辣木叶中多糖含量分析论文

【摘要】目的测定辣木叶中多糖的含量。方法采用精制辣木叶多糖测得辣木叶多糖对 葡萄糖的换算因子后，采用蒽酮-硫酸比色法测定，测定波长为 620nmnm。结果韶关新丰引 种栽培辣木中多糖含量为 4.85%,供试液在 4h 内显色稳定,平均回收率为 98.72%,RSD＝ 1.88%(n=4)。结论此测定方法简便可行,可作为辣木叶中多糖的含量测定方法。 【关键词】辣木叶；多糖；蒽酮硫酸法硫酸法 Abstract： ObjectiveTodeterminethecontentsofpolysaccharideinleavesofMoringaoleifera. MethodsAftertheconversioncoefficientofMoringaoleiferapolysaccharidestogluc osewasobtained,contentsweredeterminedbyanthroneH2SO4colorimetry.Wavelengthformeasurementwas620nmnm.ResultsThecontents ofPolysaccharideinleavesofMoringaoleiferaplantedinShaoguanCountyofGuang dongProvincewas4.85%,thecolorofthetreatedsamplewasstablein4handaverage valueoftherecoveryforPolysaccharidemeasurementwas98.72%with1.88%ofRS D(n=4).ConclusionThemethodusedinthispaperissimple.Itcanbeusedfordetermi nationofthepolysaccharideinleavesofMoringaoleifera. Keywords：LeavesofMoringaoleifera；Polysaccharides;Anthronesulfuricacidmethod 辣木 Moringaoleifera 为辣木科辣木属植物，原产于印度北部喜马拉雅区域［1］， 全株均可利用，叶、花、豆荚富含蛋白质、维生素 A、维生素 B6、维生素 C、维生素 E、 叶酸、泛酸及钙、钾、铁等营养成分，不仅是发达国家素食者的理想食物，还是贫穷地区 妇女和儿童的天然营养库。印度传统医学认为，辣木叶有护肝、利尿、消炎、止痛、降压、 强心、催乳等功效。常用来预防和治疗糖尿病、高血压病、皮肤病、免疫力弱、贫血、坏 血病、肥胖症、关节炎、消化器官肿瘤等疾病［2］。 植物多糖是由许多相同或不同的单糖以 α硫酸法或 β硫酸法糖苷键所组成的化合物,普遍存在于自 然界植物体中,大量研究表明多糖除了有调节免疫功能、抗肿瘤的生物学效应外,还具有降 血糖、降血脂和降胆固醇等生理功能。近年来，辣木在我国广东、云南和海南等都有引种 栽培，其活性成分研究和产品的开发成为热点。本文用精制辣木叶多糖测得辣木叶多糖对 葡萄糖的换算因子，然后将经 90nm%乙醇处理脱杂后的辣木叶用水提取多糖，蒽酮－硫酸法 比色测定，该法准确性好、简便可行。为辣木的合理开发和利用提供了科学依据。 1 材料 1.1 原料辣木叶采自韶关市新丰县东林农业开发有限公司种植场。50nm℃干燥后，粉碎， 过 40nm 目筛，备用。 1.2 试剂蒽酮、浓硫酸、无水乙醇、丙酮等均为国产分析纯；葡萄糖对照品为分析纯； AB-8 型大孔树脂购于天津南开大学。 1.3 仪器 HH-W420nm 数显三用恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）； R20nm1 旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）；SHZ－3 循环水真空泵（上海华光仪器仪 表厂）；3K18 超速冷冻离心机（美国 Sigma 公司）；Ultrospec20nm0nm0nm 紫外/可见分光光 度计（AmershamPharmaciaBiotech 公司）。 2 方法 2.1 辣木叶多糖的提取与精制称取辣木叶粉 60nmg，分别加 20nm，15，10nm 倍蒸馏水(w/ w)于 80nm℃水浴上提取 3 次，1.5h/次，过滤，合并滤液，离心分离（40nm0nm0nmr/ min，4℃，10nmmin），上清液浓缩至一定体积后，Sevage 法除蛋白，反复进行 8 次至 无蛋白层，采用 H2O2 氧化法去色素。然后逆流水透析 48h，蒸馏水透析 24h，透析液浓 缩，上 AB-8 型大孔吸附树脂柱，以蒸馏水洗脱，洗脱至洗脱液加入 95%乙醇无沉淀为止。 