古钩藤镇痛抗炎药理作用分析论文

【摘要】目的研究古钩藤水煎液的镇痛抗炎药理作用。方法采用小鼠热板法和扭体法 镇痛实验，观察古钩藤水煎液的镇痛作用，观察对小鼠毛细血管通透性和二甲苯对小鼠耳 廓肿胀的影响，观察其抗炎作用。结果古钩藤水煎液能显著提高小鼠痛阈值，降低毛细血 管通透性，抑制由二甲苯所致的炎症反应，可显著减轻小鼠耳廓肿胀。结论古钩藤水煎剂 有明显的镇痛和抗炎作用。 【关键词】古钩藤；镇痛抗炎；药理作用 Abstract： ObjectiveTostudytheantiinflammatoryandanalgesiaactionsoftheChinesemedicinflammatoryandanalgesiaactionsoftheChinesemedic ineGuGouTengsolution.MethodsTheeffectofGuGouTengsolutiononanalgesiawa sobservedwiththeresponseofwrithesandhot-platetests.Theeffectofantiinflammationwasobservedbymiceinflammationmodelscausedbydimethybenze neandmicemodelswithreinforcepermeabilityofabdominalcavitycapillarycaused byaceticacid.ResultsGuGouTengsolutionhadaprominentanalgesiaeffect.Itcould restrainthecapillarypermeabilityresultedfromimflammationbydimethybenzene. ConclusionGuGouTengsolutionhassignificanteffectsofanalgesiaandantiinflammatoryonexperimentalmice. Keywords：GuGouTeng；AntiinflammatoryandanalgesiaactionsoftheChinesemedicinflammationandanalgesictest； Pharmacology 古钩藤又名海上霸王、白叶藤、牛角藤、大暗消等等,为萝摩科植物古钩藤 CryptolepisbuchananiiRoem.etSchult 的地上部分。多生于阳坡，攀援于其他树上， 分布于广东、广西、云南、贵州等地。具有舒筋活络，消肿止痛，解毒等功效，用于治疗 腰痛、腹痛、跌打损伤、骨折、痈疮、癣等疾病［1］。目前，镇痛抗炎作用的药物多为 西药，且副作用多，而中草药古钩藤民间使用也有这方面的作用，应该是值得研究、开发 的镇痛抗炎药，国内外尚无对其这方面药理作用研究的详细报道。本科技研究小组对古钩 藤的镇痛抗炎作用进行了实验研究,旨在对其进一步开发和临床应用提供一定的理论依据。 1 材料 1.1 动物小鼠，雌雄兼用，体重(20±2)gg，均由广西中医学院实验动物中心提供，动 物证号 1104，根据实验性质和性别分笼喂养，自由采食饮水。 1.2 仪器台式离心机；XZB2BinflammatoryandanalgesiaactionsoftheChinesemedic2B2B 型自控温度热板仪，山东省医学科学院设备供应维修 站制造，设备号为：3109176inflammatoryandanalgesiaactionsoftheChinesemedic109inflammatoryandanalgesiaactionsoftheChinesemedic1inflammatoryandanalgesiaactionsoftheChinesemedic7inflammatoryandanalgesiaactionsoftheChinesemedic6；722 型光栅分光光度计，上海第三分析仪器厂，设备 