抗病毒药物耐药研究论文

【关键词】,抗病毒药；,,耐药性；,,耐药机制 摘要：目前临床应用的抗病毒药物达 40 多种，为病毒引起的疾病的治疗发挥了重大 作用。与临床其他抗感染药物一样，抗病毒药物长期应用易产生耐药性，降低疗效，成为 临床治疗及新药开发的重要问题。本文就抗艾滋病毒药物、抗乙型肝炎病毒药物、抗流感 病毒药物及抗疱疹病毒药物耐药性及耐药机制研究进行综述。 关键词：抗病毒药；耐药性；耐药机制 Advancesinantiviraldrugresistanceandresistancemechanisms ABSTRACTTherearemorethan40antivirusdrugsintheclinicaluse,whichhavep layedveryimportantroleinthetreatmentofviraldiseases.Likeotherkindofantiinfec tiondrugs,antivirusdrugscanalsoinduceresistanceinlongtimeusethatresultsther educingoftherapeuticefficacyandbecomingaverytoughproblemintheclinicaltrea tmentandthedevelopmentofnewdrugs.Thispaperbrieflyreviewedtherecentadva ncesinresistanceandresistancemechanismsofantiHIVdrugs,antiHBVdrugs,antiin fluenzadrugsandantiHSVdrugs. KEYWORDSAntivirusdrugs;Resistance;Resistancemechanisms 病毒性传染病居传染病之首(占 60%以上)，发病率高、传播快，对人类健康形成莫大 的威胁。如艾滋病(AIDS)、重症急性呼吸系统综合征(SARS)，各种病毒性肝炎、流行性 出血热、流感、感冒、婴幼儿病毒性肺炎、成人腹泻、病毒性心肌炎等等。近 20 年来， 尤其是 20 世纪 90 年代，抗病毒药物发展突飞猛进，目前在临床应用的抗病毒药物达 40 多种［1］，为治疗病毒引起的感染发挥了重大作用。与临床其他抗感染药物一样，抗病 毒药物长期应用易产生耐药性，降低疗效，病情复发，成为临床治疗及新药开发的重要问 题。本文就各类临床应用抗病毒药物耐药性及耐药机制研究进展介绍如下。 1 抗艾滋病药 1.1 抗艾滋病药的作用靶点［2］艾滋病毒(HIV)复制过程中有三个由病毒基因编码的 复制关键酶，即逆转录酶(reversetranscriptase,RT)、蛋白酶(protease,PR)及整合酶 (integrase)，它们均为发展抗艾滋病毒药物的重要靶点。目前上市抗 HIV 品种有 21 个， 针对前两个酶的抗艾滋病毒药物可分为核苷类逆转录酶抑制剂，非核苷类逆转录酶抑制剂 及蛋白酶抑制剂三类。第四类为 HIV 入胞抑制药。 1.2 核苷类逆转录酶抑制剂(nucleosidereversetranscriptaseinhibitor,NRTI)耐药 性及耐药机制属于 NRTI 的抗艾滋病毒药物共有 8 个品种，即齐多夫定 (zidovudine，AZT)、去羟肌苷(didanosine，ddI)、扎西他滨(zalcitabine，ddC)、司 他夫定(stavudine，d4T)、拉米夫定(lamivudine，3TC)、阿巴卡韦 (abacavir，ABC)、富马酸替诺福韦酯(tenofovirDF，TDF)、恩曲他滨 (emtricitabine,FTC)。