流感嗜血杆菌耐药性分析论文

【关键词】流感嗜血杆菌;耐药性;耐药机制 目前世界范围的细菌耐药性是近几年医学科学领域中研究的热点问题。流感嗜血杆菌 （Haemophilusinfluenzae,Hi）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的 耐药性呈上升趋势，引起了医学界普遍关注。继 β 内酰胺酶阴性耐氨苄西林 Hi（BLNAR）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的发现之后，世界各地又陆续报道了多重耐药菌株的出现。本文就流感嗜血杆 菌的耐药现状及其对常用抗生素的耐药机制作一综述。 1 流感嗜血杆菌的一般情况 Hi 分型研究的常用方法有生物型、血清型和荚膜型等多种，其中荚膜型/血清型对 Hi 致病性研究和菌苗研制意义重大。根据该菌细胞壁外荚膜多糖的有无，可将 Hi 分为有荚膜 的可分型和无荚膜的不可分型两类，前者再可根据其荚膜多糖抗原的不同，分为 a、b、c、d、e、f 六个血清型。 研究表明不同年代、不同地区 Hi 血清型存在较大地区差异。用直接原位聚合酶链反应 （ISPCR）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的杂交法，20 世纪 50～60 年代 Hib 的检出率是 14.3%，80 年代至 2002 年 Hib 的检出率是 20.5%［1］。陈民钧等［2］用 Hib 型抗原乳胶凝集试验对北京、上海 和广州地区的菌株进行研究，发现三个地区 Hib 分别占 1.8%、32.3%和 6.5%。之后报 道北京 2000 年 Hib 检出率是 13.7%［3］，上海 2003 年是 19%［4］。华春珍等 ［5］对 247 株 Hi 血清分型研究中不可分型菌株占 61.9%，可分型菌株占 38.1%，其中 可分型菌株中以 d 型为主，构成比达 90.4%，b 型仅 1.1%。 在国外，孟加拉国化脓性脑膜炎由 Hi 引起的占 35%，这其中有 97.1%为 Hib 感染 ［6］。意大利学者报道了 1997～1998 年分离的 Hi 菌株中 b 型占 91.2%，f 型占 0.9%，不可分型占 7.9%［7］，1998～1999 年分离的 Hi 菌株均为 Hib，2000～ 2001 年在对 7 例病人标本进行追踪检测，其中有 5 株为 e 型［8］。波兰学者从感染的下 呼吸道分泌物中分离的 Hi 菌株中 b 型占 40.3%，e 型占 38.9%，f 型占 16.7%，d 型占 4.1%［9］。 Hi 作为流感时继发感染的常见细菌，在我国尤其是儿童呼吸系统感染中占重要地位。 不同型的菌株引起的疾病种类和感染宿主年龄不尽相同，其中 b 型致病力最强，对儿童常 常危及生命。Hib 可引起严重感染，但近些年来由于 Hib 疫苗的推广使用，Hib 感染率逐 渐下降，而其它型及无荚膜型 Hi 感染日益增多。在美国，非 b 型菌株发病率有上升趋势， 在成人慢性阻塞性肺疾病（COPD）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的患者及中耳炎患儿中的检出率越来越高［10］。荚膜 作为本菌的主要毒力因子，是产生致病性的主要原因。有荚膜株常引起肺炎、败血症等侵 袭性感染，而无荚膜株是引起儿童中耳炎和呼吸道感染的重要病原并且也可引起侵袭性感 染，这与正常人呼吸道寄居者中绝大多数是无荚膜型相关联。 2 流感嗜血杆菌对抗生素的耐药现状 2.1Hi 对 β 内酰胺类的耐药性 2.1.1 青霉素类 以氨苄西林为代表，氨苄西林在 70 年代作为治疗该菌感染的首选药，自 1972 年在 欧洲首次发现 Hi 对氨苄西林耐药后，世界各地相继报道了其耐药性，呈现出明显的地区差 别。我国国内各地报道不一，在 4.8%～40.2%之间［11］，如 Hi 对氨苄西林耐药率北 京地区为 14.3%［12］，上海为 13.6%［4］，杭州为 14.2%［5］。SENTRY 抗生素 检测项目研究中氨苄西林耐药率亚太地区是 16.2%，美国是 31.5%，加拿大是 27.0%， 拉丁美洲是 12.5%，欧洲是 11.8%［13］。