抗生素糖基转移酶研究论文

【摘要】糖苷类抗生素是临床上广泛应用的抗菌和抗肿瘤化合物。该类化合物在体内 由糖基转移酶催化，糖基化反应通常在抗生素生物合成的最后发生，糖基的位置、类型和 数量对糖苷类抗生素的活性有很大的影响。本文综述了糖基转移酶的种类、功能、特性及 其在组合生物合成中的应用与研究前景。 【关键词】抗生素的糖基转移酶抗生素糖苷糖基化 Recentadvancesinantibioticglycosyltransferases ABSTRACTGlycosideantibiotics,acategoryofcompoundswidelyusedclinically foranti
bacterialandanti
cancer,arecatalyzedbyantibioticglycosyltransferases( Gtfs)invivo.ThesugarmoietiesaretransferredtothecorrespondingaglyconbyGtfs, oftenworkatverylatestagesofbiosynthesisofantibiotics.Theposition,typeandnu mberofsugarmoietiesincorporatedtotheantibioticshavegreatimpactonitsbioacti vity.Thisarticleprovidesanoverviewofthecategories,functions,characteristicsof Gtfs,theirapplicationsincombinatorialbiosynthesis,andtheprospectsforresearch. KEYWORDSAntibioticglycosyltransferase;Glycosideantibiotics;Glycosylatio n 抗生素糖苷在临床上主要用于抗菌和抗肿瘤，在抗生素生物合成基因簇中已经发现了 很多编码糖基转移酶的基因［1］，但人们对抗生素糖基转移酶 (antibioticglycosyltransferases，Gtfs)的特异性和催化机制了解不多。糖基与不同配 基的结合能大大增加天然产物的结构多样性，在功能上，这些糖组分通常参与目的细胞的 分子识别，影响化合物的生物活性［2］。目前，随着抗生素的广泛使用，耐药菌也在逐 年增加，迫切需要寻找新的抗生素来与之抗衡。通过糖基化增加抗生素种类和改变抗生素 活性是一条很有前景的途径，探讨糖苷类抗生素的产生机制和糖基转移酶的催化特征，有 望为发现和改造新活性的抗生素奠定基础。 1 糖苷类抗生素 很多糖苷类抗生素在生物合成中经过了立体和区域选择性的糖基化，在这一生物反应 中，糖基转移酶催化其结构中的糖基以单糖、双糖和寡糖链的形式结合到配基上从而形成 特定的 C
、N
和 O
苷(Fig.1)。糖苷类抗生素的生物合成途径中，糖基化通常是后修饰的 最后一步，如万古霉素(vancomycin)、替考拉宁(teicoplanin)的糖链都是在生物合成的 最后引入的［3］。Fig.1TheC
,N
andO
glycosideantibiotics 糖苷类抗生素的作用机制主要有两类，一类是通过抑制革兰阳性菌肽聚糖的合成，如 雷莫拉宁(ramop
lanin)［4］；另一类是抑制 DNA 促旋酶的活性，如新生霉素 (novobiocin)［5］。 2 糖苷类抗生素中糖基的主要作用 糖基化的作用和意义主要体现在以下三个方面：第一，增加化合物的水溶性。己糖衍 生物结合到抗生素糖苷配基上，增加了抗生素的亲水性利于药效的发挥，典型的有替考拉 宁环七肽上的 N
乙酰葡萄糖胺(N