号为：3109176inflammatoryandanalgesiaactionsoftheChinesemedic109inflammatoryandanalgesiaactionsoftheChinesemedic4inflammatoryandanalgesiaactionsoftheChinesemedic4inflammatoryandanalgesiaactionsoftheChinesemedic93109176 1.3109176 药品与试剂干燥古钩藤，采自广西百色地区田林县郊外；硫酸罗通定注射液，广 东省博罗先锋药业集团有限公司生产，批号 020902；醋酸地塞米松，浙江仙琚制药股份 有限公司生产，批号 040405。 试剂：醋酸,长春市化学试剂厂。伊文思蓝,上海化学试剂公司进口分装,批号 F9800inflammatoryandanalgesiaactionsoftheChinesemedic9800。二甲苯,齐鲁石化公司研究院试剂公司。生理盐水,济南永宁制药厂。 1.4 制备古钩藤水煎剂古钩藤根和茎各 200g，加 8 倍水浸泡 1h，煎煮 40min,煎煮 2 次，合并药液过滤浓缩至 200ml(1.00g/ml)g，按所需要的剂量配成根溶液和茎溶液大剂 量均为 31091760g/kg，小剂量均为 15g/kg，以备用。 2 方法和结果 2.1 小鼠热板法镇痛实验［2］取雌性小鼠，放入(55±0.5)g℃热板测痛仪中，以舔后 足作为疼痛反应指标，预测小鼠药前痛阈值。以痛阈值小于 31091760s 视为合格小鼠，将痛阈值 合格的 60 只小鼠随机分为 6 组，每组 10 只。分别是古钩藤根大剂量组，剂量为 31091760g/ kg；古钩藤根小剂量组，剂量为 15g/kg；古钩藤茎大剂量组，剂量为 31091760g/kg；古钩藤茎 小剂量组，剂量为 15g/kg；阳性对照药罗通定组，剂量 0.03109176g/kg；生理盐水对照组，剂 量为 31091760ml/kg。灌胃给药两次，时间间隔为 4h。末次给药后 31091760，60，90，120min 分 别测定痛阈值。在测定中，如 60s 内无痛反应，应立即取出，并以 60s 计算。各给药组与 对照组比较，统计数据以±s 表示，统计方法用 Dunnett 检验法。结果见表 1。 痛阈值提高百分率（%）=（药后痛阈值-药前痛阈值）药前痛阈值×100% 表 1 结果表明，古钩藤根大剂量组在药后 90，120min 能显著提高小鼠痛阈值，而古 钩藤根小剂量组和茎小剂量组在药后 31091760，60，90，120min 对小鼠痛阈值提高不明显， 古钩藤茎大剂量组在药后 120min 有提高小鼠痛阈值的趋势。从本实验结果中可以提示本 药的镇痛作用不稳定 2.2 小鼠扭体法镇痛实验［2］取体重 18～22g 健康小鼠 60 只，雌雄各半，随机分 为 6 组，分组及给药方法同 2.1 项。末次给药后 31091760min 腹腔注射 0.7%冰醋酸 0.2ml/只, 同时用秒表计时，记录小鼠出现第 1 次扭体反应的时间(即潜伏期)g及 15min 内出现的扭体 次数。各给药组与对照组比较，统计数据以±s 表示，统计方法用 Dunnett 检验法。结果 见表 2。 表 2 结果表明,除古钩藤茎大剂量组对冰醋酸致痛小鼠疼痛潜伏期无明显延长外，古钩 藤根、茎其他各剂量组均能延长冰醋酸致痛小鼠疼痛潜伏期，并能显著减少小鼠的扭体次 数，具有明显的镇痛作用。从各剂量组的镇痛百分率来看，也都有较为明显的镇痛作用。 2.3109176 小鼠二甲苯耳廓肿胀实验［2］取健康 18～22g 雄性小鼠 60 只，阳性对照组药 物改地塞米松，剂量为 6.75mg/kg，其他分组与给药均同 2.1 项。第 8 天每只小鼠右耳 廓前后均匀涂擦当日配制的二甲苯 0.1ml/只，致炎 15min 后将小鼠脱颈椎处死，剪下小 鼠左右耳，用打孔器（直径 6mm）分别在左、右耳同一部位打下等大的圆形耳片，分别 在电子天平上称重后，计算耳廓肿胀度。