NRTIs 均为 DNA 合成天然底物的衍生物，AZT 及 d4T 为脱氧胸 苷的类似物，ddC、3TC 及 FTC 为脱氧胞苷的类似物，ddI 及 tenofovirDF 为脱氧腺苷及 开环脱氧腺苷酸的类似物，ABC 为脱氧鸟苷的类似物，它们均需在细胞内转化为活性三磷 酸或二磷酸衍生物，才能发挥抑制 HIV1RT 作用。它们全部是 HIV1RT 底物的竞争性抑制 剂，抑制 RT 活性，阻碍前病毒 DNA 合成；并由于在结构上 3′位缺乏羟基，当它们结合到 前病毒 DNA 链的 3′末端时，不能再进行 5′→3′磷酸二酯键的结合,终止了病毒 DNA 链的延 长，又为链末端终止剂。通过上述作用机制,抑制 HIV 复制。它们与 HIV1RT 亲和力远比与 细胞内正常 DNA 聚合酶亲和力强，因此具有一定的治疗指数。艾滋病的治疗采用联合用 药，即高效抗逆转录病毒疗法(highlyactiveantiretroviraltherapy,HAART)。耐药突变 ［3］可分为基因型突变(genotype)及表型突变(phenotype)，基因型突变并不一定有表 型突变，临床需分别进行两者检测。通常在 RT 分子中有一个氨基酸取代，即可引起表型 突变。AZT 是第一个上市的抗艾滋病药(1987 年)，在临床应用时间较长，单个氨基酸取 代可引起高度耐药突变的有 M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y/F 和 K219E/Q，可 使 IC50 降低>100 倍，其中以 T215Y/F 为最重要的取代［4，5］。这些取代也可发生在 d4T 单药治疗，但耐药程度较低，在 ddI 单药治疗患者，也有 10%发生以上突变，对其他 NRTIs 无交叉耐药。这一系列耐药突变的机制主要为焦磷酸依赖及 ATP 依赖的焦磷酸解作 用(pyrophosphorolysis，聚合的逆反应)，以后者为主［6～8］。突变的 RT 可将引物 (primer)末端结合的 AZTMP 切除，去掉 AZTMP 的链末端终止作用(deblock)，使 DNA 链重新开始聚合反应而延长。有报道在生理浓度 ATP 条件下［9］，突变的 RT 对 8 个 NRTI 的切除能力次序为 AZT>d4T>ddC>ABC>DAPD>3TC>ddI>tenofovirDF，说 明 AZT 及 d4T 主要通过 ATP 依赖的焦磷酸解修复机制产生耐药，对 tenofovirDF 此修复 机制比 AZT 小 35 倍，比 d4T 小 22 倍。在有对应的新 dNTP 结合情况下，可抑制修复机 制，但对 AZT 修复机制无影响，提示 AZT 这一系列耐药与其他 NRTI 无交叉耐药的机制。 AZT 与 ddNs(指 ddI 及 ddC)联合用药可发生另一系列的多药耐药突变，有多处取代 (A62V、V75I、F77L、F116Y 及 Q151M)，其中以 Q151M 最重要。有 3%～16%患者 用 AZT 与 ddI 或 ddC 治疗可发生这类突变。体内对 AZT 敏感性下降为原有的 1/179，对 ddI、ddC 及 d4T 的敏感性显著下降，但对 3TC 及 tenofovir(TDF)仍敏感。Q151M 及 包含 Q151M 的突变 RT 的耐药机制为对 ddNs 的识别［10］，对 ddNs 的识别发生在 RT 活性中心的聚合过程，聚合效率降低，而不是在 ddNs 结合过程。在 AZT 突变的基础上 (由胸腺嘧啶核苷衍生物 AZT 及 d4T 引起的突变称 thymidineanaloguemutation，TAM)，还可发生插入或缺失突变［9，11］，产生高 度耐药(>1000 倍)。在 69 与 70 残基之间插入两个氨基酸称 69 插入突变，发生率 1%。 插入可为 SS、SG、SA，在 β3β4 环，包括氨基酸残基 6472，位于 RT 的手指区，使手 指区移动性加大，并应用 ATP 依赖的焦磷酸解作用。