Tarnargo 等［14］对古巴 1990～2002 年 938 株 Hi 的耐药性研究显示 Hi 对氨苄西林的耐药呈上升趋势，为 40.7%～54.8%。 2.1.2 头孢菌素类及其它 β 内酰胺类 北京俞桑洁等［12］对 2000～2004 年临床分离的 521 株 Hi 耐药性监测结果显示： 该菌对阿莫西林/克拉维酸、头孢曲松和头孢呋辛非常敏感，对头孢克洛不敏感率由 2%增 加到 14.3%；上海张泓等［4］对 2000～2002 年分离的 Hi 药敏检测显示：该菌对头孢 唑林、头孢克洛和头孢噻肟的耐药率分别为 16.1%、7.7%和 4.0%；杭州华春珍等［5］ 对 233 株 Hi 药敏试验显示：该菌对头孢克洛、头孢噻肟、头孢曲松、亚胺培南的敏感率 分别高达 98.7%、99.6%、99.6%、99.6%，所有菌株均对阿莫西林/克拉维酸敏感。 2.2Hi 对大环内酯类、四环素类、喹诺酮类等抗生素的耐药性 北京地区 Hi 对四环素、磺胺甲基异口恶唑甲氧苄啶、氯霉素的敏感性分别在甲氧苄啶、氯霉素的敏感性分别在 55%～ 79%、22.9%～46.1%、82.4%～93.3%［12］；上海地区 Hi 对环丙沙星、复方新诺 明、氯霉素和阿奇霉素的耐药率分别为 0.9%、59.6%、5.9%和 0.8%［4］；杭州地区 Hi 对利福平、克拉霉素和氯霉素的敏感率分别为 98.7%、91.0%、90.6%，对氧氟沙星 敏感，对甲氧苄啶甲氧苄啶、氯霉素的敏感性分别在磺胺甲基异口恶唑的耐药率最高达 45.9%［5］。 在国外，SENTRY 抗生素检测项目［13］研究显示，Hi 对氯霉素、四环素、复方新 诺明耐药率美国分别为 0.4%、0.7%、14.6%；拉丁美洲分别为 1.7%、1.5%、30.8%；欧洲分别为 1.6%、2.6%、17.8%；亚太地区分别为 2.6%、2.6%、13.9%。在古巴 Hi 对常用抗生素的耐药率较高，1999～2002 年期间耐 药呈上升趋势，对氯霉素、四环素、复方新诺明耐药率分别为 40.1%～51.6%、23%～ 45.2%、45.4%～58.1%［14］。 3 流感嗜血杆菌的耐药机制 Hi 对抗生素的耐药机制可分 6 个方面：第一类为产酶机制即菌株产生质粒介导的 β 内 酰胺酶；第二类为不产酶机制，由青霉素结合蛋白（PBPs）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的改变和外膜蛋白（OMP）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的通 透性下降引起的耐药；第三类为氯霉素乙酰转移酶的产生和外膜渗透性的降低；第四类为 获得外源性 DNA 编码产生四环素耐药或产生具有核蛋白保护作用的蛋白质；第五类为二 氢还原酶的产生；第六类为编码 DNA 解旋酶和拓扑异构酶 IV 上的 A 亚单位的 gyrA 和 parC 基因的变异。 3.1Hi 对氨苄西林的耐药机制 Hi 对氨苄西林耐药的主要机制是菌株产生质粒介导的 β 内酰胺酶，PBPs 改变和 OMP 通透性下降引起的耐药较为少见［15］。 3.1.1Hi 的产酶耐药机制 Hi 产生的 β 内酰胺酶主要是由质粒介导的 TEM甲氧苄啶、氯霉素的敏感性分别在1 型酶，其次为 ROB甲氧苄啶、氯霉素的敏感性分别在1 型酶。对于编 码 TEM甲氧苄啶、氯霉素的敏感性分别在1 酶的耐药基因主要位于质粒 pBR322 上或转座子 A 上，而编码 ROB甲氧苄啶、氯霉素的敏感性分别在1 酶的耐药 基因位于 4.4kb 的 pROB 质粒上。有关研究发现 Hi 耐氨苄西林的机制，尤其是 b 型菌株， 90%产生 TEM甲氧苄啶、氯霉素的敏感性分别在1 酶，只有 8%产生 ROB甲氧苄啶、氯霉素的敏感性分别在1 酶，没有同时产生两种酶的菌株存在。在近几 年的研究中，对头孢克洛耐药的产酶菌株中 ROB甲氧苄啶、氯霉素的敏感性分别在1 占 66.7%，TEM甲氧苄啶、氯霉素的敏感性分别在1 占 33.3%，并且 研究中 ROB甲氧苄啶、氯霉素的敏感性分别在1 型 Hi 对头孢呋辛、头孢噻肟、头孢克肟和亚胺培南的敏感性与 TEM 相似 ［16］。虽然 ROB甲氧苄啶、氯霉素的敏感性分别在1 底物构象与 TEM甲氧苄啶、氯霉素的敏感性分别在1 非常类似，但其 pH 值为 8.1 使它具有能够更快 速地水解氨苄西林和更慢地水解头孢噻啶类抗生素，而且更易被邻氯西林抑制的特点。 