acetyl
glucosamine，GlcNAc)和雷莫拉宁骨架上的甘 露糖链；第二，利于分泌。A40926 生物合成途径中的甘露糖基转移酶 (mannosyltransferase)特异识别 mannosyl
PP
C55 作为糖供体，使糖基化的抗生素利 于分泌［6］。第三，糖基化是产生菌的一种自我保护机制。在竹桃霉素(oleandomycin) 的产生过程中，糖基转移酶 OleD 使中间态抗生素糖基化，造成其在胞内短暂失活，抗生 素分泌后，再由糖苷酶水解去除糖基，使其恢复活性［7］。该机制在大环内酯类抗生素 中比较常见，类似功能的酶还有 MgtA［8］。 3 糖基转移酶 糖基转移酶在生物体内催化活化的糖连接到不同的受体分子，如蛋白、核酸、寡糖、 脂和小分子上，糖基化的产物具有很多生物学功能。在不同的 Gtfs 家族中存在一类与抗生 素生物合成相关的 Gtfs，它的功能是在抗生素生物合成的后期使其糖基化，通过糖的位置、 类型和数量的改变对抗生素的活性进行调节。 随着对抗生素生物合成基因簇的深入研究，从放线菌中已经分离了 100 多个抗生素生 物合成相关的糖基转移酶基因，序列分析表明这些基因编码的蛋白都属于糖基转移酶家族。 大多数糖基转移酶基因都具有靠近 C 端的富含甘氨酸(glycine
rich)的保守区，该保守区 也存在于 UDP
糖基和 UDP
葡糖醛酸基转移酶中。选择 GenBank 中注册的有代表性 119 条糖基转移酶序列，用 PAUP4.0 软件进行系统分析，以近邻法构建系统进化树(Fig.2)。 进化树的分析结果表明，糖基转移酶基因之间亲缘关系的远近，并不能很准确的推断其生 物学功能［9］，例如，EryCⅢ 和 MegCⅢ，在氨基酸水平上具有 83.4%的一致性，能识 别同样的配基，UrdGT1b 和 UrdGT1c 表现出了很高的同源性(具有 91%一致的氨基酸和 仅在 31 个氨基酸区域内有几个不同的氨基酸)，但是它们却转运不同的己糖，UrdGT1c 转移 L
夹竹桃糖(L
rhodinose)，UrdGT1b 转移 D
橄榄糖(D
olivose)［10］。催化 C
C、C
N 与 C
O 糖苷键形成的糖基转移酶，在基因的序列和氨基酸水平上并没有明显的 差异，如 Asm25(安丝菌素酰胺糖苷生物合成途径中催化 C
N 糖苷形成的 Gtfs) ［9，11］、UrdGT2(乌达霉素生物合成途径中催化 C
C 糖苷形成的 Gtfs) ［12］、GtfB(万古霉素生物合成后修饰中催化 C
O 糖苷形成的 Gtfs)［13］。 在万古霉素的后修饰过程中，糖基转移酶 GtfB 的 Fig.2Adendrogramofdifferentantibioticglycosyltransferases 功能是将 UDP
葡萄糖 中的葡萄糖基转移到万古霉素的骨架上，对其晶体结构的研究表明，该酶具有两个结构域， 存在于中间区域的沟可能包含 UDP
葡萄糖的结合区域［13］。糖基转移酶的结构测定将 有助于我们深入研究其催化特异性。 Gtfs 的两个显著特征是：第一，在抗生素生物合成过程最后起作用，这一点使其在组 合生物合成中能得到灵活的应用，其底物结构特异性的阐明可以为新结构和新功能化合物 的发现奠定基础。Gtfs 催化的糖基转移反应中，己糖的 C1 通过三磷酸核苷的去磷酸来激 活，从而在亲电子的 C1 位置上捕获糖基底物，然后经亲核攻击，与糖苷配基的羟基结合。 第二，大部分的糖基转移酶可以催化活化的己糖结合到糖苷配基底物的羟基上，形成 C
O 糖苷，仅少数例外，如在 rebeccamycin［14］和 urdamycin［13］的衍生物中存在糖 基通过 C
N 和 C
