金银花中绿原酸含量研究论文

【摘要】目的以绿原酸含量为指标，比较不同产地加工的金银花品质。方法采用高效 液相色谱法，使用 DiamonsilTMC18(250mm×4.6mm,5μm)m)色谱柱；以乙腈-0.4%磷 酸溶液（15∶85）为流动相；检测波长为 327nmnm；柱温 30℃；流速 1.0ml/min。结果蒸 制后干燥的产地加工法优于直接干燥的加工方法。结论不同产地加工方法的金银花中绿原 酸含量有较大差异。 【关键词】金银花；绿原酸；产地加工；高效液相色谱法 ComparisonontheChlorogenicAcidContentinFlosLoniceraeProcessedinDiffer entProducingAreas Abstract： ObjectiveTocomparethequalityofFlosLoniceraeprocessedindifferentproducinga reas.MethodsThecontentofchlorogenicacidinFlosLoniceraewasdeterminedbyHP LC.DiamonsilTMC18(250mm×4.6mm,5μm)m)wasusedandthemobilephasewasAc etonitrile0.4%Phosphoricacid(15∶85).Thewavelengthofdetectorwas327nmnm,thecolumnte mperaturewas30℃andtheflowratewas1.0ml/ min.ResultsSteamingandovendryingwerebetterthandirectdrying.ConclusionTh econtentofchlorogenicacidisdifferentintheFlosLoniceraeprocessedbydifferentpr ocessinginproducingareas. Keywords： FlosLonicerae;Chlorogenicacid;Processinginproducingareas;HPLC 金银花具有广泛的药用价值，可以清热解毒、凉血化淤，主治外感风热、瘟病初起、 疮疡疔毒、红肿热痛、便脓血、增强免疫功能等。金银花的常见药用制品有银翘解毒丸、 栀子金花丸、银翘解毒片、银翘散、五味消毒饮、祛感灵胶囊、咽炎冲剂、外阴洗剂等 ［1，2］，另外金银花也能够起到防风固沙、保持水土、改良土壤、改善生态、绿化环境 的多重效用。金银花其药用价值主要由其所含化学成分来体现。通过研究得知，金银花化 学成分复杂，已鉴别出的就有 60 多种，其中具有生物活性，并已搞清楚结构的化合物主 要有：绿原酸、异绿原酸、黄酮类的木犀草素和挥发油类的芳樟醇等［3～5］。 中药的使用注重产地加工及炮制，不同的加工炮制方法对中药的使用有着不同的意义。 而金银花在《中国药典》2000 年版Ⅰ部及《浙江省中药炮制规范Ⅰ部及《浙江省中药炮制规范部及《浙江省中药炮制规范 1994 年版Ⅰ部及《浙江省中药炮制规范》中均未提 及产地加工中应蒸制后再干燥［1，2］，翻阅以往文献也未有所获；但在民间采收过程中 常有蒸制后再干燥的加工习惯。由于在金银花各化学成分中绿原酸具有抗菌、抗病毒、止 血、抗肝炎等特殊作用，因此普遍把绿原酸含量的高低作为衡量金银花质量的标准 ［5］。本论文的主要内容就是以金银花中绿原酸的含量为指标，以 HPLC 法为手段，比 较两种不同产地加工的金银花的品质。 1 材料 1.1 仪器 Waters510 色谱系统，490E 紫外检测器。HS 色谱数据工作站 V4.0+（杭 州英谱科技开发有限公司）。 1.2 试药对照品：绿原酸（chlorogenicacid）购自中国药品生物制品检定所，批号 为 7nm53-200111；高纯水，其他试剂均为色谱纯。 1.3 样品取自金华琅琊，经鉴定为忍冬科植物金银花 LoniceraconfusaDC.的干燥花 蕾或带初开的花。1 号样品采收后直接干燥，2 号样品采收后经蒸制再干燥。 