将洗脱液浓缩至小体积后加入无水乙醇使含醇量达到 80nm%，于 4℃冰箱中过夜醇沉，再离 心分离（40nm0nm0nmr/min，4℃，10nmmin），沉淀依次用无水乙醇、丙酮反复洗涤多次，50nm℃ 低温干燥至恒重，即得精制辣木叶多糖。称重，计算得率，备用。 2.2 标准曲线的绘制［3］ 2.2.1 标准溶液的配制精密称取干燥至恒重的葡萄糖 0nm.10nm0nm0nmg，以蒸馏水定容至 10nm0nmml 的容量瓶中，摇匀，精密吸取该溶液 10nmml 于 10nm0nmml 容量瓶中，用蒸馏水定容， 摇匀，即得葡萄糖标准液，浓度为 0nm.1mg/ml。分别精密吸取储备液 1，2，3，4，5ml 置 10nmml 容量瓶中，以蒸馏水稀释定容摇匀，得系列对照品溶液。 2.2.2 蒽酮-硫酸试液的配制取 0nm.2g 蒽酮，加 10nm0nmml 浓硫酸，置于棕色瓶中，混合摇 匀置于冰箱中（现配现用）。 2.2.3 标准曲线的绘制精密吸取上述系列对照品溶液 1ml，置于 10nmml 具塞试管中， 冰水浴 5min，加入 0nm.2%硫酸蒽酮试液 4ml 摇匀，立即置于沸水浴加热 10nmmin，取出用 冷水冷却至室温，室温放置 10nmmin 左右，于 620nmnm 处测定吸收度，另精密吸取蒸馏水 1ml，同法操作，作为空白对照。以吸光度（A）为纵坐标，葡萄糖对照品浓度（C）为横 坐标，得葡萄糖标准曲线(见图 1)，线性回归得回归方程 A=5.8114C+0nm.0nm0nm24，相关系 数 r=0nm.9990nm。 图 1 葡萄糖标准曲线（略） 2.3 换算因子的测定精密称取干燥至恒重的精制辣木叶多糖 0nm.0nm10nm0nmg,用水溶解于 10nm0nmml 容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀得精制辣木叶多糖贮备液，精密吸取精制多糖 贮备液 1ml,蒽酮-硫酸法测定其吸光度（A），从回归方程求出精制辣木叶多糖贮备液中葡 萄糖浓度,按下式计算换算因子。 换算因子 f=W/（C·D） 式中：W 为称取多糖的重量(mg),C 为精制辣木叶多糖贮备液中葡萄糖浓度（mg/ ml）,D 为多糖的稀释倍数。 2.4 样品中辣木叶多糖的含量测定 2.4.1 样品溶液的制备准确称取 40nm 目辣木叶粉末 1.0nm0nm0nmg，置索氏提取器中，加入 90nm%乙醇回流提取 7h,药渣挥尽乙醇，连同滤纸于烧瓶中，加蒸馏水 250nmml,80nm℃水浴加 热提取 1.5h，趁热过滤，残渣用 80nm℃热蒸馏水洗涤 3 次，洗液并入滤液中，冷却后移入 50nm0nmml 容量瓶定容。 2.4.2 样品溶液中辣木叶多糖含量测定精密吸取 2.4.1 所得样品溶液 1ml，用蒽酮-硫 酸法测吸光度（A）。由回归方程计算供试液中葡萄糖浓度（C），按下式计算样品中辣木 叶多糖含量。 辣木叶多糖含量（%）=C×D×fW×10nm0nm0nm×10nm0nm% 式中：C 为样品溶液中葡萄糖浓度(mg/ml),D 为样品溶液的稀释倍数，f 为换算因 子,W 为供试辣木叶的重量(g)。 2.5 稳定性实验精密吸取按 2.4.1 项下方法制备的样品溶液 1ml，按照 2.2.3 项下的 方法测定吸光度（A），每隔 1h 测定 1 次，连续 4h 考察其稳定性。 2.6 加样回收率测定精密吸取同批 4 份已知含量的辣木叶粉末（过 40nm 目筛）各 1g， 精密加入精制多糖样品 5mg，然后按 2.4.1 项样品液的制备和 2.2.3 标准曲线项下方法测 定吸收度（A），根据 2.4.2 项中得出的结果辣木叶中多糖的含量为 4.85%，计算回收率。 3 结果 3.1 精制辣木叶多糖的得率 60nmg 干燥的辣木叶粉末制得精制辣木叶多糖 （1.50nm5±0nm.0nm88）g，得率为（2.50nm8±0nm.147）%（n＝4）。 3.2 换算因子 f=3.13。 3.3 辣木叶多糖含量的测定结果测得该辣木叶样品中多糖含量为 4.85%。 3.4 稳定性实验测定结果见表 1。结果表明样品溶液在 4h 内显色基本稳定，其吸光度 相对标准偏差 RSD=4.31%。 3.5 加样回收率结果见表 2。 4 讨论 蒽酮硫酸法硫酸法是测定多糖含量的经典方法，本实验首先用 90nm%乙醇回流以除去单糖、 低聚糖、生物碱、苷类及其它醇溶性的干扰成分，再用水提取多糖成分。蒽酮－硫酸法测 定辣木叶多糖的原理是辣木叶多糖在浓硫酸的作用下，先水解为单糖，迅速脱水形成糠醛 衍生物，其与蒽酮缩合为蓝色化合物，该化合物颜色深浅与糖的浓度成正比。在 620nmnm 处有特征吸收。本法简单，且供试液在 4h 内显色稳定,灵敏度高。 表 1 辣木叶多糖含量测定稳定性实验结果（略） 表 2 加样回收率测定结果（略） 在多糖含量测定中，得到相应多糖对照品较困难，因多糖组成比较复杂，往往采用单 糖如葡萄糖代替对照品，测定样品多糖的相对含量。