靶向给药研究论文

【关键词】靶向给药；药剂学；药物载体 0 引言 常规剂型的药物经静脉、口服或局部注射后，药物分布于全身，真正到达治疗靶区的 药物量仅为给药量的小部分，而大部分药物在非靶区的分布不仅无治疗作用，还会带来毒 副作用.因此，药物新剂型的开发已成为现代药剂学发展的一个方向，其中靶向给药系统 （Targeteddrugdeliverysystem,TDDS）的研究已经成为药剂学研究热点［的研究已经成为药剂学研究热点［1］.TDDS 指一类能使药物浓集定位于病变组织、器官、细胞或细胞内的新型给药系统.靶向制剂具有 疗效高、药物用量少.毒副作用小等优点.理想的 TDDS 应在靶器官或作用部位释药，同时 全身摄取很少，这样，既可提高疗效，又可降低药物的毒副作用.TDDS 要求药物能到达靶 器官、靶细胞，甚至细胞内的结构，并要求有一定浓度的药物停留相当长的时间，以便发 挥药效.成功的 TDDS 应具备 3 个要素：定位蓄积、控制释药、无毒可生物降解.靶向制剂 包括被动靶向制剂、主动靶向制剂和物理化学靶向制剂 3 大类.目前，实现靶向给药的主要 方法有载体介导、受体介导、前药、化学传递系统等.现就靶向给药方法研究进展作一介绍. 1 载体介导的靶向给药 常用的靶向给药载体是各种微粒.微粒给药系统具有被动靶向的性能.有机药物经微粒 化可提高其生物利用度及制剂的均匀性、分散性和吸收性，改变其体内分布.微粒给药系统 包括脂质体(LS)LS)，纳米粒(LS)NP))或纳米囊(LS)NC))，微球(LS)MS)或微囊(LS)MC))，细胞和乳剂等.微粒 靶向于各器官的机制在于网状内皮系统(LS)RES)具有丰富的吞噬细胞，可将一定大小的微粒 (LS)0.1~3.0μm)m)作为异物摄取于肝、脾；较大的微粒(LS)7~30μm)m)不能滤过毛细血管床，被机 械截留于肺部；而小于 50nm 的微粒可通过毛细血管末梢进入骨髓. 肝癌、肝炎等肝脏疾病是常见病和多发病，但目前药物治疗效果很不理想，其原因除 药物本身药理作用尚不够理想外，不能将药物有效地输送至肝脏的病变部位也是一重要原 因.将一些抗肿瘤、抗肝炎药物制备成微粒，给药后可增加药物的肝靶向性.米托蒽醌白蛋 白微球（DHAQBSAMS）的研究已经成为药剂学研究热点［的体内分布研究发现，给药 20min 时，DHAQBSAMS 和米托 蒽醌（DHAQ）的研究已经成为药剂学研究热点［在小鼠体内分布有显著差异，DHAQBSAMS 约有 80%的药物集中在肝脏， 而 85.9%以上的 DHAQ 存在于血液中［2］.张莉等［3］考察去甲斑蝥素（NC)TD）的研究已经成为药剂学研究热点［微乳 的形态、粒径分布及生物安全性，研究 NC)TD 微乳及其注射液在小鼠体内的组织分布，结 果表明，NC)TD 微乳较 NC)TD 注射液增强了药物的肝靶向性，降低了肾脏分布，在一定程 度上延长药物在小鼠体内的循环时间.纳米粒和纳米囊肝靶向制剂的研究报道较多，如氟尿 嘧啶、阿霉素、羟基喜树碱、狼毒乙素、环孢素等抗癌药物都被制成了纳米靶向制剂 ［4］.王剑红等［5］采用二步法制备米托蒽醌明胶微球，粒径在 5.1~25.0μm)m 范围的占 总数 87.36%，体外释药与原药相比延长了 4 倍.经小鼠体内分布试验表明具有明显的肺靶 向性，靶向效率增加了 3~35 倍，肺中药代动力学行为可用一室开放模型描述，平均滞留 时间延长 10h.在纳米粒表面上包封亲水性表面活性剂，或通过化学方法连接上聚乙二醇或 其衍生物，可以减少与网状内皮细胞膜的亲和性，从而避免网状内皮细胞的吞噬，提高毫 微粒对脑组织的靶向性.Gulyaev 等［6］以生物降解材料聚氰基丙烯酸丁酯为载体，以吐 温 80 为包封材料制备了阿霉素毫微粒，研究结果表明脑中阿霉素浓度是对照组的 60 倍. 