2 方法与结果 2.1 色谱条件与系统适用性实验色谱柱为 DiamonsilTMC18(250mm×4.6mm，5μm)m)，流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液 （15∶85），流速 1.0ml·min-1，检测波长 327nmnm，柱温 30℃，AUFS0.3；进样量 20μm)l；理论板数按绿原酸峰计算不低于 5000。 2.2 供试品溶液的制备分别取 1 号和 2 号样品研成细粉，精密称取细粉各约 0.5g，置 具塞锥形瓶中，精密加入 50%甲醇 50ml，称定重量，超声处理 30min，放冷，再称定重 量，用 50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密取续滤液 5ml，置 25ml 棕色量瓶中， 加 50%甲醇至刻度，摇匀即得。 2.3 对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品 0.0106g，置棕色容量瓶中加 50%甲醇 溶解并稀释至 50.0ml，即为对照品溶液。 2.4 线性关系考察精密吸取对照品溶液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，置棕色量瓶中 加 50%甲醇稀释至 10.0ml，摇匀，按上述色谱条件测定绿原酸的峰面积，以峰面积积分 值为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y＝2.19×108X－ 1.52×105，r=0.9996，绿原酸进样浓度在 21.20～106.0μm)g·ml-1 内峰面积积分值与 浓度呈线性关系。 2.5 进样精密度实验精密吸取对照品溶液 2.0ml，置棕色量瓶中加 50%甲醇稀释至 10.0ml，摇匀，作为对照液，连续进样 5 次，测定峰面积，RSD=0.7nm1%。 2.6 稳定性实验精密吸取 2．4 项下对照液，每隔 1h 进样 1 次，测定绿原酸峰面积积 分值，RSD=0.7nm7nm%，结果表明在 5h 内稳定性较好。 2.7nm 加样回收实验分别取样品适量，精密加入对照品溶液 2.0ml(0.212mg·ml-1)， 按 2．2 项下方法制备供试品溶液，测定并计算回收率。结果见表 1。 表 1 样品中绿原酸回收率测定结果（略） 2.8 样品测定分别精密吸取 2．2 项下对照液与 1 号和 2 号供试品溶液各 20μm)l 分别进 样测定。用外标法计算样品中绿原酸的百分含量。结果见图 1 及表 2。 A.对照品 B.药材 a.绿原酸 图 1 药材和对照品的 HPLC（略） 表 2 不同产地加工金银花中绿原酸的含量测定结果（略） 3 讨论 绿原酸的 50%甲醇溶液应避光阴凉处保存，否则峰面积会有所改变而影响测定的准确 性。 从表 2 可见，不同产地加工成的金银花样品中绿原酸含量差别较大，产地加工中经蒸 制后再干燥的样品含量要比直接干燥的样品高出 5 倍多。建议产地加工方法写入标准中， 以确保绿原酸的含量。 通过对不同产地加工的金银花中绿原酸的含量测定的比较，未经蒸制直接干燥的金银 花中绿原酸含量仅为 1.0%，而蒸后干燥的则有 5.7nm%，就绿原酸的含量来说，蒸制后干燥 的产地加工方法优于直接干燥的加工方法。 本课题还需对不同产地加工的金银花进行指纹图谱研究、谱效关系的研究等，进一步 从更全面的角度说明产地加工的优劣。 【摘要】目的测定辣木叶中多糖的含量。方法采用精制辣木叶多糖测得辣木叶多糖对 葡萄糖的换算因子后，采用蒽酮-硫酸比色法测定，测定波长为 620nm。结果韶关新丰引 种栽培辣木中多糖含量为 4.85%,供试液在 4h 内显色稳定,平均回收率为 98.7nm2%,RSD＝ 1.88%(n=4)。结论此测定方法简便可行,可作为辣木叶中多糖的含量测定方法。 