缺失突变发生在 67 位置，此突变 RT 的分子机制为对 ATP 有高度亲和力，在低浓度 ATP 条件下，可发挥 ATP 依赖的焦磷酸解 作用，切掉 AZTMP 及 TDFMP。其他 NRTI 亦可引起单个取代的耐药突变及交叉耐药，如 ddC 引起的 K65R，对 ABC、ddI 及 TDF 均有交叉耐药，含 K65R 或 L74V 变异的病毒复 制能力下降［12～14］，对天然底物利用能力比野株低，对 dATP、dGTP、dTTP 和 dCTP 利用能力分别下降 15%、36%、50%和 25%，聚合效率野株 RT>L74VRT>K65RRT>K65R/L74VRT。K65R 可降低 ddNTP 分离的焦磷酸的稳定性。 3TC 引起的 M184V，对 3TC 及 FTC 高度耐药(>100 倍)，与 ddC 及 ddI 有轻度交叉耐药， 分子机制为此突变 RT 的巨大的侧链(Val)与 3TC/FTC 的氧硫环之间发生空间障碍，影响 两者的聚合反应。3TC 的耐药变异可逆转齐多夫定耐药株，使其恢复对齐多夫定的敏感性， 并可延缓齐多夫定耐药变株之产生［15］。临床研究显示，3TC 耐药株的出现对联合用药 (3TC+AZT)疗效影响不大，故 3TC+AZT 为 HAART 常用组成部分。D4T 引起的 V75T 与 ddC 及 ddI 有交叉耐药，分子机制为此突变 RT 由于空间障碍，降低 d4TTP 结合效率。 临床分离到的 ddI 耐药变株，在 HIV1RT 有两种主要突变类型 L74V 及 M184V，两者对 ddI 敏感性分别降至 1/10 及 1/4～1/8。ddI 耐药毒株与 AZT 无交叉耐药，与 ddC 有交叉 耐药。体外研究显示 ABC 累积 4 个取代(K65R、L74V、Y115F、M184V)可产生高度耐 药，分子机制为影响聚合效率。体外 ABC 与 ddI、ddC 及 3TC 可能有交叉耐药，与 D4T 及 AZT 无交叉耐药。TDF 体内外不易产生耐药，主要为 K65R 突变，临床有 3%患者可分 离此突变株，其对 TDF 敏感性下降 3～4 倍，无交叉耐药，ddC、ddI 及 ABC 也有此突变。 1.3 非核苷类逆转录酶抑制剂 (nonnucleosidereversetranscriptaseinhibitor,NNRTI)耐药性及耐药机制属于 NNRTI 的抗艾滋病毒药物共有 3 个品种［奈韦拉平(nevirapine，NEV)、地拉韦平 (delavirdine，DEL)和依非韦伦(efavirenz，EFV)］。NNRTI 与接近活性中心的 P66 亚 单位疏水口袋结合，与 NRTI 结合位置不同，是 RT 的非竞争性抑制药。NNRTI 易引起耐 药及交叉耐药［5，16］，常见引起耐药的单一取代有 A98G、L100I、K101E、K103N、V106A、V108I、E138K、T139I、T181C、Y188 C、G190A、F227L 及 P236L，以 K103N 最常见。单一取代显著引起空间障碍，降低 NNRTI 与 RT 的结合，如 T181C 对 NEV 敏感性降低>100 倍，并有交叉耐药。EFV 为第 二代 NNRTI，其分子结构较小，可结合耐药 RT 已重新排列的疏水口袋。如 NEV 对 K103N 的结合亲和力下降 40 倍，EFV 只下降 6 倍，因此 EFV 仍对耐药株有效。体内外 NEV 极易产生耐药，临床单药治疗 8 周，100%患者可分离出耐药变株。HIV1RT 突变部 位主要是密码子 181［17］，由酪氨酸→胱氨酸/丝氨酸，NEV 耐药株仍对齐多夫定敏感， 但与其他非核苷类 HIV1RT 抑制药有交叉耐药。体内外试验 DEL 也极易产生耐药变株，临 床单药治疗 8 周，14/15 患者之分离株对地拉韦定敏感性降低，仅为原敏感性的 1/50～ 1/500。基因型分析，主要是密码子 103 及 181 发生突变［18］。