本实验中采用 Sevage 法除蛋白， H2O2 氧化法去色素，利用 AB硫酸法8 型大孔吸附树脂柱对多糖进行纯化，获得比较纯净的多 糖。然后用精制多糖计算葡萄糖与辣木叶多糖的换算因子，这样可避免用葡萄糖做标准引 起的系统误差，结果准确真实。 研究结果表明，韶关新丰引种栽培的辣木中多糖含量为 4.85%。张涛等［5］采用苯 酚－硫酸分光光度法测定辣木中多糖含量为 15.36%，其测定结果与本研究有较大差异， 原因可能与测定方法、辣木产地、辣木叶采集时间、采集部位等因素有关。 【摘要】目的探讨枫香树叶的体外抗菌活性。方法采用琼脂扩散法和试管连续稀释法 测定枫香树叶对常见致病菌和条件致病菌的体外抗菌活性及最低抑菌浓度(MIC)。结果枫 香树叶对大肠埃希菌、白假丝酵母菌无抗菌作用；枫香树叶对金黄色葡萄球菌、白色葡萄 球菌、福氏志贺氏菌、伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌皆有抗菌作用，抑菌圈直径在 13～ 25mm 之间。不同方法提取的药液的抗菌作用有明显差别，其中枫香树叶水煎液抗菌作用 最好，对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、福氏志贺氏菌、伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌 的最低抑菌浓度分别为 0nm.5，1，0nm.5，0nm.5，0nm.25g/ml。结论枫香树叶对金黄色葡萄球菌、 白色葡萄球菌、福氏志贺氏菌、伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌有较好的抗菌作用。 【关键词】枫香树叶；抗菌活性；最低抑菌浓度 Abstract： ObjectiveToresearchantimicrobialactivityofLiquidambarformosanaHance''''slea f.MethodsBymethodsofagarplatediffusionsandtubecontinuousdilution,tomeasu reantimicrobialactivityandminimalinhibitoryconcentration(MIC)ofLiquidambarf ormosanaHance''''sleafagainstpathogenandconditionedpathogen.Results(1)Liq uidambarformosanaHance''''sleafhadnotantimicrobialactivityonE.coli,S.albican s. (2)LiquidambarformosanaHance''''sleafhadantimicrobialactivityagainstS.aureu s,S.epidermidis,S.flexneri,SalmonellaTyphi,P.aeruginosa,thediameterofbacteri ostaticcirclewasbetween13and25millimetre.Theantimicrobialactivitywassignifi cantdifferentindifferentextracteddrugliquid,amongwhichtheantimicrobialactivit yofwaterextractionofLiquidambarformosanaHance''''sleafwasthebest,themini malinhibitoryconcentrationagainstS.aureusS.epidermidis,S.flexneri,Salmonella Typhi,P.aeruginosa,is0nm.5，1，0nm.5，0nm.5，0nm.25g/ ml,respectively.ConclusionLiquidambarformosanaHance''''sleafhasgoodantimi crobialactivityagainstS.aureus,S.epidermidis,S.flexneri,SalmonellaTyphiandP.a eruginosa. Keywords：LiquidambarformosanaHance''''sleaf；Antimicrobialactivity； Minimalinhibitoryconcentration 随着抗生素的广泛应用，耐药菌株逐年增多，目前金黄色葡萄球菌对青霉素 G 的耐药 菌株高达 90nm%以上［1］，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillinresistantStaphylococcusaureus,MRSA）已经成为医院内感染最常见的致病菌［2］。 