开口箭提取物研究论文

【摘要】目的通过体外细胞培养技术，探讨开口箭提取物的细胞毒活性，为进行深层 次研究提供依据。方法采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总比色法。结果开口箭甲醇提取物、总 皂苷、30%总皂苷和 70%总皂苷对 HL-60 和 Caski 细胞的抑制作用显著，与阴性对照相 比（P<0.05）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总,对 HL-60 细胞的抑制率达到 60.12%，72.25%，89.09%，95.17%， 其 IC50 为 65.57，45.07，35.40，22.89μg/mlg/ml。对 Caski 细胞的抑制率达到 63.94%，71.48%，62.49%，73.43%，其 IC50 为 108.42，84.53，41.02，47.19μg/mlg/ml。结论开口箭提取物对 HL-60 和 Caski 细胞具有 明显的抑制作用。 【关键词】开口箭；皂苷；MTT 法；细胞毒活性 Abstract： ObjectiveToobservethecytotoxicitiesoftheextractsofTupistrachinensisBak.withi nvitrocellculturetechnology,andprovideevidenceforthefurtherresearch.Method sThecytotoxicitieswereassayedbyMTTmethodsonHL60andCaskitumorcells.ResultsTheinhibitioneffectoftheextractsofTupistrachinen sisBak.,totalsaponins,30%totalsaponinsand70%totalsaponinsonHL60andCaskicellswereallprominent,comparedwiththenegativemodelgroup(P<0. 05).TheirinhibitionratiosonHL60tumorcellswereasfollows:60.12%,72.25%,89.09%and95.17%，andtheirIC50 were65.57,45.07,35.40and22.89μg/mlg/ ml.TheirinhibitionratiosonCaskicellswere63.94%,71.48%,62.49%and73.43%， andtheirIC50were108.42,84.53,41.02,47.19μg/mlg/ ml.ConclusionTheextractsofTupistrachinensisBak.havesignificantcytotoxicityo nHL-60andCaskitumorcells. Keywords：TupistrachinensisBak.；Saponin；MTTmethod；Cytotoxicity 开口箭（TupistrachinensisBak.）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总系百合科 Liliaceae 铃兰族开口箭属植物，为著 名的传统中药，主治劳热咳嗽、跌打损伤、风湿痹痛等症，民间用于治疗咽喉炎、扁桃体 炎等。现证明开口箭具有祛痰、抗炎、抑菌及醒酒作用［1，2］。 本实验室通过实验证实湖北省产开口箭含有甾体皂苷和甾体皂苷元,且含量较高 ［3］。皂苷具有增强免疫功能、抗辐射、抑制肿瘤生长、抗炎、降血糖等广泛的生物学 活性,近年越来越受人们的普遍关注。有研究证实开口箭同属植物皂苷成分有细胞毒活性 ［4，5］。本文旨在通过体外抗肿瘤实验,观察开口箭提取物对 HL-60 和 Caski 细胞的细 胞毒活性,现报告如下。 1 材料 1.1 细胞株人急性淋巴细胞性白血病细胞（HL-60）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总、人宫颈鳞状上皮癌细胞(Caski) 均由三峡大学免疫教研室提供。 1.2 药品与仪器 RPMI-1640 为美国 GIBCO 公司产品；新生小牛血清为杭州四季青生 物材料有限公司产品；HEPES 为美国 Sigma 公司产品，胰蛋白酶为美国 GIBCO 公司产 品；四氮唑蓝(MTT)为美国 AMRESCO 公司产品；丝裂霉素(MMC，浙江海正药液股份有 限公司，批号：051211)；酶联免疫检测仪(GENIOSTECAN)；CO2 培养箱（日本三洋 公司）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总；LD4-2A 离心机(北京医用离心机厂)；96 孔板(美国 Cornning 公司)。 开口箭根茎于 2002-07 采自湖北省神农架林区，经三峡大学化学与生命科学学院陈 发菊副教授鉴定为 TupistrachinensisBak.，标本存放于湖北省天然产物研究与利用重点 实验室（编号：TC200207SNJ）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总。 1.3 药物制备开口箭根茎粉碎后，用甲醇回流提取 3 次，合并 3 次提取液，浓缩后经 石油醚脱脂用水饱和的正丁醇萃取，旋转蒸发回收正丁醇，浓缩液抽干后即得到开口箭总 皂苷，配成水液，过大孔树脂柱，水洗，30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脱，得 开口箭四部分皂苷。 