临床分离株，EFV 对 HIV1RT 单个核苷酸取代(密码子 48、108、179、及 236)株敏感性未变，对 A98G、K101E、V106A、Y188C 及 G190A 的敏感性降低<10 倍，对 L100I 及 K103N 的敏感性降低 20～70 倍，对 Y188L、S48T+G190S、K101E+K103N、K101E+L100I 及 K103N+V181C 的敏感 性降低>80～1000 倍。EFV 的耐药特征在联合用药的情况下没有改变，与其他 NNRTIs 有交叉耐药。 1.4 蛋白酶抑制药(proteaseinhibitor,PIs)耐药性及耐药机制 HIV 蛋白酶由 99 个氨 基酸组成，其活性形式为 C2 对称匀二聚体(相同二个亚单位的聚合体)，属天冬氨酰蛋白酶 类。HIV 基因组中 gag 及 gag/pol 基因各编码一多蛋白前体(p55 及 p160)，它们均需病 毒蛋白酶酶解加工为成熟的结构蛋白和功能蛋白(病毒酶)。如 HIV1 蛋白酶发生变异或酶活 性受到抑制，则生成没有感染性的不成熟的病毒颗粒，说明 HIV 蛋白酶是病毒复制的必需 酶。属于 PIs 的抗艾滋病毒药物共有 9 个药物，即沙奎那韦(saquinavir，SQV)、利托那 韦(ritonavir，RTV)、茚地那韦(indinavir，IDV)、奈非那韦(nelfinavir，NFV)、安普那 韦(amprenavir，APV)、kaletra(洛匹那韦 lopinavir,LPV 和利托那韦复合制剂)、 Atazanavirsulfate(ATV)、福司安普那韦［fosamprenavircalcium(FAV)］及 tipranavir(2005/06/22 上市)。HIV 蛋白酶的单个氨基酸取代，引起低度耐药，需累积多 个氨基酸取代，引起高度耐药及交叉耐药［5，19～,21］。耐药突变可发生在蛋白酶活性 位置或非活性位置，第一代 PIs(SQV、RTV、IDV、NFV)的常见突变为 M46L/I/ F、I54V、V82A、I84V、L90M。D30N 及 N88D 为 NFV 特有的变异［22］。V82A 及 I84V 位于蛋白酶活性位置［23］，引起酶活性中心结构改变，造成空间障碍，直接影响 药物的结合。M46L/I/F 及 I54V 位于蛋白酶的盖，影响其运动的分子动力学，间接防止药 物的攻击。L90M 位于蛋白酶非活性位置［24］，影响含有活性位置环的构型，降低底物 结合口袋的可塑性及体积，障碍 PIs 与 PR 相互作用。这些突变的 PR 对正常底物亲和力也 下降，使病毒复制能力下降。除以上位置突变外，在 8、10、20、24、32、33、36、63、64、71、73、77 位置也可见到耐药突变。APV 至少需累积 5 个氨基酸取代才引起显著耐药，I50L 是 APV 特有的变异。体内、外均已分 离到对 LPV 耐药的变株，体外在逐步增加 LPV 浓度下，培养 142d，可分离高度耐药变株， 具有多处突变(I84V、L10F、M46I、T91S、V32I、I47V、V47A、G16E 及 H69Y)，IC50 增加 338 倍。此株对利托那韦及沙奎那韦的 IC50 分别增加 22 及 4 倍。临 床可根据 HIV1 分离株突变位置的数目，预测治疗反应率。当突变数为 0～5、6～7 及 8 ～10 时，临床反应率分别为 91%、81%及 33%。Atazanavir 单药治疗 50 周所分离的 耐药株，均有 I50L 突变，可伴有或不伴有 A71V 突变，此突变株对其他 PIs 敏感性增加。 但 Atazanavir 与其他 PIs 联用时所分离的耐药株表现为交叉耐药的多药耐药，其突变位 置为 I84V、L90M、A71V/T、N88S/D 及 M46I。