一些易于分解的多肽或不能通过血脑屏障的药物（如达拉根、洛哌丁胺、筒箭毒碱）的研究已经成为药剂学研究热点［通过 制成包有吐温 80 的生物降解毫微粒在动物身上已取得一定的靶向治疗效果［7］.研究表 明粒径是影响微粒进入骨髓的关键因素，粒径越小越容易进入骨髓.彭应旭等［8］制得不 同粒径的柔红霉素聚氰基丙烯酸正丁酯毫微粒，小鼠尾静脉给药，小粒径组 （70±24）的研究已经成为药剂学研究热点［nm 骨髓内柔红霉素浓度是大粒径组（425±75）的研究已经成为药剂学研究热点［nm 的 1.58 倍.骨髓会因肿 瘤浸润、化疗药物或严重感染受到抑制.研究表明，多种生长因子，如人粒细胞集落刺激因 子（GC)SF）的研究已经成为药剂学研究热点［，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GMC)SF）的研究已经成为药剂学研究热点［可促使骨髓细胞自我更新、分裂 增殖，并提高其活性.利用骨髓靶向载体可提高药物在骨髓内分布，并避免血象中的不良反 应.Gibaud 等［9］以聚氰基丙烯酸异丁酯、异己酯毫微粒为载体携带 GC)SF，提高了其 在骨髓内的分布. 基因治疗是一种专一性的靶向治疗.基因治疗就是利用基因转移技术将外源重组基因或 核酸导入人体靶细胞内，以纠正基因缺陷或其表达异常.纳米颗粒作为基因载体具有一些显 著的优点.纳米颗粒能包裹、浓缩、保护核苷酸，使其免遭核酸酶的降解；比表面积大，具 有生物亲和性，易于在其表面耦联特异性的靶向分子，实现基因治疗的特异性；在循环系 统中的循环时间较普通颗粒明显延长，在一定时间内不会像普通颗粒那样迅速地被吞噬细 胞清除；让核苷酸缓慢释放，有效地延长作用时间，并维持有效的产物浓度，提高转染效 率和转染产物的生物利用度；代谢产物少，副作用小，无免疫排斥反应等. 2 受体介导的靶向给药 利用细胞表面的受体设计靶向给药系统是最常见的主动靶向给药系统.去唾液酸糖蛋白 受体（ASGP)R）的研究已经成为药剂学研究热点［是一种跨膜糖蛋白，它存在于哺乳动物的肝实质细胞上.其主要功能是去 除唾液酸糖蛋白和凋亡细胞、清除脂蛋白.研究发现，ASGP)R 能特异性地识别 N 乙酰氨基 半乳糖、半乳糖和乳糖，利用这些特性可以将一些外源的功能性物质经过半乳糖等修饰后， 定向地转入到肝细胞中发挥作用.Lee 等合成了三分枝 N 乙酰氨基半乳糖糖簇 YEE，它与肝 细胞的结合能力为乙酰氨基半乳糖单糖的 1 万倍.我们考察了半乳糖苷修饰的十六酸拉米夫 定酯固体脂质纳米粒（LAP)GSLN）的研究已经成为药剂学研究热点［的肝靶向性，其靶向效率为 4.66，比未修饰纳米粒的 靶向效率高 3.7 倍［10］.药物通过与大分子载体连接，再对载体进行半乳糖化，可以产 生较好的肝靶向效果.若能使药物直接半乳糖化，则可以简化耦联环节，提高靶向效率.这 一思路对蛋白类药物而言，较易实现.蛋白质或多肽(LS)分子质量在一定范围)在连接上半乳糖 后，都有可能成为受体结合的肝靶向性物质.小分子物质经类似途径能否靶向于肝，取决于 糖和药物密度、分子质量、摄取屏障等多方面因素.小分子药物共价连接乳糖或半乳糖，初 步揭示其靶向性并不好，有关机制和可行性尚待进一步探讨. 半乳糖基化壳聚糖（GC)）的研究已经成为药剂学研究热点［与质粒 pEGFP)N1 混和制备成纳米微囊复合物，体外转染 SMMC)7721 细胞.将含 1mg 质粒的纳米微囊经肝动脉和门静脉注射入犬体内，实验结果 表明半乳糖基化壳聚糖在体外有较高的转染率，在犬体内有肝靶向性，可用作肝靶向基因 治疗的载体［11］.大多数肿瘤细胞表面的叶酸受体数目和活性明显高于正常细胞.