分别取开口箭甲醇提取物、开口箭总皂苷、30%开口箭皂苷、70%开口箭皂苷 4 个样 品，用含 10%灭活的新生小牛血清 RPMI-1640 培养液将其配制成所需浓度，依次为 62.5,125,250,500,1000,2000μg/mlg/ml。丝裂霉素(MMC)用含 10%灭活的新生小牛血清 RPMI-1640 培养液将其配置为 250μg/mlg/ml。所有受试样品均用 0.22μg/mlm 微孔滤膜过滤除 菌。 2 方法 2.1 细胞培养 HL-60 和 Caski 细胞用 RPMI-1640 培养液（另加 10mmol/ LHEPES,2.0mg/mlNaHCO3，100U/ml 青霉素，100μg/mlg/ml 链霉素和 10%新生小牛血 清）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总，于 CO2 孵箱中 37℃，5%CO2 饱和湿度下培养。贴壁细胞用含 0.02%EDTA 的 0.25%胰蛋白酶消化传代。 2.2MTT 比色法［6］按 Mosmann 氏法略加改进。将处于对数生长期的细胞制成单 个细胞悬液，调整细胞浓度为 0.8×105 个/ml,接种于 96 孔培养板,每孔接种 180μg/mll，转 板 6h 后加 20μg/mll 受试药,另设阴性对照组(不加药)、空白凋零组（只有培养基）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总和阳性对照 组（MMC 组）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总，每组均设 6 个复孔，培养 48h 后加 MTT(5mg/ml)15μg/mll,继续培养 4h 后, 弃去上清液，加 DMSO100μg/mll,用全自动酶联免疫检测仪于 492nm 波长处测定吸光度 (OD)值［7］,求出 IC50。抑制率（%）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总=［1-（实验组 OD 均值-空白组 OD 均值）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总/(对 照组 OD 均值-空白组 OD 均值）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总］×100%。 2.3 统计学处理实验数据以±ss 表示，数据分析采用 SPSS11.5 统计软件进行。用 Origin 软件，通过半对数拟合直线求 IC50 值。 3 结果 3.1 开口箭总提取物和总皂苷对 HL-60 细胞的影响结果见表 1。 表 1 总提取物和总皂苷对 HL-60 细胞的抑制作用（略）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总 与阴性对照组比较，*P<0.05P<0.05，*P<0.05*P<0.05P<0.01；n=6 由表 1 可知开口箭总提取物和总皂苷对 HL-60 细胞的抑制作用显著，与阴性对照组相 比有显著性差异（P<0.05 或 P<0.01）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总，且呈良好的量效关系,总皂苷的抑制作用强于总 提取物。 3.2 开口箭 30%总皂苷和开口箭 70%总皂苷对 HL-60 细胞的影响结果见表 2。 表 230%总皂苷和 70%总皂苷对 HL-60 细胞的抑制作用（略）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总 与阴性对照组比较，*P<0.05P<0.05，*P<0.05*P<0.05P<0.01；n=6 由表 2 可知开口箭 30%总皂苷和 70%总皂苷对 HL-60 细胞的抑制作用显著，与阴性 对照组比有显著性差异（P<0.05 或 P<0.01）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总。30%总皂苷最佳浓度为 25μg/mlg/ml，其抑 制率达 89.09%，70%总皂苷对 HL-60 细胞的抑制作用虽药物浓度的增加而增大，量效 关系明显。 3.3 开口箭总提取物和总皂苷对 Caski 细胞的影响结果见表 3。 表 3 开口箭总提取物和总皂苷对 Caski 细胞的抑制作用（略）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总 与阴性对照组比较，*P<0.05P<0.05，*P<0.05*P<0.05P<0.01；n=6 由表 3 可知开口箭总提取物和总皂苷对 Caski 细胞抑制作用明显，与阴性对照组比有 显著性差异（P<0.05 或 P<0.01）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总,呈良好的量效关系，总皂苷的抑制作用强于总提取物。 3.4 开口箭 30%总皂苷和 70%总皂苷对 Caski 细胞的影响结果见表 4。 表 430%总皂苷和 70%总皂苷对 Caski 细胞的抑制作用（略）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总 与阴性对照组比较，*P<0.05*P<0.05P<0.01；n=6 由表 4 可知，开口箭 30%总皂苷和 70%总皂苷对 Caski 细胞抑制作用显著，与阴性 对照组比有显著性差异（P<0.05 或 P<0.01）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总,呈现一定的量效关系。 