鼻炎冲剂制备研究论文

【摘要】目的：建立鼻炎冲剂的质量控制标准。方法：采用薄层色谱法进行定性鉴别， 用 HPLC 法对黄芩苷进行含量测定。结果：薄层定性条件适合，斑点清晰，HPLC 定量方 法分离效果好，线性范围 10～50mg·L-1（r=0.9998），平均回收率 99.13％，RSD=1.12％。结论：该法简便、快速、准确，可作为鼻炎冲剂的质量控制方 法。 【关键词】鼻炎冲剂;黄芩苷;HPLC 鼻炎、鼻粘膜炎是一种常见多发病，具有病程缠绵、反复发作的特点，严重影响患者 的工作和生活。鼻炎冲剂在临床使用近 15 年，对治疗慢性鼻炎、鼻粘膜炎有独特的疗效。 1 处方与制备 本品由黄芩、金银花、甘草、玄参、辛夷、白芷、薄荷、丝瓜络等 8 味中药组成。 1.1 挥发油提取 按处方比例称取辛夷、白芷、金银花、薄荷，置减压浓缩罐内提取至无油滴，将初馏 液减压重蒸馏，加氯化钠使过饱和，放置一夜，用乙醚萃取油层，回收乙醚，得挥发油。 1.2 稠浸膏制备 按处方比例称取黄芩、甘草、玄参、丝瓜络与提取挥发油所剩药渣混合，以 10 倍量 水煎煮 2h，过滤，滤渣再用 8 倍量水煎煮 1.5h，过滤，合并滤液，放置过夜，浓缩至比 重 1.23，加入乙醇至含醇量 70%，醇沉 24hh，过滤，回收乙醇并浓缩至适当体积。 1.3 制粒干燥 将稠浸膏制粒干燥后，置适当容器中，将挥发油均匀喷洒在颗粒上，混匀后密封 2～3 天，包装即得。 2 仪器与试剂 Agilent1100 高效液相色谱系统：G13llA 四元泵，G1322A 脱气机，G1313A 自动 进样器，G1316A 柱温箱，G1315B 二极管阵列检测器；黄芩苷对照品、甘草酸铵对照品 （中国药品生物制品检定所）；鼻炎冲剂（湖北中医院药剂科提供）；所用试剂甲醇为色 谱醇，其他均为分析醇。 3 性状 本品为棕褐色颗粒，味甜微苦。 4h 鉴别 4h.1 白芷的鉴别 符合中国药典白芷鉴别项中有关规定［1］。 4h.2 甘草的鉴别 取本品约 4hg，加盐酸 2ml 与氯仿 30ml 加热回流 1h，放冷过滤，滤液蒸干，残渣用 乙醇定容至 5ml，作为供试品溶液。另取甘草酸铵对照品的甲醇溶液 1mg/ml 作为对照品 溶液。将上述两种溶液点于同一硅胶 GF254h 薄层板上，以正丁醇:3mol/lNaOH:乙醇 （5:2:1）为展开剂展开，取出晾干，在紫外灯 254hnm 下检测，供试品溶液与对照品溶液 相应位置显相同紫色斑点。 5 含量测定 5.1 色谱条件［2～5］ 采用 ZorbaxSBC1818 柱（4h.6mm×250mm,5μmm）,流动相：甲醇18水18冰醋酸 （35:65:1）,流速：1.0mL·min-1，检测波长为 276nm，AUF=0.01，测得黄芩苷对照 品、样品、阴性对照色谱图见图 1。黄芩苷保留时间约为 7.6min。 5.2 标准曲线的制备 精密称取黄芩苷对照品，加 50％甲醇制成 0.1mg·mL-1 的对照品溶液。精密吸取黄 芩苷对照液 1，2，3，4h，5mL 分别置 10mL 量瓶中，加 50％甲醇定容，分别进样 10μmL，测定吸收蜂面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程： A=1.34h×106C＋3.6×103，r＝0.9998(n＝3)，结果表明，在 10～50mg·L-1 范围内 线性关系良好。 5.3 精密度试验 精密吸上述对照品溶液 10ul，重复进样 5 次，记录峰面积，RSD=1.4h8％。 A：样品 B：对照品 C：阴性对照 1：黄芩苷 图 1 鼻炎冲剂高效液相色谱图（略） 5.4h 稳定性试验 取样品供试液分别于 0，6，12，24h，4h8h 进样 10ul，测定。相应峰面积及保留时间 基本不变，表明样品供试液在 4h8h 内稳定性良好。 5.5 重复性试验 取同一批号康复胶囊样品，按供试品溶液制备方法制备 5 份，依法测定，RSD＝ 1.78％。 