戊导联）无明显影响。 表 1 独一味滴丸对麻醉 Bealge 犬收缩压的影响（略） 与空白对照组比较,P>0.05；通过复制小鼠n=6；通过复制小鼠1mmHg≈0.133kPa 表 2 独一味滴丸对麻醉 Bealge 犬舒张压的影响（略） 与空白对照组比较，P>0.05；通过复制小鼠n=6；通过复制小鼠1mmHg≈0.133kPa 表 3 独一味滴丸对麻醉 Bealge 犬呼吸幅度的影响（略） 与空白对照组比较，P>0.05；通过复制小鼠n=6 表 4 独一味滴丸对麻醉 Bealge 犬呼吸频率的影响（略） 与空白对照组比较，P＞0.05；通过复制小鼠n=6 表 5 独一味滴丸对麻醉 Bealge 犬心率的影响（略） 与空白对照组比较，P>0.05；通过复制小鼠n=6