4 讨论 以上结果表明，开口箭甲醇提取物、总皂苷、30%皂苷和 70%皂苷对体外培养的 HL60 和 Caski 细胞株的抑制作用显著，与阴性对照组比均有显著性差异（P<0.05 或 P<0.01）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总，其细胞毒作用呈现较明显的剂量依赖性。其中 30%开口箭皂苷在 25μg/mlg/ml 时与同浓度下丝裂霉素作用于 HL-60 细胞的效果相当，70%开口箭皂苷在 50μg/mlg/ml 与丝 裂霉素在 25μg/mlg/ml 浓度下作用于 HL-60 细胞的效果相当。药理实验显示开口箭毒副作用 小，因此开发其细胞毒作用有潜在价值。 开口箭总皂苷上大孔树脂柱所得 95%开口箭皂苷部分量较少，目前正在研究之中。至 于不同的开口箭部位细胞毒活性存在差异，应与它们所含不同皂苷成分有关，还需要对其 进行深入研究。 从植物中寻找抗肿瘤药物及抗肿瘤辅助药物，在国内外均为抗肿瘤药物研究的重要组 成部分。据文献报道开口箭对 HepG2 和 S180 细胞株亦有明显的抑制作用［8］,本实验 室发现开口箭对 HL-60 和 Caski 细胞有较强的细胞毒作用，可见开口箭具有广谱抗肿瘤作 用，此外开口箭还有祛痰抗炎等作用。因此对开口箭的抗肿瘤作用及机制值得进一步研究。 【摘要】目的研究葫芦钻提取物的抗肿瘤作用。方法体外抗肿瘤活性研究采用 MTT 比 色法，靶细胞采用人肝癌细胞 BLE74047404；通过复制小鼠 S180，H22 腹水瘤和肉瘤动物 模型，观察葫芦钻提取物对小鼠平均生命延长率和肿瘤抑制率的影响来评价体内抗肿瘤作 用。结果葫芦钻水、醇提取物浓度为 20mg/ml 时，对体外培养的肿瘤细胞的抑制率均＞ 50%；葫芦钻水、醇提取物的最大耐受剂量均是 150g/kg；经 3 次实验，葫芦钻水、醇 提取物高、低剂量组对 S180 腹水瘤小鼠平均生命延长率均＞50%，葫芦钻醇提物高剂量 组对 H22 腹水瘤小鼠平均生命延长率＞50%。葫芦钻水、醇提取物高、低剂量组对 S180 肉瘤小鼠平均瘤重抑制率均＞30%，对 H22 肉瘤小鼠平均瘤重抑制率均＞50%。结论葫 芦钻水、醇提取物具有一定的抗肿瘤作用。 【关键词】葫芦钻；抗肿瘤 Abstract:ObjectiveToinvestigatetheantitumoractivityofYaoHerb-Huluzuan.MethodsTheantitumoractivityinvitroagainsthumancancercelllines-hepatocarcinomaBEL7404wasdeterminedbyMTTmethod.Theantitumoractivityinvivowasevaluatedby theprolongationratiosoflifespanandtheinhibitionratiosofthetumorweightoftransplantedmouseS180、H22s olidandascitescarcinomamodelfedonextractedsubstancesfromHuluzuan.Result sWhenthedoseofwater,alcoholextractedsubstancesfromHuluzuanwas20mg/ ml,theinhibitionratiosofthetumorcellinvitrowasinexcessof50%.Bothmaximumto lerateddoseofwater,alcoholextractedsubstancesfromHuluzuanwere150g/ kg.Inthreetimesoftheexperiment,prolongationratiosoflife7404spanathighandlowdo seofwater,alcoholextractedsubstancesexceed50%onmiceS180ascitescarcinom amodelinaverage,andathighdoseofalcoholextractedsubstancesexceeded50%o nmiceH22ascitescarcinomamodelinaverage,inhibitionratiosathighandlowdoseo fwater、alcoholextractedsubstancesexceed30%onmiceS180solidcarcinomamo delandexceed50%onmiceH22solidcarcinomamodelinaverage.ConclusionWater ,alcoholextractedsubstancesfromHuluzuanhasantitumoractivitytosomeextent. Keywords:Huluzuan；Antitumor 葫芦钻为天南星科植物石柑子 Pothoschinensis(Raf.)Merr.的全草，为广西瑶医老 班药“五虎、九牛、十八钻、七十二风”之一，瑶族传统治癌“打药”［1］，具有理气止痛， 清热解毒的功效。根据民间用药经验，开展抗肿瘤作用实验研究，作者通过体内药效实验 和体外药效实验评价葫芦钻提取物的抗肿瘤效果。 1 材料 1.1 药材葫芦钻采自广西金秀瑶族自治县，经广西民族医药研究所戴斌主任药师鉴定 为天南星科植物石柑子。 