C 键与糖苷配基结合的化合物。安丝菌素的 YMG 平板培养发酵物分离得 到了安丝菌素酰胺 N 糖苷类化合物，其结构中的糖基通过酰胺键上的 N 与糖苷配基骨架相 连［11］。在 urdamycin 的生物合成中，可能是由于亲核的 C 原子和酚类的羟基处于邻 位导致 C
C 糖苷键的形成［12］，但是催化 C
N 和 C
C 形成的糖基转移酶其特异性还没 有得到深入的研究。 3.1Gtfs 的应用研究 (1)生物体内的研究 Gtfs 的体内研究主要采用遗传学方法进行，一种方法是通过质粒 介导的基因替代宿主菌自身的 TDP
去氧己糖合成酶基因，筛选到的突变体作细胞工厂用于 抗生素的改造。这些研究包括工程化的 daunomycin(道诺霉素)［15］途径用于苦霉素 (pikromycin)产生菌 S.venezuleae 和 urdamycin 的产生菌 S.fradiae 中生产 4′
差向异 构的糖基和具有不同糖单元的蒽环类抗生素［16，17］。 另外一种方法是在不同的宿主中异位表达 Gtfs，这方面的例子包括在宿主 S.erythraea 中表达 oleGII 基因产生 3
O
rhamnosyl
6
DEB、表达 tylM2 基因产生 5
O
desosaminyl(tylactone)［18］。 研究表明 Gtfs 对不同的糖分子具有底物适应性，Salas 的研究组创造出了共表达系统， 该系统把来源于 elloramycin 生物合成基因簇中的糖基合成基因盒(Cassette)和糖基转移 酶基因 elMGT 在一起成功地表达［19］。尽管很多糖基转移酶的底物广谱性已得到了证 明，但仍有很多文献还是报道了特异性的糖基转移酶基因的存在，例如，C.cyanogenus 中的 UrdGT2［20］和来自 S.spheroidNCIMB11891 的 NovM［21］。勿庸置疑，随 着更多 Gtfs 编码基因被发现以及作用机制的深入研究，在生物体内进行抗生素糖基化修饰 的策略和模式也会增加。因此，建立多样化的微生物工厂来生产不同糖基修饰的天然产物， 如表达糖基化修饰的聚酮(PK)，非核糖体肽(NRP)和杂合的 PK/NRP 类抗生素，可以为筛 选新活性化合物提供可能。 (2)Gtfs 的体外研究 Gtfs 的体外研究依赖有活性的 Gtfs、多样化的糖苷配基和糖基供 体。由于抗生素糖基转移酶在体内含量很低，异源表达操作相对简便，所以研究者多以异 源表达方式在微生物如 E.coli 或者 S.lividans 中进行异源表达获得［22］。已经有几个成 功的例子，如 NovM 首次在 S.spheroides 中发现并克隆，并以活性形式在 E.coli 中表达 和纯化［21］。通过化学合成和生物酶催化的方法来产生 TDP
D
葡萄糖都是可能的 ［23］。比较而言糖苷配基最容易得到，可以通过母体抗生素的降解控制其产生，如相应 糖苷配基很容易从万古霉素和替考拉宁分别获得，novobiocicacid 可以从酸催化新生霉 素的反应中获得。除此之外，不同的配基还可以通过全合成或部分修饰来得到。如化学合 成 daunomycin、carminomycin(洋红霉素)和博来霉素(bleomycin)的衍生物［23～ 25］。 4 糖基转移酶在组合生物合成的应用 应用遗传学方法生产新型聚酮和多肽类化合物日益得到人们的重视，表面上看重组生 物合成糖基化的化合物和聚酮、多肽一样复杂，但是和聚酮、多肽合成酶的复杂性相比， 由于催化去氧糖产生的酶及其反应机制比较保守，因此重组合成糖基化的化合物更有实践 意义［25］。 西班牙的 Salas 研究组已经建立了成功的基因克隆和表达系统用来生产活化的去氧糖， 目的基因处于操纵子的下游，通过启动子的控制可以在链霉菌中表达。在链霉菌 Streptomycesalbus 中整合糖基转移酶基因 oleGII，导入合成 L