体内、外均已分离到对安普那韦耐药的 突变株，其主要突变位置为 I50V、V32I、M46I/L、I47V、I54L/M、I84V 及 P7/P1 与 P1/P6Gag 及 GagPol 多蛋白前体裂解处。这些突变株在福司安普那韦单药治疗的新患者 (未用过抗逆转录病毒药物治疗患者)中也分离到，与其他 PIs 有交叉耐药。 1.5HIV 入胞抑制药耐药性及耐药机制 HIV 入胞抑制药目前只有一个品种上市，即 FuzeonTM(T20，enfuvirtide)。体外可诱导 T20 耐药变株，基因型突变在 gp41 的 3638 残基，突变株对 T20 敏感性下降 5～684 倍；临床也分离到 T20 耐药变株，突变在 gp41HR1(Nterminalheptadrepeat,NHR)的 3645 残基(Q32H/R、G36D/ S、I37V、V38A/M、Q39R/H、Q40H、N42T/D/Q/H、N43D/S/K/ Q、L44M、L45M、R46M、V69I)，对 T20 敏感性下降 4～422 倍［25，26］。在 NHR 与 CHR(Cterminalheptadrepeat)连接处及 CHR 也可发生突变，位于 HR2(CHR) 的突变 S138A 伴发于 43 突变，使耐药性在原有基础上再增加 3 倍。V38A/M、N42T/D/ Q/H、N43D/S/K/Q 呈高度耐药，G36D/S、L44M、L45M 的耐药程度较低，部分突变株 的复制能力下降。近期报道［27］，有 105%未用过 T20 治疗患者可发生耐药突变，基 因多形性(polymorphisms)在 HIV 非 B 亚型及重组型发生率比 B 亚型多。不同取代与亚 型有关：N42S 发生在亚型 A、B、G 及 C，不发生在亚型 F；Q56R 发生在亚型 A(CRF02AG)；L54M 发生在亚型 B(CRF14BG)。 2 抗乙型肝炎病毒(HBV)药 2.1 抗 HBV 的治疗针对慢性活动性肝炎(CHB)，治疗的近期目的是持续降低病毒载量， ALT 正常，改进肝病理及清除 HBeAg；远期目的是防止肝炎进展为肝硬化，肝功失代偿 及肝癌。当今临床应用的抗 HBV 药物有干扰素 α(IFN)、拉米夫定(lamivudin,3TC)、阿 德福韦二吡呋酯(adefovirdipivoxil，ADV)及恩替卡韦(entecavir，ETV，2005 年 3 月 上市)，前三药在临床应用较久，表 1 及表 2 比较三药疗效。三个化学药的作用靶位均为 HBVDNA 聚合酶/逆转录酶［28］。 2.2 拉米夫定的耐药及耐药机制 3TC 抑制 HBV 复制，降低病毒载量效果显著，但易 引起耐药。亚洲多中心研究报道，3TC 用药 1、2、3、4 及 5 年，其耐药发生率分别为 15%、38%、55%、67%及 69%［29，30］。对 HBeAg 阴性患者，3TC 的耐药发生 率更高。因 HBV 复制率高［31］，每天产生约 1011 毒粒；由前病毒(前病毒 RNA)进行 逆转录时，HBVDNAP/RT 缺乏纠错功能(proofreading)，无 3′5′外切酶，每个复制循环， 每个碱基的错配率为 10-4；现有药物对核内 cccDNA(共价闭环 DNA)无抑制作用， cccDNA 在感染细胞内存在一定拷贝数，使 HBVDNA 可持续复制等因素，HBV 易发生耐 药突变是可想象的。耐药是 3TC 临床治疗中的重要问题，也是新药开发必需考虑的问题。 发生耐药株后，疗效下降，病情反复，原已降低的 HBVDNA 及 ALT 又上升，一般上升幅 度较低，不超过治疗前水平。发生耐药突变后，继续用 3TC 治疗，对部分患者仍有疗效， 肝病理变化继续改进，但也有 41%患者病情加重，尤其在肝移植及 HIV/HBV 共感染患者 可引起进行性肝硬化，肝病理损伤加重，甚至发展为严重肝炎。