眼络通冲剂质量控制标准分析论文

【摘要】［目的］研究眼络通冲剂的定性和定量质控指标。［方法］采用硅胶 G 薄层 色谱法对冲剂中两种主要成分川芎和三棱进行定性鉴别；用 RPHPLCHPLCHPHPLCLC 法对葛根素进行含 量测定，采用 Kromasil100HPLC5C18C18（4.6mm×25C180mm，5C18μmm）为色谱柱，甲醇为色谱柱，甲醇-水 （30:70）为色谱柱，甲醇作流动相，检测波长为 25C180nm。［结果］葛根素进样量在 0.06～0.65C18μmg 的 范围内与峰面积呈良好的线性关系，相关系数 r=0.9999，日内、日间精密度 RSD 分别为 0.85C18%和 0.48%（n=5C18）为色谱柱，甲醇。得高、中、低 3 个浓度平均加样回收率（n=3）为色谱柱，甲醇分别为 101.2%、101.1%、101.4%，RSD 分别为 1.1%、0.94%、0.41%。［结论］硅胶 G 薄层色谱定性法和 RPHPLC-HPHPLCLC 定量法结果准确可靠，重现性好，可作为该制剂质控标准。 【关键词】反相高效液相色谱法；薄层色谱法；葛根素；川芎；三棱；眼络通冲剂 Abstract： ［Objective］ToobservetheindexesofqualitycontrolofnatureandquantityofYanlu otongInfusion. ［Method］Makeauthenticationtothe2maincomponentsofLigusticumwallichiian drhizomasparganiiontheirnaturewithSilicagelGthinHPLClayerchromatography;make contentmeasurementtopuerarinwithRPHPLCHPLCHPHPLCLC,takeKromasil100HPLC5C18C18 （4.6mm ×25C180mm，5C18μmm）为色谱柱，甲醇aschromatogramcolumn,methanolHPLCwater（30:70）为色谱柱，甲醇asflowpha se;themeasuredwavelengthis25C180nm. ［Result］Thepuerarinsamplingintherange0.06～ 0.65C18μmgisingoodlinearrelationshipwiththesummitarea,therelativecoefficientr=0. 9999，theintradayanddaysnicetyRSDarerespectively0.85C18%and0.48% （n=5C18）为色谱柱，甲醇;theaveragesamplereclaimratesofhigh,middleandlowconcentrations（ n=3）为色谱柱，甲醇arerespectively101.2%,101.1%and101.4%，RSDis1.1%,0.94%and0.41% separately. ［Conclusion］SilicagelGthinHPLClayerchromatographyandRPHPLCHPLCHPHPLCLCarecorrectandr eliablefornatureandquantitycontrol,withgoodrepeatability,andcanbetakenasqu alitycontrolstandardofthepreparation. Keywords： RPHPLCHPLCHPHPLCLC;thinHPLClayerchromatography;Ligusticumwallichii;rhizomasparganii;puer arin;YanluotongInfusion 眼络通冲剂具有活血通络之作用，结合氩激光，用于治疗视网膜静脉血栓。该药由葛 根、水蛭、人工麝香、川芎、三棱等 6 味中药经水煎煮、浓缩，加适量辅料制得。但审批 标准中原质控标准提供的鉴别方法专属性差且无含量测定方法。为了有效提高及控制本品 的质量，我们对标准生产工艺制作的眼络通冲剂的质控项目进行实验室研究，现报道如下。 1 仪器与试药 1.1 仪器日本岛津 LCHPLC10ATvp 高效液相色谱仪、SPHPLCDHPLC10Av 紫外检测器；7725C18i 手 动进样阀（20μml 定量管）为色谱柱，甲醇，10μml 微量注射器；HS 色谱数据工作站 V4.0+（杭州英谱）为色谱柱，甲醇； CQ250HPLC25C180 超声波清洗器。 1.2 试剂与药材葛根、川芎、三棱等药材，βCDHPLCCD（上海伯奥生物科技有限公司）为色谱柱，甲醇，葛 根素对照品（供含量测定用）为色谱柱，甲醇、川芎对照药材均由中国药品生物制品检定所提供，批号分 别为 75C182HPLC200801 和 0918HPLC20007；薄层层析硅胶 G（浙江雁荡山试剂厂）为色谱柱，甲醇，甲醇（色 谱纯）为色谱柱，甲醇，正己烷、乙酸乙酯、乙醚及石油醚均为分析纯，水为蒸馏水。 