夹竹桃糖 (L
oleandrose)的质粒后，合成红霉素内酯 B(erythronolideB)，而整合糖基转移酶基因 elmGT 后再导入生物合成 L
橄榄糖(L
olivose)的质粒 pOLV 可以成功生产特曲霉素 (tetracenomycinC)［26，27］。 Staurosporine(十字孢碱)类化合物的结构是由一个糖分子和一个杂环的吲哚卡唑单 元组成，通过化学手段较难得到，通过在一个生物体内共表达 rebeccamycin 和其它 staurosporine 类化合物生物合成基因，分离鉴定了大约产生了 30 种 staurosporine 类 衍生物［28］。通过遗传学方法改变 Gtfs 的特异性有一定难度，Salas 研究组通过共表 达糖基生物合成基因盒、Gtfs 基因(staN 和 staG)和 staurosporine 的生物合成基因成功 地替代了天然附加在吲哚卡唑基团上的糖基，为糖基转移酶在重组生物合成中的应用奠定 了基础，证明重组生物合成在生产新的糖基化产物中较药用化学更有利［16］。 4.1 使用产生菌作为细胞工厂 用产生糖苷化合物的微生物作为细胞工厂，在基因的编码区通过插入抗生素抗性标记 或删除部分基因进行敲除产生突变体，引入外源糖基转移酶基因，使其利用细胞内活化的 糖分子和微生物次生代谢的中间体合成新的抗生素。这种方法已经在很多生产菌株如红霉 素(erythromycin)［29］、普卡霉素(plicamycin)、urdamycin、酒霉素 (methymycin)［29］和苦霉素(pikro
mycin)上得到应用［30］。 另外一种促使不同糖单元结合到配基上的策略是在产生类似生物活性化合物的有机体 上异源表达 Gtfs，宿主作为细胞工厂提供核苷激活的糖源。配基骨架可以由宿主合成，也 可以通过控制宿主的染色体基因和外源基因来合成，或者用化合物进行饲喂。通过把来源 于万古霉素产生菌 A.orientalis 的基因 gtrE 在不产生糖基多肽 A47934 的链霉菌 S.toyocaensis 中进行表达，形成了新的糖基 A47934 衍生物［17］。 Gtfs 转运不同的糖到配基骨架的特定 C 原子上，而用基因工程的方法改变糖在骨架上 的位置更有意义，这一设想成功产生了杂合的 urdamycin 和普卡霉素抗肿瘤药物 ［30］。 4.2 使用非产生菌作为细胞工厂 在重组菌株的转化实验中，由于宿主不产生配基骨架，需要整合一个具有配基骨架生 物合成基因的质粒到宿主上或者把配基添加到培养基中，通过生物转化进行修饰。糖分子 则是通过转移一个或多个含有必须基因的质粒来提供，现在一些可以合成不同去氧己糖的 质粒已经作为一种重要的工具被开发出来［31］。 5 糖基转移酶的研究前景 最近，在糖肽的生物合成系统中得到了 Gtfs 的晶体，结构测定表明这类 Gtfs 家族有 两个共同的结构域。NDP
糖结合到 C
端，糖苷配基结合到 N
端(AGV/GtfB，DVV/GtfA) ［13］。这个两裂的结构仅仅由两个肽连接到一起，提示混合和匹配各自的结构域是可以 实现的［32，33］。因此，DNAshuffling 或相关酶定向进化可以构建看似荒诞的 Gtfs， 改变其对己糖单元和配基的底物特异性，大大提高糖苷类化合物的结构多样性，为筛选到 新活性糖苷类抗生素奠定基础。 总之，在生物合成中研究糖基化模式的多样性需要满足三个要求。 (1)建立糖基转移酶库通过重组生物合成生产新的抗生素糖苷，必须建立糖基转移酶的 基因库，才能使之在工业上得到深入应用。随着更多基因簇的序列测定，Gtfs 的数目也会 逐年增加，发现具有混合和匹配的 N