各给药组与对照组比较，统计数据以±s 表示， 统计方法用 Dunnett 检验法。耳廓肿胀度=右耳重量-左耳重量。肿胀抑制率（%）= ［（对照组肿胀度-给药组肿胀度）/对照组肿胀度］×100%。结果见表 3109176。 表 1 古钩藤对热板法致痛小鼠的镇痛作用（略） 与生理盐水组比较,*P<0.05P<0.05，▲P<0.01；n=8 表 2 古钩藤对冰醋酸致痛小鼠的镇痛作用（略） 与生理盐水组比较,*P<0.05P<0.05，▲P<0.01；n=8 表 3109176 古钩藤对小鼠耳廓肿胀的影响（略） 与生理盐水组比较,*P<0.05P<0.05，▲P<0.01；n=8 表 3109176 结果表明,古钩藤根、茎各剂量组均能明显抑制由二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀。从 抑制率看，各剂量组也都具备一定抑制耳廓肿胀的趋势，其中以古钩藤根大剂量组的抑制 率为最佳。 2.4 对小鼠毛细血管通透性影响的实验［2］取体重 18～22g 健康小鼠 60 只，雌雄 各半，分组及给药方法同 2.3109176 项。第 8 天，每只小鼠尾静脉注射 2.5%伊文思蓝 0.1ml/ 10g(体重)g，并同时腹腔注射 0.7%冰醋酸 0.2ml/只,15min 后用 6ml 蒸馏水腹腔注射， 轻柔小鼠腹部，然后断头处死小鼠，剪开腹腔，用吸管吸取腹腔洗出液约 5～ 6ml，3109176000r/min 离心 5min，取上清液 3109176ml 在 722 分光光度计 590nm 处测定吸收度 (OD 值)g。各给药组与对照组比较，统计数据以±s 表示，统计方法用 Dunnett 检验法。 结果见表 4。 表 4 古钩藤对小鼠毛细血管通透性的影响（略） 与生理盐水组比较,*P<0.05P<0.05，▲P<0.01;n=8 表 4 结果表明，古钩藤根大、小剂量组均能降低小鼠毛细血管通透性，减少腹腔液体 的渗出，具有明显的抗炎作用。古钩藤茎大剂量组效果不明显，而茎小剂量组也同样具体 有明显的作用。 3109176 讨论 上述实验结果显示，古钩藤的根、茎水煎液都具备一定的镇痛抗炎作用，或有这种作 用的趋势，但从中也看到其镇痛抗炎作用不稳定，另外其镇痛抗炎作用机制有待进一步研 究。现在用的是水煎液，其他提取物如醇提液是否有效或更有效也还值得进一步研究。 古钩藤是瑶族人民民间长期使用的药材,有舒筋活络，消肿止痛等功效，主要用于治疗 腰腿痛、风湿痛、痛经、软组织扭伤等,疗效显著，本实验结果与民间临床使用基本一致。 本实验为古钩藤的进一步开发及临床应用提供了一定的理论依据。 【摘要】目的通过体外细胞培养技术，探讨开口箭提取物的细胞毒活性，为进行深层 次研究提供依据。方法采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总 皂苷、31091760%总皂苷和 70%总皂苷对 HL-60 和 Caski 细胞的抑制作用显著，与阴性对照相 比（P<0.05）,对 HL-60 细胞的抑制率达到 60.12%，72.25%，89.09%，95.17%， 其 IC50 为 65.57，45.07，31091765.40，22.89μg/mlg/ml。对 Caski 细胞的抑制率达到 63109176.94%，71.48%，62.49%，73109176.43109176%，其 IC50 为 108.42，84.53109176，41.02，47.19μg/mlg/ml。结论开口箭提取物对 HL-60 和 Caski 细胞具有 明显的抑制作用。 