3.1.2Hi 的不产酶耐药机制 β 内酰胺酶阴性的耐药菌株 （β甲氧苄啶、氯霉素的敏感性分别在lactamase甲氧苄啶、氯霉素的敏感性分别在negativeandampicillin甲氧苄啶、氯霉素的敏感性分别在resistance,BLNAR ）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的在 1980 年首次被报道， 其耐药机制主要是由于菌株细胞壁上一种或多种青霉素结合蛋白发生改变，引起青霉素结 合蛋白与靶位亲和力的降低，其次是由于外膜蛋白改变导致耐药［17］。PBPs 的本质是 细菌细胞膜的膜蛋白，通过短链的羧基或氨基疏水性末端连接于细菌细胞膜的表面，含量 约占细胞膜干重的 1%，相对分子质量一般在（20～120）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的×103。PBPs 作为参与细菌细 胞壁肽聚糖生物合成的酶，有催化肽聚糖聚合（转糖基作用）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的和交联（转肽作用）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的的活性 及在肽聚糖生物合成的末端反应、形态维持和糖肽结构调整等方面具有重要功能，因此它 的结构功能是细菌保持正常形态及功能的必需条件。1981 年第一次报道了氨苄西林敏感 的 Hi 的 PBPs，根据相对分子质量的大小，可将 PBPs 分为两类：一类是低分子质量的 PBPs，具有转肽酶和（或）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的水解酶活性；另一类是高分子质量的 PBPs，在某些细菌具有 转糖基酶活性。研究发现 PBPs 可分成 1、2、3、4、5、6 等，同时根据不同基因编码的 相对分子质量情况，又将其分为多个亚种，如 1a、1b、2a、2b 等。HiOMP 通透性下降 所致的耐药性并非是由于任何染色体的突变或是耐药质粒的获得，往往是对抗菌药物特异 性较差，因此具有了多重耐药性。Arbing 等［18］用 X 线衍射晶体分析 HiOMP 的结构， 认为 Hi 对抗生素的耐药性与特异性 OMPP2 的氨基酸序列的改变有关。此研究从电生理变 化与抗生素敏感性关系角度出发，通过了对离子通道选择性，电压门控及单离子通道传导 等指标的检测，来观察 OMP 对 MIC 的影响，认为其中单离子通道传导性的降低直接影响 了 Hi 对抗生素的敏感性。 3.2Hi 对氯霉素、四环素、复方新诺明、氟喹诺酮的耐药机制 Hi 对氯霉素的耐药多见于氯霉素乙酰转移酶（CAT）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的的产生，而 Jane 等证实还与外 膜渗透性的降低有关。对四环素的耐药主要为获得外源性 DNA 编码产生四环素或产生具 有核蛋白保护作用的蛋白质，也可能与前些年常用该药有关。对复方新诺明的耐药主要是 由染色体介导的二氢叶酸还原酶的过量产生。Jone 等［19］认为染色体编码的 floh 基因 突变引起对甲氧苄啶的耐药性，对磺胺类的耐药性是由染色体编码在 SulA 类似物中的基 因突变，而 Enne 等［20］认为，对磺胺类的耐药机制有别于以前，在英国和肯尼亚 Hi 对磺胺类的耐药主要是由于 SU12 基因介导和变型的 flop 基因介导。对氟喹诺酮的耐药主 要是编码 DNA 解旋酶和拓扑异构酶 IV 上的 A 亚单位的 gyrA 和 parC 基因的变异 ［21］。 3.3Hi 多重耐药产生的机制 目前，越来越多的研究发现多重耐药 Hi 的存在，这是临床治疗中最棘手的问题。不同 的耐药基因可以整合在同一转座子或质粒上进行传播引起 Hi 多重耐药，而 β 内酰胺酶中由 染色体介导的广谱 β 内酰胺酶也有可能引起多重耐药。相关报道认为可能是 Hi 的一种接合 性质粒可以同时编码产生 β 内酰胺酶和乙酰转移酶，从而决定了氨苄西林及氯霉素的双重 耐药性。 