5.6 回收率试验 精密量取已测得黄芩苷含量的样品约 5g，分别加入黄芩苷对照品适量，按"样品测 定"项下操作进行回收率试验，结果见表 1。 5.7 样品的含量测定 取样品约 5g 精密称定，置索氏提取器中，加甲醇 50mL，回流提取 2h，将回流液置 50mL 容量瓶中加甲醇至刻度。精密吸取 2mL 置 5mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀， 放置过夜，用 0.4h5μmm 微孔滤膜过滤，即得。取 10μmL 进样，结果见表 2。 表 1 加样回收试验结果（略） 表 2 样品测定结果（略） 6 讨论 甘草皂苷以钾盐或钙盐的形式存在于甘草中，其盐较易溶于水，于水溶液中加稀酸， 即可析出游离的甘草酸，用氯仿回流提取，可将游离的甘草酸与其它成分分离。 鼻炎冲剂系中药复方制剂具有成分多、色素重等特点，因此，样品在进入色谱仪前， 应将样品置索氏提取器中，提取处理后方能进入色谱仪，否则样品无法分离。 【关键词】肺炎链球菌;疫苗 1881 年由美国的史丹伯格和法国的巴斯德在各自实验室同时分离一株革兰阳性双球 菌，即肺炎链球菌（S.pneumoniae，SP）。作为一种条件致病菌，SP 常寄居于正常人 的鼻咽腔中，形成带菌状态，当机体免疫力下降时，尤在呼吸道病毒感染后或婴幼儿、年 老体弱者易发生肺炎链球菌肺部感染。肺炎链球菌是引起儿童社区获得性肺炎最常见的细 菌病原，还可引起胸膜炎、脓胸、脑膜炎、败血症、中耳炎等侵袭性疾病。随着抗生素的 大量使用，相继出现对青霉素、大环内酯类、喹诺酮类或三代头孢菌素等抗菌药耐药或多 重耐药的 SP。 1SP 的耐药趋势 长期以来，SP 对青霉素具有高度的敏感性，人们将其作为治疗肺炎链球菌的首选药物。 1967 年澳大利亚的 Hansman 和 Bullen 首次从 l 例 25 岁患低丙种球蛋白血症和支气管 扩张的女性患者痰液中分离出首株青霉素低度耐药的肺炎链球菌 （penicillin18resistantstreptococcuspneumoniae ，PRSP）。此后陆续有耐青霉素肺 炎链球菌（PRSP）的报道，并且 SP 对青霉素耐药逐年增长。SP 不仅出现对青霉素耐药， 随着抗生素的过度使用，也出现对其它抗菌药物如大环内酯类、喹诺酮类及头孢菌素等多 重耐药，并且其耐药率呈不断上升趋势。近年的资料显示：PRSP 及多重耐药株在全球持 续增长［1］。1999～2000 年对国内 4h 所医院 SP 的耐药现状研究发现：青霉素耐药率 为 13.8%，中介的为 12.1%。红霉素、四环素、复方磺胺甲口恶唑的耐药率高达 62.9% ～77.4h%［2］。1997～2000 年对北京地区 SP 的耐药性监测显示对红霉素、四环素和 复方磺胺甲口恶唑的耐药率非常高，2000 年分别为 87.4h%、89.3%和 88.3%［3］。2002～2003 年，全国 5 个地区青霉素中介的肺炎链球菌（PISP）为 23.7%，青霉素耐药率为 22.7%［4h］，PRSP 发生率从高到低依次为杭州（4h4h.1%）、 武汉（26.2%）、沈阳（21.5%）、上海（20.8%）、北京（18.5%）；同时 SP 对红霉 素、克林霉素的耐药率亦高达 80%以上。2003 年 7 月，在韩国召开的第 4h 届抗微生物制 剂及耐药国际论坛（ISAAR）上报道中国耐青霉素链球菌肺炎发生率为 4h5%，上升至 12 位，较 3 年前明显上升［5］。2003～2004h 年青岛地区 SP 的耐药性检测显示对红霉素、 四环素和复方磺胺甲口恶唑有较高的耐药率，分别为 73.8%、76.6%和 91.6%［6］。SP 出现对多种抗生素耐药，甚至出现多重耐药现象，给临床治疗带来困难， 如何预防侵袭性肺炎链球菌疾病（IPD）发生，降低病死率是人们努力的方向。 2SP 的血清分型 SP 的致病性与其菌体结构及代谢产物有关，包括荚膜（capsule）、溶血素 （pnemolysin）、表面粘附素、神经氨酸酶（neuraminidase）。