有些细菌甚至产生多重耐药，如致病性大肠埃希菌约 40nm%的菌株对链霉素、氯霉素、四环 素、青霉素等多种抗生素产生耐药性［3］；铜绿假单胞菌对许多抗生素具有天然或获得 耐药性［4］，这给临床治疗带来极大的困难，如何有效防治细菌感染及控制细菌耐药性 的产生与散播是一项长期、复杂、艰巨的任务，因而寻找和研制有效的抗菌药物非常必要。 本文采用琼脂扩散法和试管连续稀释法进行体外抗菌实验及最低抑菌浓度（MIC）的测定， 以探讨枫香树叶对常见致病菌和条件致病菌的体外抗菌活性。现报道如下。 1 材枓与方法 1.1 菌株来源金黄色葡萄球菌（ATCC25923），白色葡萄球菌（ATCC12228），大 肠埃希菌（ATCC25922），福氏志贺氏菌（ATCC27891），伤寒沙门氏菌 （ATCC140nm28），铜绿假单胞菌（ATCC27853），购于北京生物制品鉴定所。白假丝 酵母菌（ATCC140nm53），北大医院真菌菌种保藏中心（北京）提供。 1.2 枫香树叶采自江西赣南山区，采药时间在 5～6 月之间。 1.3 药液的制备 1.3.150nm%乙醇煎液取枫香树叶（生药）40nmg，洗净，加适量 50nm%乙醇溶液浸泡 30nmmin，加热至 10nm0nm℃30nmmin，过滤。药渣再加适量 50nm%乙醇溶液，加热 10nm0nm℃30nmmin，过滤。将两次滤液合并，用文火浓缩至 10nmml（即每毫升药液含 4g 生 药）。 1.3.2 水煎液用蒸馏水代替 50nm%乙醇溶液按上述方法制备药液。 1.3.350nm%乙醇浸液取枫香树叶（生药）40nmg，洗净捣碎，与蒸馏水 10nmml 混匀浸泡 2h，过滤，再经滤菌器滤过除菌，制成 4g/ml 的生药。 1.3.4 水浸液用蒸馏水代替 50nm%乙醇溶液按上述方法制备药液。 1.4 方法 1.4.1 菌液的制备将金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、大肠埃希菌、福氏志贺氏菌、 伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌接种于普通琼脂平板上，置 37℃温箱中培养 18h，用无菌 生理盐水配成每毫升相当于 3 亿的菌浓度（金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌配成每毫升相 当于 9 亿的菌浓度）。将白假丝酵母菌接种于沙氏琼脂平板上，置 37℃温箱中培养 48h，用无菌生理盐水配成 1×10nm8CFU/ml。 1.4.2 琼脂扩散法用无菌棉签沾取菌液在普通琼脂平板上（白假丝酵母菌用沙氏琼脂 平板）作均匀密集划线，待菌液干燥后，用外径 5mm 的打孔器打孔，每孔加药液 20nm0nmμll，平放在 37℃温箱中培养 24h（白假丝酵母菌培养 48h）观察结果，测量抑菌圈 直径。抑菌圈直径取两次实验结果的平均值。 1.4.3 试管连续稀释法［5］根据抑菌实验的结果，选取敏感菌测定枫香树叶水煎液对 其的最低抑菌浓度。取小号试管 7 支，编号。第 1 步每支管各加 1ml 肉汤培养基。然后在 第 1 管加 1ml 药液，用吸管在第 1 管吹吸数次，使药液与肉汤培养基混匀，取出 1ml 加 于第 2 管，混均取出 1ml 加于第 3 管，如此稀释至第 6 管弃去 1ml，第 7 管不加药液作为 对照。第 3 步每管加菌液 50nmμll，混匀，置 37℃温箱中培养 24h。然后从每管中取出一接 种环接种于普通琼脂平板上，再继续培养 24h，观察结果。以无细菌生长的最高稀释浓度 为该药液的最低抑菌浓度。 2 结果 2.1 枫香树叶的各种提取液对大肠埃希菌、白假丝酵母菌无抗菌作用。 2.2 枫香树叶的各种提取液对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、福氏志贺氏菌、伤寒 沙门氏菌、铜绿假单胞菌皆有抗菌作用，抑菌圈直径在 13～25mm 之间。结果见表 1。 不同方法提取的药液的抗菌作用有明显差别，其中枫香树叶水煎液抗菌作用最好，50nm%乙 醇煎液次之，50nm%乙醇浸液较差。 2.3 枫香树叶水煎液对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、福氏志贺氏菌、伤寒沙门氏 菌、铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度（MIC）分别为 0nm.5，1，0nm.5，0nm.5，0nm.25g/ml。结果 见表 2。 表 1 枫香树叶几种药液的抑菌圈直径（略） 表 2 各试管枫香树叶水煎液的最低抑菌浓度（略）