【关键词】开口箭；皂苷；MTT 法；细胞毒活性 Abstract： ObjectiveToobservethecytotoxicitiesoftheextractsofTupistrachinensisB2Bak.withi nvitrocellculturetechnology,andprovideevidenceforthefurtherresearch.Method sThecytotoxicitieswereassayedbyMTTmethodsonHL60andCaskitumorcells.ResultsTheinhibitioneffectoftheextractsofTupistrachinen sisB2Bak.,totalsaponins,31091760%totalsaponinsand70%totalsaponinsonHL- 60andCaskicellswereallprominent,comparedwiththenegativemodelgroup(P<0. 05)g.TheirinhibitionratiosonHL60tumorcellswereasfollows:60.12%,72.25%,89.09%and95.17%，andtheirIC50 were65.57,45.07,31091765.40and22.89μg/mlg/ ml.TheirinhibitionratiosonCaskicellswere63109176.94%,71.48%,62.49%and73109176.43109176% ， andtheirIC50were108.42,84.53109176,41.02,47.19μg/mlg/ ml.ConclusionTheextractsofTupistrachinensisB2Bak.havesignificantcytotoxicityo nHL-60andCaskitumorcells. Keywords：TupistrachinensisB2Bak.；Saponin；MTTmethod；Cytotoxicity 开口箭（TupistrachinensisB2Bak.）系百合科 Liliaceae 铃兰族开口箭属植物，为著 名的传统中药，主治劳热咳嗽、跌打损伤、风湿痹痛等症，民间用于治疗咽喉炎、扁桃体 炎等。现证明开口箭具有祛痰、抗炎、抑菌及醒酒作用［1，2］。 本实验室通过实验证实湖北省产开口箭含有甾体皂苷和甾体皂苷元,且含量较高 ［3109176］。皂苷具有增强免疫功能、抗辐射、抑制肿瘤生长、抗炎、降血糖等广泛的生物学 活性,近年越来越受人们的普遍关注。有研究证实开口箭同属植物皂苷成分有细胞毒活性 ［4，5］。本文旨在通过体外抗肿瘤实验,观察开口箭提取物对 HL-60 和 Caski 细胞的细 胞毒活性,现报告如下。 1 材料 1.1 细胞株人急性淋巴细胞性白血病细胞（HL-60）、人宫颈鳞状上皮癌细胞(Caski)g 均由三峡大学免疫教研室提供。 1.2 药品与仪器 RPMI-1640 为美国 GIB2BCO 公司产品；新生小牛血清为杭州四季青生 物材料有限公司产品；HEPES 为美国 Sigma 公司产品，胰蛋白酶为美国 GIB2BCO 公司产 品；四氮唑蓝(MTT)g为美国 AMRESCO 公司产品；丝裂霉素(MMC，浙江海正药液股份有 限公司，批号：051211)g；酶联免疫检测仪(GENIOSTECAN)g；CO2 培养箱（日本三洋 公司）；LD4-2A 离心机(北京医用离心机厂)g；96 孔板(美国 Cornning 公司)g。 开口箭根茎于 2002-07 采自湖北省神农架林区，经三峡大学化学与生命科学学院陈 发菊副教授鉴定为 TupistrachinensisB2Bak.，标本存放于湖北省天然产物研究与利用重点 实验室（编号：TC200207SNJ）。 1.3109176 药物制备开口箭根茎粉碎后，用甲醇回流提取 3109176 次，合并 3109176 次提取液，浓缩后经 石油醚脱脂用水饱和的正丁醇萃取，旋转蒸发回收正丁醇，浓缩液抽干后即得到开口箭总 皂苷，配成水液，过大孔树脂柱，水洗，31091760%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脱，得 开口箭四部分皂苷。 