4 结束语 抗生素的广泛应用是细菌耐药性形成和耐药程度增加的重要原因，因此，合理慎用抗 生素仍是减慢耐药菌株快速增长的好方法。当 Hi 逐步地被我们认识的时候，深入了解其耐 药情况和耐药机制对指导临床用药是非常有意义的。 【摘要】目的：建立紫外分光光度法检测血液中的氨浓度的方法，为临床肝性昏迷、 肝性脑病、重型肝病、尿毒症等代谢障碍疾病的诊断提供参考。方法：血液离体后，立即 加入定量过量的钨酸钠及硫酸溶液，使蛋白沉淀的同时，血液中的氨与硫酸形成硫酸铵而 存留于血滤液中，再以酚-次氯酸钠显色后于波长 630nm 处测定光密度 OD 值（以空白校 正）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的。结果：血氨在 20～60μmol/Lmol/L 范围内浓度与 OD 之间呈良好的线性。结论：此方法 快速、简便，适合临床检测血氨的浓度。 【关键词】血氨；方法学；光密度 正常人体内游离血氨（bloodammonia，BA）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的含量极低（正常值 20～60μmol/Lmol/L）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的 ［1］，其主要来源于体内蛋白质在代谢过程中产生的氨基酸，以及经脱氨作用分解而来 的内源性氨，正常情况这种氨可形成酰胺及合成其他含氮化合物而不断地被转化；另一来 源是蛋白质类食物在肠道内经细菌分解而成的外源性氨，正常情况下此氨经门静脉进入肝 脏被合成为脲，经肾脏排出体外。然而在发生代谢障碍性疾病，如肝性昏迷、肝性脑病、 重型肝炎、尿毒症等由于氨不能正常代谢排出体外而引起 BA 升高。肝功能极度衰竭或血 液不能正常地流经肝脏转换等严重肝脏疾病，氨不能从循环中及时清除均可使血氨增高 ［1］。高 BA 有神经毒性，BA 的测定对于肝硬化门脉高压、肝昏迷、Reve’s 综合征及儿 科的一些先天性代谢紊乱等病的诊断、观察和预后判断有着重要意义［2］。BA 的测定方 法有微量扩散法、比色法、离子交换法、氨电极法、酶法等。笔者在结合本实验室现有条 件，参考国内外有关文献建立快速、准确的检测 BA 方法，为临床该类疾病的诊断、治疗 提供参考。 1 仪器与试剂 1.1 仪器 电子天平 COBS甲氧苄啶、氯霉素的敏感性分别在120 型（朝鲜 COBS 公司）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的，紫外分光光度仪 HP8453（美国惠 普）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的，离心沉淀器 800 型（上海手术仪器厂）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的，YKH甲氧苄啶、氯霉素的敏感性分别在I 型液体快速混匀器（江西医疗器械 厂）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的，DHW420甲氧苄啶、氯霉素的敏感性分别在420 三用电热恒温水箱（北京东霞科学仪器厂）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的。 1.2 试药 钨酸钠（天津市大茂化学试剂厂，批号 030906）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的，硫酸铵（重庆北碚化学试剂厂， 批号 050329）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的，亚硝基铁氰化钠（上海三爱思试剂公司，批号 20020204）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的，苯酚（重 庆北碚化学试剂厂，批号：20000924）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的，氢氧化钠（重庆川江化学试剂厂，批号 20000312）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的，次氯酸钠（重庆川东化工集团化学试剂厂，批号 