以叶酸 作为导向淋巴系统或肿瘤细胞的放射性核素的载体，同时将叶酸作为靶向肿瘤细胞的抗肿 瘤药物的载体已做了广泛的研究［12］. 表皮生长因子受体（EGFR）的研究已经成为药剂学研究热点［是一种跨膜糖蛋白，由原癌基因 cerbB1 所编码，是 erbB 受体家族之一，在多种肿瘤中观察到 EGFR 高水平的表达，如神经胶质细胞瘤、前 列腺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌和胸腺上皮癌等.针对富集 EGFR 的恶性肿瘤， 方华圣等［13］成功地建立了 EGFR 富集的恶性肿瘤的靶向基因治疗方法. 3 抗体介导的靶向给药 mAb 是药物良好的靶向性载体，将其通过共价交联或吸附到药物载体(LS)如脂质体、毫 微粒、微球、磁性载体等)或药物具有自身抗体(LS)如红细胞)或抗体与细胞毒分子形成结合物， 避免其对正常组织毒性，选择性发挥抗肿瘤作用.徐凤华等［14］利用己二酰肼制备腙键 连接的聚谷氨酸表阿霉素，然后使其与单抗交联制得偶合物.偶合物较好地保留了抗体活性， 体外细胞毒性较游离药物略有下降，但表现出单抗介导的靶细胞选择性杀伤作用，为其进 一步制备细胞靶向的肿瘤化疗药物奠定了基础. 用于治疗白血病的 C)MA676 是由一种人源化的 mAbhp67.6 与新型的抗肿瘤抗生素 calicheamicin 的 N 乙酰 γ 衍生物偶联而成的［15］，当 C)MA676 与 C)D33 抗原相结合， 抗原抗体复合物迅速内在化，进入胞内后，calicheamicin 衍生物被水解释放，通过序列 特异性方式与 DNA 双螺旋的小沟结合，使脱氧核糖环中的氢原子发生转移，从而使 DNA 双链断裂，诱导细胞死亡［16］.EGFRmAb 可直接作用于 EGFR 的细胞外配体结合区， 阻滞配体的结合，如 IMC)C)225,ABXEGFR 和 EMD55900 等，能抑制细胞生长和存活率， 诱导细胞凋亡和抑制血管生成，曲妥珠单抗(LS)Trasruzumab)作用于 erbB2 的细胞外区域， 该药已获美国 FDA 批准用于转移性的乳腺癌的治疗［17］.IMC)C)225 具有增强细胞毒性 药物和放射治疗效应的作用，IMC)C)225 与拓扑特肯(LS)TP)T)的联合用于荷有人类结肠癌移植 体的裸鼠，能提高其生存率［18］.由第四军医大学和成都华神集团股份有限公司联合研 制的治疗肝癌新药碘［13lI］美妥昔单抗注射液，日前获得国家食品药品监督管理局颁发 的生产文号，即将上市.这是全球第一个专门用于治疗原发性肝癌的单抗导向同位素药物. 4 制成前体药物 一些药物与适当的载体反应制备成前体药物，给药后药物就会在特定部位释放，达到 靶向给药的目的.脑是人高级神经活动的指挥中枢，也是神经系统最复杂的部分.但由于血 脑屏障（bloodbrainbarrier,BBB）的研究已经成为药剂学研究热点［的存在，使得大部分治疗药物不能有效透过 BBB.含 OH,NH2,C)OOH 结构的脂溶性差的药物可通过酯化、酰胺化、氨甲基化、醚化、环化等化 学反应制成脂溶性大的前体药物，进入 C)NS 后，其亲脂性基团通过生物转化而释放出活性 药物.张志荣等［19］合成了 3′,5′二辛酰基氟苷，并制备了其药质体，给小鼠静脉注射后 用 HP)LC) 法测定药物在体内各组织的分布，结果表明，氟苷酯化后的前体药物的药质体有 良好的脑靶向性. 结肠内有大量的细菌，能产生许多独特的酶系，许多高分子材料在结肠被这些酶所降 解，而这些高分子材料作为药物载体在胃、小肠由于相应酶的缺乏不能被降解，这就保证 药物在胃和小肠不释放.