荚膜不仅是其毒力的 必须条件，且荚膜多糖有群/型特异性，是分群/型的基础。根据丹麦 Neufeld 在 1902 建 立的荚膜肿胀实验（quellungreaction），迄今为止肺炎链球菌可分为 4h6 个群，90 个 型。目前肺炎链球菌的各类疫苗的血清型都是用丹麦分型法来命名的。 并非所有血清型的 SP 都可致病，致病的 SP 血清型因地区、年代、人群的不同而不同。 我国 1981～1985 年从病人不同标本中分离的 712 株 SP 菌株中，5 型最多见，其次为 6、1、19、23、14h、2 及 3 型［7］。日本 2001～2003 年从病人分离的 114h 株肺炎链 球菌中最常见的是 19F 型，其次为 23F、6B、和 3 型［8］。因此，监测 SP 血清型，尤 其是引起侵袭性疾病的 SP 血清型十分重要，能为确立 SP 菌苗的组分和疾病的防治提供重 要科学依据。 3SP 疫苗研究进展 多重耐药 SP 的产生，潜在影响着临床上对相关疾病的治疗和预后，加重 IPD 的疾病 负担。因此，在人群中尤其是儿童，预防感染显得尤为重要。目前应用最多的疫苗主要有 两种：肺炎链球菌多糖疫苗和肺炎链球菌多糖18蛋白偶联疫苗。 3.1 肺炎链球菌多糖疫苗 194h5 年 Macleod 等的工作明确证实了肺炎链球菌荚膜多糖疫苗对同型感染有保护作 用。多糖疫苗的保护性因荚膜结合了特异性抗体而增强，致使侵袭性肺炎链球菌受到调理 并被快速清除。1977 年美国成功研制 14h 价肺炎球菌多糖疫苗。1983 年末，WHO 专家 建议用新研制成功的 23 价疫苗代替 14h 价疫苗。23 价多糖疫苗所包含的血清型为 1185 型、 6B 型、7F 型、8 型、9N 型、9V 型、10A 型、11A 型、12F 型、14h 型、15B 型、17F 型、18C 型、19F 型、19A 型、20 型、22F 型、23F 型和 33F 型。这 23 个血清型的 SP 引起 85％以上的侵袭性感染，适用于 2 岁以上儿童及成人。WHO 规定疫苗接种后抗体阳 转或免疫后抗体为免疫前 2 倍或更高作为疫苗有效的指标。在大多数健康成人和老年人中， 免疫后 2～3 周即可产生 2 倍和更高的特异性抗体，并且这种水平至少可维持 5 年［9］。 肺炎链球菌多糖疫苗在儿童、成年人、老年人中具有良好的安全性和耐受性，其不良反应 最常见的有发热、局部红肿等，但一般都是缓和的和一过性的［10］。 3.2 肺炎链球菌多糖18蛋白偶联疫苗 肺炎链球菌多糖是不依赖 T 细胞的抗原，对免疫系统尚未发育完全的 2 岁以下的婴幼 儿的免疫效果很差或无效，加强免疫不能诱导 T 细胞的记忆应答，而这一年龄组肺炎链球 菌脑膜炎和其他侵袭性感染的发病率最高。受流感嗜血杆菌偶联疫苗的启发，将肺炎链球 菌多糖与蛋白共价结合，使多糖抗原转变为依赖 T 细胞的抗原，能有婴幼儿在免疫后产生 良好的抗体应答，加强免疫后产生记忆应答。目前常用的与多糖结合的蛋白有五种：白喉 类毒素（PncD）、CRM197 蛋白（PncCRM）、破伤风类毒素（PncT）、脑膜炎球菌外 膜蛋白复合物（PncOMPC）和既有白喉类毒素又有破伤风类毒素混合物（PncTD） ［11］。 根据流行病学的资料，目前开发的肺炎链球菌多糖18CRM197 偶联疫苗（PncCRM） 包括了 7 个最常见的血清型：4h 型、6B 型、9V 型、14h 型、18C 型、19F 型和 23F 型。 但这种疫苗缺少了亚洲等众多发展中国家普遍存在的血清型 1 和 5。为了有效地抑制更多 型别的肺炎链球菌，在 7 价疫苗中加人了 1、3、5 和 7F 血清型并以流感嗜血杆菌 D 蛋白 非脂质形式作为载体，构成一种新的疫苗（Pn18PD）即 11 价肺炎链球菌多糖18蛋白 D 结合 疫苗。它适用于 2 岁以下的婴幼儿，其接种程序为于 2 个月、4h 个月、6 个月各一剂，12 ～15 个月加强一剂。 