或 C
端的 Gtfs 区域用于构建杂合催化体系，改变配 基和去氧糖的识别，可以为特定的去氧糖单元寻找新结合位点［34］。 (2)建立配基的化合物库这些化合物包括简单的氨基香豆素类骨架 (aminocoumarinscaffolds)、非核糖体肽(NRP)以及芳香化的聚酮配基［25］。但是， 由相似酶催化进行 C
N，C
C 糖基化还有待于进一步的研究。 (3)建立糖供体的化合物库糖供体要包括很多 UDP 或 TDP 活化的糖和去氧糖。天然去 氧糖附加到配基上以后，赋予了配基新的活性。去氧糖的氨甲酰化在很多类型的化合物如 聚酮(新生霉素)、非核糖体肽(如替考拉宁)等抗生素中都存在，因此所有 TDP
D
和 TDP
L
去氧己糖衍生物在库中都值得准备［32，33］。 6 总结 迄今为止已经发现了很多与抗生素生物合成相关的糖基转移酶，但现有的研究还不深 入，对糖基化生物学意义、糖基转移酶结构和功能关系、催化机制、糖苷的活化形式以及 组合生物合成的应用等有待进一步探讨。沈月毛研究组发现糖苷化与微生物的生长条件有 关，同一个菌株在平板培养时产生的糖基化产物在液体培养时却检测不到。催化三种不同 类型糖苷形成的糖基转移酶之间在其作用机制及底物选择性方面到底存在那些异同，都有 赖于不同类型糖基转移酶高级结构的阐明，离实用化、产业化还有很长的一段路要走。 【摘要】目的建立辛芷颗粒的质量标准。方法采用薄层色谱法对方中麻黄、金银花、 黄芩进行定性鉴别；采用反相高效液相色谱法测定欧前胡素的含量。结果 TLC 色谱中均能 明显检出麻黄碱，黄芩苷，绿原酸。欧前胡素检测浓度在 0.1～0.5μgg 范围内线性关系良 好(r=0.9996)，平均回收率为 99.07(RSD=1.04％，n=5）。结论该方法简便、准确、 重复性好，可作为辛芷颗粒质量控制的方法。 【关键词】反相高效液相色谱法；薄层色谱法；辛芷颗粒 基金项目：河北省科技厅科技攻关项目(No.052761640) 辛芷颗粒为河北省中医院经验方。本处方的功能为散邪通窍、祛淤排脓；治疗邪毒侵 袭，热毒内蕴，或邪毒湿浊淤滞鼻窍所致鼻塞，打喷嚏，流脓涕，头胀头痛，嗅觉不灵敏， 记忆力减退等慢性鼻炎，鼻窦炎，过敏性鼻炎见上述症状者。方中辛夷、苍耳子、白芷、 薄荷、麻黄芳香散邪、通利鼻窍，为君药；金银花、黄芩、生石膏、鱼腥草有宣肺散邪、 清热解毒、消肿排脓之功效，为臣药。为有效地控制产品质量，保证临床用药安全有效， 需要控制君药白芷中主要成分欧前胡素的含量［1］。本研究采用 TLC 法对麻黄、金银花、 黄芩进行了定性鉴别，采用 RP-HPLC 法测定欧前胡素的含量，可为该制剂提供一种简便、 灵敏度高、重现性好的质量控制方法。 1 仪器与试药 Agilentl1O0 高效液相色谱仪；G1316A 紫外及可见光检测器。欧前胡素对照品(批 号：110856-200406，含量测定用)，由中国药品生物制品检定所提供，辛芷颗粒由河北 省中医院制剂科提供；氯仿为分析纯，甲醇、乙腈为色谱纯，水为高纯水。 2 辛芷颗粒的薄层色谱鉴别 2.1 麻黄的鉴别取本品 10g，研细，加浓氨试液数滴，再加氯仿 30ml，加热回流 1h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇 1ml 使溶解，作为供试品溶液。另取盐酸麻黄碱对照 品，加甲醇制成每毫升含 1mg 的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药 典》005 年版Ⅰ部附录ⅥⅠ部附录Ⅵ部附录ⅥⅥ B）试验，吸取上述两种溶液各 10μgl,分别点于同一硅胶 G 薄层