如多糖、果胶、瓜耳胶、偶氮类聚合物和 α,β,γ 环糊精均可成为结 肠给药体系的载体材料.常利用结肠内厌氧环境，使偶氮键还原的特点制成偶氮前体药物. 柳氮磺胺吡啶是由 5 氨基水杨酸（5ASA）的研究已经成为药剂学研究热点［与磺胺吡啶用偶氮键连接而成.口服后在结肠释 药，发挥 5ASA 治疗溃疡性结肠炎的作用,减少其胃肠吸收产生的全身不良反应.5ASA 也与 非生理活性的高分子聚合物通过偶氮双键制成前体药物［20］.糖皮质激素共价连接于多 糖［21］，环糊精［22］制成的前药，口服后在结肠部位可释放出药物，可用于结肠炎的 治疗.我们［23，24］合成了果胶酮洛芬（P)TKP)）的研究已经成为药剂学研究热点［前药，进行了体内外评价.结果表明， 此前药在不同 pH 环境下结构稳定，只能被结肠果胶酶特异性降解，释放出 KP)，发挥治疗 作用.也可以利用结肠 pH 差异和时滞效应设计结肠靶向给药系统［25］. 5 化学传递系统 化学传递系统（chemicaldeliverysystem,C)DS）的研究已经成为药剂学研究热点［是一种输送药物透过生理屏障到达 靶部位，再经生物转化释放药物的药物传递系统.C)DS 通常是将含 OH,NH2,C)OOH 结构的 药物共价连接于二氢吡啶载体（Q）的研究已经成为药剂学研究热点［，药物（D）的研究已经成为药剂学研究热点［与靶向剂二氢吡啶结合为 DQ 结合物，建 立了二氢吡啶―二氢吡啶钅翁盐氧化还原脑内定向转释递药系统.C)hen 等［26］设计了 TyrLys 的脑靶向 C)DS，并评价它的药效.Lys 的 C) 末端接亲脂性胆甾烯酯，N 末端通过一 种 L 氨基酸桥接靶向剂 1，4 二氢葫芦巴碱（含吡啶结构）的研究已经成为药剂学研究热点［制成 TyrLysC)DS，全身给药后， 通过被动扩散机制透过 BBB，且经酶催化 1，4 二氢葫芦巴碱变为季铵盐型使其存留于脑 内.通过小鼠甩尾间隔期实验证明，TyrLysC)DS 作用时间明显延长.Mahmoud 等［27］ 将吸电子羧甲基连接到氮原子构建了一种新的二氢吡啶载体介导的脑定向转释系统(LS)N 羧甲 基 1,4 二氢吡啶 3,5 二酰胺),该载体稳定,具有良好的脑定向转释能力. 靶向给药的研究还面临许多实质性的挑战.提高药物在靶组织的生物利用度；提高 TDDS 对靶组织、靶细胞作用的特异性；使生物大分子更有效地在作用靶点释放，并进入 靶细胞内；体内代谢动力学模型；质量评价项目和标准，体内生理作用等问题都是研究的 重点.随着靶向给药系统研究的深入，新的靶向给药途径、新的载药方法将会不断出现，遇 到的问题会逐步解决.靶向给药的研究不仅具有理论意义，而且会产生明显的经济和社会效 益. 【关键词】聚酮化合物；,,聚酮合酶；,,组合生物合成 摘要：聚酮化合物的组合生物合成是当前国际化学与生物学交叉学科研究的热点之一， 也正在发展成为药物创新超常规的重要手段。本文对近十年来聚酮化合物，特别是 I 型聚 酮化合物的组合生物合成的常用技术和方法学发展进行了回顾和展望。 关键词：聚酮化合物；聚酮合酶；组合生物合成 ABSTRAC)TP)olyketidecompoundsandtheirbiosynthesisbycombinatorialappr oacheshadreceivedgreatattentionasacrossdisciplinarysubjectinanewfiledofche micalbiologyforitsimportanceandgreatpotentialtocreatebrandnewdruginfuture. Inthisreview,wehopetosummarizemethodsandtechnologieswhichhadbeendevel