对已发生耐药突变患者 ［32～34］，是继续用药或停药或改用其他药物，文献报道结果矛盾，并且不同耐药株复 制能力不同，是否继续用 3TC 治疗，应根据耐药株特征及临床肝病情况(肝功代偿或失代 偿)，加以综合考虑，因人而异制定方案(表 3)。HBVDNA 聚合酶/逆转录酶可分五个保守 的功能亚区［35，36］，耐药突变常发生在 HBVDNA 聚合酶 C 基序高度保守区 YMDD(酪氨酸蛋氨酸天冬氨酸天冬氨酸)内，蛋氨酸被异亮氨酸(YIDD)或缬氨酸(YVDD) 取代。最常见的变异为 M552I/V 及 L528M/M552V，其他有 L528M/ M552I、A529T、V521L、L428V/I、L430M、V521L、A548V 等。除前五个耐药突变 株在体外研究较多外，其他研究较少，与耐药关联性不够了解。单个氨基酸的取代，就可 引起高度耐药，如 M552V(即 M184V)对 3TC 的敏感性降低>1000 倍。3TC 出现耐药后， 90%患者病毒载量及 ALT 水平上升，其上升程度低于治疗前水平。各突变株对 3TC 敏感 性不一，其复制能力也不同，如 M552I/V 任一突变，使突变株复制能力下降；如两者分别 合并有 L528M 突变，可使突变株复制能力恢复。3TC 耐药机制有三方面：① YMDD 突变 可使 3TC 三磷酸的底物结合口袋构型改变，产生空间障碍，使 3TC 三磷酸结合能力下降； ② 3TC 耐药株 DNAP/RT 的催化效率改变，使 3TC 进入 HBVDNA 效率降低；③ 3TC 被 焦磷酸解或 ATP 依赖的焦磷酸解将引物末端结合的 3TCMP 切除增加。V521L(B 区)是在 阿德福韦二吡呋酯(ADV)进行临床Ⅲ期试验时，对入选患者进行基础基因型分析而发现的期试验时，对入选患者进行基础基因型分析而发现的 3TC 突变株，发生率为 9%～23%［37］。其不改变野株或耐药株对 3TC、喷昔洛韦及 ADV 的敏感性，但增加病毒复制能力。可能机理有 2：其 1 为使 HBVDNA 模板再定位， 因 B 区与模板定位有关。其 2 为影响与酶聚合反应有关的其他残基，V521 位于接近催化 中心的 DNA 模板下面，是一补偿性突变。由于其增加病毒复制效率，如患者发生此取代， 不能再用 3TC 治疗。对 A529T 在体外进行研究时，发现其复制依赖 3TC，但 A529T 突 变使与 pol 基因重叠的外膜基因(S 基因)产生一终止密码，使 HBsAg 及病毒分泌障碍。含 有此突变患者，血清 HBVDNA 不上升，也不发生进行性肝炎加重。如发生其它依赖 3TC 复制的突变株，需停用 3TC。由上所述可归纳几点：①基因型突变不一定同时伴有表型改 变；②每一突变株，不论是单点突变或多处取代，该突变株需在体外进行特征研究，包括 对药物敏感性、复制能力、复制是否依赖诱导突变的药物及对酶分子结构影响的机理等； ③临床观察耐药是否与此突变有关。可见，每一突变株的研究是很复杂的。对 HBV 感染进 行肝移植患者，术后一般用 3TC 或 3TC+HBIg 治疗，以预防 HBV 复发。HBIg 诱导的耐 药突变，常发生在 HBVDNAP/RT 的 AB 间区。大规模 HBV 疫苗接种也可诱导突变株，逃 避疫苗的保护作用。如台湾于 1984 年开始大规模 HBV 疫苗接种，10 年后发现在 HBV 慢 性携带者体内 HBV 逃逸变株由 8%上升到 28%。这两种突变株对 3TC 均敏感，长期应用 3TC 治疗，在原变异的基础上可再诱发 3TC 耐药突变，使治疗失败。3TC 耐药株与其它 抗 HBVL 型核苷衍生物(FTC、telbivudine)及泛昔洛韦、恩替卡韦(恩替卡韦高剂量可克 服交叉耐药)有交叉耐药。 表 1HBeAg 阳性的 CHB 对抗病毒治疗反应（略） 表 2HBeAg 阴性的 CHB 对抗病毒治疗反应（略） *IFN 及 3TC：分子杂交；ADV：PCR；NA：未测定。 表 3 治疗 CHB 的建议（略）