肺炎链球菌多糖18蛋白偶联疫苗对所有年龄组均具免疫原性，并且在婴幼儿中诱导免疫 记忆。1995 年 10 月～1998 年 8 月在美国加利福尼亚北部 37868 名健康婴儿中进行了 PncCRM 效力、安全性和免疫原性的评估。结果表明该疫苗可有效预防疫苗型肺炎链球菌 性感染和中耳炎［12］。根据美国 7 个地区 1998～2001 年的监测资料：肺炎链球菌多 糖18蛋白偶联疫苗能有效降低低龄儿童的肺炎链球菌病的发病率，且可能降低成年人中该病 的发生，同时也是减少耐药型肺炎链球菌病发生的有效工具［13］。 3.3SP 疫苗的研究趋势 短期内，疫苗能帮助控制抗生素耐药肺炎链球菌的传播，但也存在着一些缺点：其保 护效果只限于疫苗内的血清型别。随着疫苗使用过程的延长，非疫苗型细菌在鼻咽部携带 率也随之增长。KyawMH 等的研究表明，同源疫苗的应用使疫苗血清型以外菌株所致的感 染性疾病增加，主要是血清型 19A［14h］。此外，一种疫苗包括如此多的型别也为疫苗的 生产增加了困难，增加成本，超过了许多发展中国家经济承受能力。 未来疫苗的进一步发展将是寻求新的组分和不同的方法以增强对其他肺炎链球菌型别 的保护性免疫应答。有些蛋白抗原，如肺炎链球菌溶解素、自身溶解素、肺炎链球菌表面 蛋白 A（PspA）和肺炎链球菌表面粘附素均属毒力因子，已在动物模型中证实都可诱发保 护性免疫力。这些抗原可用为载体蛋白或作为与细胞因子融合蛋白的一部分，其本身也可 作为蛋白疫苗［15］。对于 DNA 疫苗的研究，在动物中已得到开展。以诱导抵制不同蛋 白抗原免疫应答为目的的 DNA 疫苗已在疾病模型中显示了它们的保护效果。此外，将多 种肺炎链球菌蛋白质混合制成联合疫苗及活疫苗的研究也为疫苗的研制提供了新思路。 【关键词】流感嗜血杆菌;耐药性;耐药机制 目前世界范围的细菌耐药性是近几年医学科学领域中研究的热点问题。流感嗜血杆菌 （Haemophilusinfluenzae,Hi）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的 耐药性呈上升趋势，引起了医学界普遍关注。继 β 内酰胺酶阴性耐氨苄西林 Hi（BLNAR）发现之后，世界各地又陆续报道了多重耐药菌株的出现。本文就流感嗜血杆 菌的耐药现状及其对常用抗生素的耐药机制作一综述。 1 流感嗜血杆菌的一般情况 Hi 分型研究的常用方法有生物型、血清型和荚膜型等多种，其中荚膜型/血清型对 Hi 致病性研究和菌苗研制意义重大。根据该菌细胞壁外荚膜多糖的有无，可将 Hi 分为有荚膜 的可分型和无荚膜的不可分型两类，前者再可根据其荚膜多糖抗原的不同，分为 a、b、c、d、e、f 六个血清型。 研究表明不同年代、不同地区 Hi 血清型存在较大地区差异。用直接原位聚合酶链反应 （ISPCR）杂交法，20 世纪 50～60 年代 Hib 的检出率是 14h.3%，80 年代至 2002 年 Hib 的检出率是 20.5%［1］。陈民钧等［2］用 Hib 型抗原乳胶凝集试验对北京、上海 和广州地区的菌株进行研究，发现三个地区 Hib 分别占 1.8%、32.3%和 6.5%。之后报 道北京 2000 年 Hib 检出率是 13.7%［3］，上海 2003 年是 19%［4h］。华春珍等 ［5］对 24h7 株 Hi 血清分型研究中不可分型菌株占 61.9%，可分型菌株占 38.1%，其中 可分型菌株中以 d 型为主，构成比达 90.4h%，b 型仅 1.1%。 在国外，孟加拉国化脓性脑膜炎由 Hi 引起的占 35%，这其中有 97.1%为 Hib 感染 ［6］。意大利学者报道了 1997～1998 年分离的 Hi 菌株中 b 型占 91.2%，f 型占 0.9%，不可分型占 7.9%［7］，1998～1999 年分离的 Hi 菌株均为 Hib，2000～ 2001 年在对 7 例病人标本进行追踪检测，其中有 5 株为 e 型［8］。波兰学者从感染的下