opedoverpasttenyearsorsofortheimaginativediscoveryofnovelpolyketidecompo undsbycombinatorialbiosynthesis,whichincorporategenetic,chemicalandbioche mical,bioinformaticandbiotechnologicalapproaches.KEYWORDSP)olyketide;P)oly ketidesynthase;C)ombinatorialbiosynthesis 1 聚酮化合物及其聚酮合酶 聚酮化合物是一大类由细菌、真菌和植物将低级羧酸通过连续的缩合反应产生的天然 产物，它包括许许多多具有抑制细菌(LS)如红霉素、四环素)、真菌(LS)如灰黄霉素、两性霉素)、 寄生虫(LS)如 avermectin、奈马克丁)、癌症(LS)如多柔比星、enediynes)等活性的化合物， 有些抗真菌聚酮化合物同时还具有免疫抑制剂的活性(LS)如雷帕霉素、FK506)，它被广泛地 应用于医药、畜牧和农业。如今，这一化合物越来越为人们所重视，这主要是由于该化合 物具有：(LS)1)无可比拟的生物学活性使之具有巨大的新药物开发潜力和商业价值，聚酮化合 物所形成的药物已用于几乎所有重要的疾病治疗，每年的销售额超过了 100 亿美元；(LS)2) 独特的结构和合成机制为人们研究酶催化的分子机制、分子识别和蛋白质的相互作用提供 了空前的契机；(LS)3)聚酮合酶所具有的可塑性可以使人们方便地通过组合生物合成手段来获 得新的化合物［1］。目前已发现了不少于 10000 种聚酮化合物，而由之衍生出的新产物 更是难以记数。聚酮化合物是功能和结构最多样化的天然产物之一，它们的合成包括酰基 辅酶 A 活化羧酸的一系列重复的醇醛缩合而形成有一定长度的聚酮链骨架，然后经过环化 或者芳香化、或者与脱氧糖等结构单位连接等过程。尽管聚酮化合物的结构和特性千差万 别，总的来说它可以分为两大类：芳香族聚酮化合物和复合聚酮化合物。前者是乙酸通过 缩合(LS)起始单位除外)形成的大部分 β 酮基在酰基链的延伸和完成后都一直保持非还原状态， 经过折叠和醇醛缩合形成六元环，芳香环随后被脱水还原，如放线紫红素、柔红霉素、四 环素。复合聚酮化合物比芳香族聚酮化合物在结构变化上大的多，其构成单位有乙酸、丙 酸和丁酸等，而且由于与芳香族聚酮化合物在合成化学、β 酮基还原过程、侧链的空间位 阻上的本质差别，许多不经过折叠和芳香化，而是通过内酯化成环，还有一部分仍保持酰 基链，如大环内酯抗生素红霉素和螺旋霉素、抗真菌抗生素雷帕霉素和两性霉素、聚醚类 抗生素莫能霉素和南昌霉素、抗寄生虫抗生素 avermectin 等。聚酮化合物是通过聚酮合 酶(LS)polyketidesynthase,P)KS)催化形成的，其催化过程类似于脂肪酸合酶 (LS)fattyacidsynthase,FAS)催化的脂肪酸生物合成，即通过酰基 C)oA 活化的底物之间的重 复脱羧缩合而合成［2，3］，但两者在合成单位的选择(LS)包括起始单位和延伸单位)、链装 配过程中每个酮基还原程度的控制、以及芳香聚酮或复合聚酮链长的决定等方面也存在着 明显的差异，主要体现在：(LS)1)FAS 一般以乙酸作为起始单位，而 P)KS 往往使用不同的起 始单位，最为常用的有乙酸、丙酸，此外还有丁酸，杀假丝菌素使用的对氨基苯甲酸等， 而 avermectin 所利用的起始单位可多达 40 余种；(LS)2)FAS 一般只用乙酸为链延伸单位， 而 P)KS 除了利用乙酸作为链伸长单位外，还可利用丙酸或丁酸，在终产物中相应生成甲基 或乙基侧链；(LS)3)P)KS 可以通过酮基选择性地还原和脱水，从而在终产物的相应位置形成酮 基、羟基、双键或亚甲基等功能团，同时也决定了手性中心的立体化学构型。