【关键词】辣木叶；多糖；蒽酮硫酸法硫酸法 Abstract： ObjectiveTodeterminethecontentsofpolysaccharideinleavesofMoringaoleifera. MethodsAftertheconversioncoefficientofMoringaoleiferapolysaccharidestogluc osewasobtained,contentsweredeterminedbyanthroneH2SO4colorimetry.Wavelengthformeasurementwas620nm.ResultsThecontents ofPolysaccharideinleavesofMoringaoleiferaplantedinShaoguanCountyofGuang dongProvincewas4.85%,thecolorofthetreatedsamplewasstablein4handaverage valueoftherecoveryforPolysaccharidemeasurementwas98.7nm2%with1.88%ofRS D(n=4).ConclusionThemethodusedinthispaperissimple.Itcanbeusedfordetermi nationofthepolysaccharideinleavesofMoringaoleifera. Keywords：LeavesofMoringaoleifera；Polysaccharides;Anthronesulfuricacidmethod 辣木 Moringaoleifera 为辣木科辣木属植物，原产于印度北部喜马拉雅区域［1］， 全株均可利用，叶、花、豆荚富含蛋白质、维生素 A、维生素 B6、维生素 C、维生素 E、 叶酸、泛酸及钙、钾、铁等营养成分，不仅是发达国家素食者的理想食物，还是贫穷地区 妇女和儿童的天然营养库。印度传统医学认为，辣木叶有护肝、利尿、消炎、止痛、降压、 强心、催乳等功效。常用来预防和治疗糖尿病、高血压病、皮肤病、免疫力弱、贫血、坏 血病、肥胖症、关节炎、消化器官肿瘤等疾病［2］。 植物多糖是由许多相同或不同的单糖以 α硫酸法或 β硫酸法糖苷键所组成的化合物,普遍存在于自 然界植物体中,大量研究表明多糖除了有调节免疫功能、抗肿瘤的生物学效应外,还具有降 血糖、降血脂和降胆固醇等生理功能。近年来，辣木在我国广东、云南和海南等都有引种 栽培，其活性成分研究和产品的开发成为热点。本文用精制辣木叶多糖测得辣木叶多糖对 葡萄糖的换算因子，然后将经 90%乙醇处理脱杂后的辣木叶用水提取多糖，蒽酮－硫酸法 比色测定，该法准确性好、简便可行。为辣木的合理开发和利用提供了科学依据。 1 材料 1.1 原料辣木叶采自韶关市新丰县东林农业开发有限公司种植场。50℃干燥后，粉碎， 过 40 目筛，备用。 1.2 试剂蒽酮、浓硫酸、无水乙醇、丙酮等均为国产分析纯；葡萄糖对照品为分析纯； AB-8 型大孔树脂购于天津南开大学。 1.3 仪器 HH-W420 数显三用恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）； R201 旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）；SHZ－3 循环水真空泵（上海华光仪器仪 表厂）；3K18 超速冷冻离心机（美国 Sigma 公司）；Ultrospec2000 紫外/可见分光光 度计（AmershamPharmaciaBiotech 公司）。 2 方法 2.1 辣木叶多糖的提取与精制称取辣木叶粉 60g，分别加 20，15，10 倍蒸馏水(w/ w)于 80℃水浴上提取 3 次，1.5h/次，过滤，合并滤液，离心分离（4000r/ min，4℃，10min），上清液浓缩至一定体积后，Sevage 法除蛋白，反复进行 8 次至 无蛋白层，采用 H2O2 氧化法去色素。然后逆流水透析 48h，蒸馏水透析 24h，透析液浓 缩，上 AB-8 型大孔吸附树脂柱，以蒸馏水洗脱，洗脱至洗脱液加入 95%乙醇无沉淀为止。 将洗脱液浓缩至小体积后加入无水乙醇使含醇量达到 80%，于 4℃冰箱中过夜醇沉，再离 心分离（4000r/min，4℃，10min），沉淀依次用无水乙醇、丙酮反复洗涤多次，50℃ 低温干燥至恒重，即得精制辣木叶多糖。称重，计算得率，备用。 2.2 标准曲线的绘制［3］ 2.2.1 标准溶液的配制精密称取干燥至恒重的葡萄糖 0.1000g，以蒸馏水定容至 100ml 的容量瓶中，摇匀，精密吸取该溶液 10ml 于 100ml 容量瓶中，用蒸馏水定容， 摇匀，即得葡萄糖标准液，浓度为 0.1mg/ml。分别精密吸取储备液 1，2，3，4，5ml 置 10ml 容量瓶中，以蒸馏水稀释定容摇匀，得系列对照品溶液。 