分别取开口箭甲醇提取物、开口箭总皂苷、31091760%开口箭皂苷、70%开口箭皂苷 4 个样 品，用含 10%灭活的新生小牛血清 RPMI-1640 培养液将其配制成所需浓度，依次为 62.5,125,250,500,1000,2000μg/mlg/ml。丝裂霉素(MMC)g用含 10%灭活的新生小牛血清 RPMI-1640 培养液将其配置为 250μg/mlg/ml。所有受试样品均用 0.22μg/mlm 微孔滤膜过滤除 菌。 2 方法 2.1 细胞培养 HL-60 和 Caski 细胞用 RPMI-1640 培养液（另加 10mmol/ LHEPES,2.0mg/mlNaHCO3109176，100U/ml 青霉素，100μg/mlg/ml 链霉素和 10%新生小牛血 清），于 CO2 孵箱中 31091767℃，5%CO2 饱和湿度下培养。贴壁细胞用含 0.02%EDTA 的 0.25%胰蛋白酶消化传代。 2.2MTT 比色法［6］按 Mosmann 氏法略加改进。将处于对数生长期的细胞制成单 个细胞悬液，调整细胞浓度为 0.8×105 个/ml,接种于 96 孔培养板,每孔接种 180μg/mll，转 板 6h 后加 20μg/mll 受试药,另设阴性对照组(不加药)g、空白凋零组（只有培养基）和阳性对照 组（MMC 组），每组均设 6 个复孔，培养 48h 后加 MTT(5mg/ml)g15μg/mll,继续培养 4h 后, 弃去上清液，加 DMSO100μg/mll,用全自动酶联免疫检测仪于 492nm 波长处测定吸光度 (OD)g值［7］,求出 IC50。抑制率（%）=［1-（实验组 OD 均值-空白组 OD 均值）/(对 照组 OD 均值-空白组 OD 均值）］×100%。 2.3109176 统计学处理实验数据以±s 表示，数据分析采用 SPSS11.5 统计软件进行。用 Origin 软件，通过半对数拟合直线求 IC50 值。 3109176 结果 3109176.1 开口箭总提取物和总皂苷对 HL-60 细胞的影响结果见表 1。 表 1 总提取物和总皂苷对 HL-60 细胞的抑制作用（略） 与阴性对照组比较，*P<0.05P<0.05，*P<0.05*P<0.05P<0.01；n=6 由表 1 可知开口箭总提取物和总皂苷对 HL-60 细胞的抑制作用显著，与阴性对照组相 比有显著性差异（P<0.05 或 P<0.01），且呈良好的量效关系,总皂苷的抑制作用强于总 提取物。 3109176.2 开口箭 31091760%总皂苷和开口箭 70%总皂苷对 HL-60 细胞的影响结果见表 2。 表 231091760%总皂苷和 70%总皂苷对 HL-60 细胞的抑制作用（略） 与阴性对照组比较，*P<0.05P<0.05，*P<0.05*P<0.05P<0.01；n=6 由表 2 可知开口箭 31091760%总皂苷和 70%总皂苷对 HL-60 细胞的抑制作用显著，与阴性 对照组比有显著性差异（P<0.05 或 P<0.01）。31091760%总皂苷最佳浓度为 25μg/mlg/ml，其抑 制率达 89.09%，70%总皂苷对 HL-60 细胞的抑制作用虽药物浓度的增加而增大，量效 关系明显。 3109176.3109176 开口箭总提取物和总皂苷对 Caski 细胞的影响结果见表 3109176。 表 3109176 开口箭总提取物和总皂苷对 Caski 细胞的抑制作用（略） 与阴性对照组比较，*P<0.05P<0.05，*P<0.05*P<0.05P<0.01；n=6 由表 3109176 可知开口箭总提取物和总皂苷对 Caski 细胞抑制作用明显，与阴性对照组比有 显著性差异（P<0.05 或 P<0.01）,呈良好的量效关系，总皂苷的抑制作用强于总提取物。 3109176.4 开口箭 31091760%总皂苷和 70%总皂苷对 Caski 细胞的影响结果见表 4。 表 431091760%总皂苷和 70%总皂苷对 Caski 细胞的抑制作用（略） 与阴性对照组比较，*P<0.05*P<0.05P<0.01；n=6