目前已经揭 示的聚酮合酶可以分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型［型、Ⅱ型和Ⅲ型［型和Ⅲ型［型［4］。研究和报道最多和较为透彻的是 Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型［型 P)KS，它是由几个多功能的多肽组成，每一个多肽上都分别携带有参与聚酮生物合成 所必需的各种酶的结构域(LS)domain)，每个结构域只参与整个聚酮碳链构建中的一步生化反 应(LS)noninterative)，而参与一轮聚酮生物合成反应的所有结构域称为一个合成酶单位 (LS)SU,synthaseunit)，编码这个合成酶单位的 DNA 称为一个模块(LS)module)。Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型［型模块结 构的 P)KS 就犹如在轨道上行驶的一列火车，在起点由特定的“搬运工”――酰基转移酶 (LS)acyltransferase,AT)把不同的起始单位装车后，通过“装配工”――酮脂酰 AC)P) 合成酶 (LS)ketoacylAC)P)synthase,KS)经过缩合反应将不同的“原料”――羧酸起始或延伸单位进行 组装，随着火车的运行，不断地从一个“停靠装配站”――酰基载体蛋白 (LS)acylcarrierprotein,AC)P))到下一个，聚酮链也不断地得到延伸，中途根据模块组成的不 同和指令要求，在其它不同的“特殊工种装配工”――脱水酶(LS)dehydratase,DH)、烯醇还 原酶(LS)enoylreductase,ER)的作用下相应地进行还原(LS)形成 β 羟酯键)或脱水(LS)形成 α,β 烯醇 酯键)或进一步还原(LS)形成饱和的亚甲基)，直至到达终点，在“装卸工”硫酯酶 (LS)thioesterase,TE)的帮助下，完成最后的工序并将聚酮前体产物从 P)KS 上卸载下来。这 种 P)KS 模块结构的发现有其非同寻常的意义。尽管各种聚酮化合物结构各异，P)KS 模块的 底物特异性决定了 I 型 P)KS 对起始单位和延长单位的选择，而 P)KS 每个模块上还原结构域 的种类则使聚酮产物得到不同程度的还原。复合聚酮化合物结构的多样性来自聚酮骨架组 成单位的多样性和每个碳单位的不同还原程度，这意味着聚酮抗生素的结构具有相当大的 可塑性，故可通过模块内或模块间的合理重组，设计出新基因(LS)簇)组成或新的生物合成途 径，这也是 I 型 P)KS 作为组合生物学主要研究对象的重要原因之一。Ⅱ型和Ⅲ型［型 P)KS 是一个多功 能酶复合体，只包含一套可重复使用(LS)interative)的结构域，每一结构域在重复的反应步 骤中被多次地用来催化相同的反应，其首次报道是在 1984 年［5］。以来自 S.glaucescens 的芳香族聚酮化合物 tetracenomycinC) 研究的较多［6］，尽管已经发 现了影响链长的两个链长决定因子(LS)C)LF)KSα 和 KSβ，但确切机制仍然不是十分清楚。对 Ⅱ型和Ⅲ型［型 P)KS 的研究近年来也取得了一些进展，如 Bao 等［7］对柔红霉素产生菌 S.peucetius 的研究结果显示，dpsC) 基因决定了生物合成的起始单位，DpsC) 专一性地使 用丙酰 C)oA 为起始单位，一般来说，Ⅱ型和Ⅲ型［型 P)KS 的起始单位均为乙酰 C)oA。另外，Bisang