1.2 动物昆明种小鼠，体重 18～22g，雌雄兼用，SPF 级，购自广西医科大学实验动 物中心（生产许可证号：SCXK 桂 200374040003）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总，动物分组分笼饲养，自由饮水，喂全价 颗粒饲料，动物室温度（24±s2）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总℃，相对湿度 50%～60%。 1.3 主要药品与试剂 RPMI74041640 培养基为 Gibco 公司的产品；MTT 为 Sigma 公司 的产品；小牛血清为杭州四季清公司的产品；DMSO（二甲基亚砜）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总为 Sigma 公司的产 品；其余试剂均为分析纯。 1.4 细胞系人肝癌细胞 BEL74047404 引自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库；用 RPMI74041640 培养液（含 10%的小牛血清，100ku·L-1 青霉素，100mg·L-1 链霉 素）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总37℃，5%CO2，相对湿度 100%培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。 1.5 瘤株小鼠 S180，H22 腹水瘤株和小鼠 S180，H22 肉瘤株均由广西中医药研究 所引进，本实验室冷冻保存，用昆明种小鼠接种传代。 2 方法 2.1 葫芦钻提取物的制备葫芦钻水提物：取药材加 10 倍量水水煎两次，1h/次，滤液 合并浓缩，4℃冰箱保存备用；葫芦钻醇提物：取粗粉加 5 倍量 95%乙醇回流提取 3 次， 第 1 次 2h，第 2，3 次各 1h，合并滤液减压回收乙醇至无醇味，浓缩，4℃冰箱保存备用。 2.2 体外药效实验 MTT 法测定：BEL74047404 经胰蛋白酶处理制成单细胞悬液，接种 96 孔板，每孔接种 3000 个细胞/100μg/mll，含 10%FBS 的 RPMI74041640 培养液，培养 24h 后，实验组分别加入最终浓度为 1，5，10，20mg/ml 葫芦钻水提物和醇提物的培养液， 对照组则加入等体积溶剂的培养液。每组均设 7 个平行孔。置 37℃，5%CO2 培养箱培养 5d 后，加入 MTT20μg/mll，4h 后弃上清，每孔加入 DMSO100μg/mll，1h 内在 Bio7404Rad550MicoplateReader 上用波长 546nm 比色，测定 OD 值，按下式计算药物对 肿瘤细胞生长的抑制率［2］。 肿瘤细胞生长抑制率(%)=（17404实验组平均 OD 值/对照组平均 OD 值）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总×100% 2.3 急性毒性实验在预试验基础上，取 40 只昆明种小鼠，体重 18～22g，雌雄各半， 随机分为两组。以动物能耐受的最大浓度，最大容积的剂量，灌胃给药，葫芦钻水提物 3.75g 生药/ml，葫芦钻醇提物 3.75g 生药/ml，0.4ml/10g 体重。给药后连续观察 7d， 逐日观察记录动物反应情况［3］。 2.4 体内药效实验［4］ 2.4.1 对 S180，H22 腹水瘤小鼠生存天数的影响在无菌条件下，抽取小鼠腹腔内连 续传代的 S180，H22 细胞，从右下腹部注入受体动物腹腔内，每鼠 0.2ml。接种 24h 后 随机分组，每组 10 只。接种次日葫芦钻水提物高、低剂量组（37.5，12.5g/kg）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总，葫芦 钻醇提物高、低剂量组（37.5，12.5g/kg）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总，模型对照组（蒸馏水）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总，连续 ig 给药 10d 后，停止给药，正常饲养，直到自然死亡，逐日记录荷瘤小鼠的存活状况，按下式计算各 组平均生命延长率。 生命延长率=治疗组平均存活天数-对照组平均存活天数对照组平均存活天数×100% 上述实验均重复 3 次，并计算 3 次的平均值。 2.4.2 对 S180，H22 肉瘤小鼠的抑瘤作用分别选择接种 7d 后的 S180，H22 肉瘤 （腹水型）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总小鼠，颈椎脱臼致死，固定于板上，消毒腹部皮肤，用无菌空针抽吸含瘤细胞 腹水，接种于受体动物右前肢腋部皮下，每鼠 0.2ml。24h 后将已接种的小鼠随机分为对 照组、治疗组（高，低剂量组）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总，每组 10 只。治疗组每天 ig 给药 1 次，连续 10d，对照 组 ig 等量的蒸馏水。于停药后第 2 天处死，称体重和瘤重，按下式计算抑瘤率。 肿瘤抑制率=对照组瘤重－给药组瘤重对照组瘤重×100% 上述实验均重复 3 次，并计算 3 次的平均值。 2.5 统计学处理应用 t 检验进行统计学分析，数据以±ss 表示。 3 结果 3.1MTT 法不同浓度葫芦钻水、醇提取物对人肝癌细胞株 BEL74047404 的抑制。结果见 表 1。