2.2.2 蒽酮-硫酸试液的配制取 0.2g 蒽酮，加 100ml 浓硫酸，置于棕色瓶中，混合摇 匀置于冰箱中（现配现用）。 2.2.3 标准曲线的绘制精密吸取上述系列对照品溶液 1ml，置于 10ml 具塞试管中， 冰水浴 5min，加入 0.2%硫酸蒽酮试液 4ml 摇匀，立即置于沸水浴加热 10min，取出用 冷水冷却至室温，室温放置 10min 左右，于 620nm 处测定吸收度，另精密吸取蒸馏水 1ml，同法操作，作为空白对照。以吸光度（A）为纵坐标，葡萄糖对照品浓度（C）为横 坐标，得葡萄糖标准曲线(见图 1)，线性回归得回归方程 A=5.8114C+0.0024，相关系 数 r=0.9990。 图 1 葡萄糖标准曲线（略） 2.3 换算因子的测定精密称取干燥至恒重的精制辣木叶多糖 0.0100g,用水溶解于 100ml 容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀得精制辣木叶多糖贮备液，精密吸取精制多糖 贮备液 1ml,蒽酮-硫酸法测定其吸光度（A），从回归方程求出精制辣木叶多糖贮备液中葡 萄糖浓度,按下式计算换算因子。 换算因子 f=W/（C·D） 式中：W 为称取多糖的重量(mg),C 为精制辣木叶多糖贮备液中葡萄糖浓度（mg/ ml）,D 为多糖的稀释倍数。 2.4 样品中辣木叶多糖的含量测定 2.4.1 样品溶液的制备准确称取 40 目辣木叶粉末 1.000g，置索氏提取器中，加入 90%乙醇回流提取 7nmh,药渣挥尽乙醇，连同滤纸于烧瓶中，加蒸馏水 250ml,80℃水浴加 热提取 1.5h，趁热过滤，残渣用 80℃热蒸馏水洗涤 3 次，洗液并入滤液中，冷却后移入 500ml 容量瓶定容。 2.4.2 样品溶液中辣木叶多糖含量测定精密吸取 2.4.1 所得样品溶液 1ml，用蒽酮-硫 酸法测吸光度（A）。由回归方程计算供试液中葡萄糖浓度（C），按下式计算样品中辣木 叶多糖含量。 辣木叶多糖含量（%）=C×D×fW×1000×100% 式中：C 为样品溶液中葡萄糖浓度(mg/ml),D 为样品溶液的稀释倍数，f 为换算因 子,W 为供试辣木叶的重量(g)。 2.5 稳定性实验精密吸取按 2.4.1 项下方法制备的样品溶液 1ml，按照 2.2.3 项下的 方法测定吸光度（A），每隔 1h 测定 1 次，连续 4h 考察其稳定性。 2.6 加样回收率测定精密吸取同批 4 份已知含量的辣木叶粉末（过 40 目筛）各 1g， 精密加入精制多糖样品 5mg，然后按 2.4.1 项样品液的制备和 2.2.3 标准曲线项下方法测 定吸收度（A），根据 2.4.2 项中得出的结果辣木叶中多糖的含量为 4.85%，计算回收率。 3 结果 3.1 精制辣木叶多糖的得率 60g 干燥的辣木叶粉末制得精制辣木叶多糖 （1.505±0.088）g，得率为（2.508±0.147nm）%（n＝4）。 3.2 换算因子 f=3.13。 3.3 辣木叶多糖含量的测定结果测得该辣木叶样品中多糖含量为 4.85%。 3.4 稳定性实验测定结果见表 1。结果表明样品溶液在 4h 内显色基本稳定，其吸光度 相对标准偏差 RSD=4.31%。 3.5 加样回收率结果见表 2。 4 讨论 蒽酮硫酸法硫酸法是测定多糖含量的经典方法，本实验首先用 90%乙醇回流以除去单糖、 低聚糖、生物碱、苷类及其它醇溶性的干扰成分，再用水提取多糖成分。蒽酮－硫酸法测 定辣木叶多糖的原理是辣木叶多糖在浓硫酸的作用下，先水解为单糖，迅速脱水形成糠醛 衍生物，其与蒽酮缩合为蓝色化合物，该化合物颜色深浅与糖的浓度成正比。在 620nm 处有特征吸收。本法简单，且供试液在 4h 内显色稳定,灵敏度高。 表 1 辣木叶多糖含量测定稳定性实验结果（略） 表 2 加样回收率测定结果（略） 在多糖含量测定中，得到相应多糖对照品较困难，因多糖组成比较复杂，往往采用单 糖如葡萄糖代替对照品，测定样品多糖的相对含量。本实验中采用 Sevage 法除蛋白， H2O2 氧化法去色素，利用 AB硫酸法8 型大孔吸附树脂柱对多糖进行纯化，获得比较纯净的多 糖。然后用精制多糖计算葡萄糖与辣木叶多糖的换算因子，这样可避免用葡萄糖做标准引 起的系统误差，结果准确真实。