20040904）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的，硫酸铵 （重庆北碚化学试剂厂，批号 050329）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的，硫酸（重庆川江化学试剂厂，批号 20000105）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的，所用试药均为分析纯，水为新制无氨蒸馏水。 2 方法与结果 2.1 储备溶液的配制［2］ 无氨水的制备：参照文献［3］取重蒸水 1000mL，加稀硫酸 1mL 与高锰酸钾试液 1mL，蒸馏即得备用。 酚显色剂：精取亚硝基铁氰化钠 25.00mg，与适量苯酚混合后加无氨水至 100mL, 过滤即得。 碱性次氯酸钠溶液：精取 250mg 次氯酸钠，氢氧化钠 2500mg，溶于 100mL 无氨 水中即得。 0.5mol/L 硫酸溶液、5mmol/L 硫酸铵溶液参照文献方法［3］配制。 2.2 标准溶液的配制 分别精取“2.1”项的硫酸铵储备液 20、200、500、1000、1500、2000、4000μmol/LL 置于 50mL 容量瓶，立即加无氨水至刻度即得 10、20、50、100、150、200、400μmol/Lmol/L 的硫酸铵系列标准溶液。 2.3 标准曲线的制备 取“2.2”项的硫酸铵系列标准溶液各 1mL，分别加入 10%的钨酸钠溶液、0.5mol/L 硫酸溶液各 0.5mL，涡旋震荡 1min，4000r/min 离心 5min，分取上清液 1mL，依次加 入酚显色剂和碱性次氯酸钠溶液各 1mL，涡旋 1min 后置 37℃水浴 20min，以空白管校 正后于 630nm 处测定 OD 值；将所测得的吸收度 OD 值对浓度进行线性回归处理得回归 方程：OD=0.0017C+0.23，相关系数 r=0.9964，根据(NH4)2SO4NH4)2SO4 与游离氨的定量关 系，即得游离氨浓度在 5～200μmol/Lmol/L 的定量线性范围（见图 1）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的。 2.4 临床样本的测定 参考国内外有关文献，经优化后测定 BA 的方法为：离体血液立即加入过量定量的 10%钨酸钠及 0.5mol/L 硫酸溶液，使蛋白沉淀的同时，血液中的氨与硫酸形成硫酸铵而 存留于血滤液中，再以酚甲氧苄啶、氯霉素的敏感性分别在次氯酸钠显色剂显色后于波长 630nm 处测定 OD 值，即可定量 测定 BA。 2.5 方法的回收试验 按“2.2”项的方法分别配制高、中、低（400、200、40μmol/Lmol/L）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的的硫酸铵标准溶液 适量，各取 1mL 分别加入 1mL 无氨正常血浆，混匀后精密量取 1mL 按 2.4 项下的方法 分别精密加入 0.5mL10%钨酸钠和 0.5mol/L 硫酸溶液各 0.5mL，以下按准曲线项下相 应的方法处理并分别测定其 OD 值，将测得的 OD 值代入标准曲线计算测得量与回收率， 结果见表 1。表 1 血氨回收试验（略）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的 2.6 精密度试验 配制低、中、高（25、50、75μmol/Lmol/L）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的3 个浓度含无氨正常血浆的硫酸铵溶液各 3 份，日内 4℃冷藏保存，每间隔 1h 按 2.3 标准曲线项下的方法测定 1 次，连续测定 5 次。 另取相同样品甲氧苄啶、氯霉素的敏感性分别在18℃冷冻保存，每日测定 1 次，连续测定 5 日。所得 OD 值代入标准曲线 方程计算得游离氨浓度，结果见表 2。表 2 血氨精密度试验（略）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的 2.7 稳定性试验