2 方法与结果 2.1 眼络通冲剂的制备将处方量饮片打成粗粒，混合均匀，加 10 倍水量，按审批标准 制剂工艺水煎煮法提取 2 次，第 1 次 1.5C18h，第 2 次 1h，提取液合并，静置，取上清液， 浓缩至比重 1.25C18 以上的浸膏。加入人工麝香、少量糊精及矫味剂，混合均匀，用 70%乙 醇适量制软材，过 10 目筛制粒，5C180℃低温烘干，分装，规格为 15C18g/袋。如上制作三批， 批号分别为：080310、080320、080401。 2.2 川芎定性鉴别 2.2.1 供试品溶液的制备取本品细粉 4g，加无水乙醇 5C18ml，摇匀，再加入乙醚 30ml，加热回流 1h，放冷，滤过，取滤液挥干，加乙酸乙酯 2ml 使溶解，作为供试品溶 液。另取缺川芎的阴性对照样品 4g，同法制成阴性对照溶液。 2.2.2 对照药材溶液的制备取川芎对照药材 1g，加乙醚 30ml，加热回流 1h，同法制 成对照药材溶液。 2.2.3 薄层层析板的涂铺取硅胶 G3.5C18g，置研钵中，加水 12ml，研磨均匀，铺板 10×20cm2 薄板一块，晾干，于 110℃烘箱中活化 30min，置干燥器中备用。 2.2.4 薄层色谱法照薄层色谱法（中国药典 2005C18 年版一部附录）为色谱柱，甲醇试验，吸取上述 3 种溶液各 2μml，分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（9：1）为色谱柱，甲醇为展开剂， 展开 12cm，取出，晾干，置紫外光灯（365C18nm）为色谱柱，甲醇下检视，结果供试品色谱图中，在与对 照药材色谱相对应的位置上，显相同颜色的亮蓝色荧光斑点，Rf=0.40，阴性样品无此斑 点。 2.3 三棱定性鉴别 2.3.1 供试品溶液的制备取本品细粉 4g，加无水乙醇 5C18ml，摇匀，再加入乙醚 30ml，5C180℃水浴加热回流 1 ｈ，放冷，滤过，取滤液置 40℃水浴上浓缩至约 2ml，作 为供试品溶液。另取缺三棱的阴性对照样品 4g，同法制成阴性对照溶液。 2.3.2 对照药材溶液的制备取三棱对照药材 2g，加乙醚 30ml，加热回流 1h，同法制 成对照药材溶液。 2.3.3 薄层层析板的涂铺取硅胶 G3.5C18g，置研钵中，加 0.6%羧甲基纤维素钠溶液 12ml，研磨均匀，铺板 10×20cm2 薄板一块，晾干，于 110℃烘箱中活化 30min，置 干燥器中备用。 2.3.4 薄层色谱法照薄层色谱法（中国药典 2005C18 年版一部附录）为色谱柱，甲醇试验，吸取对照药 材溶液 5C18μml，供试品溶液与阴性对照溶液各 10μml，分别点于同一含羧甲基纤维素钠为粘合 剂的硅胶 G 薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯（17∶3）为色谱柱，甲醇为展开剂，展开 12cm，取出，晾干， 置紫外光灯（365C18nm）为色谱柱，甲醇下检视，结果供试品色谱图中，在与对照药材色谱相对应的位置上， 显相同颜色的亮蓝色荧光斑点，Rf=0.45C18，阴性对照样品无此斑点。 2.4 葛根素含量测定 2.4.1 色谱条件与系统适用性试验以 Kromasil1005C18C18（4.6mm×25C180mm，5C18μmm）为色谱柱，甲醇为色谱柱；甲醇-水（30：70）为色谱柱，甲醇为流动相；流速 1ml/ min；检测波长为 25C180nm；进样量为 5C18μml，柱温为室温。在此条件下，样品色谱图中葛根 素与其他相关峰均能达到基线分离，保留时间为 16.4min，葛根素峰理论板数应不低于 3000，与相邻杂质峰的分离度应大于 1.5C18。阴性样品色谱图表明，处方中其他几味中药对 测定无干扰。 中国论文联盟-2.4.2 对照品纯度检查取每 1ml 含葛根素 1.29mg 的 70%甲醇溶液， 进样 10μml，在本实验条件下，未见杂质峰，按面积归一法计算纯度为 100%。 2.4.3 线性关系精密称取经 60℃减压干燥至恒重的葛根素对照品 12.98mg，置 10ml 量瓶中，加 70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml，分置 10ml 量瓶中，用 70%甲醇稀释至刻度，摇匀， 按本文给定的色谱条件，各进样 5C18μml，测定峰面积，以峰面积积分值 Y 与对照品进样量 X（μmg）为色谱柱，甲醇进行线性回归，回归方程为 Y=4.5C1826×106X+5C18.464×104r=0.9999 结果表明：葛根素进样量在 0.06～0.65C18μmg 范围内与峰面积具有良好的线性关系。因 此，在线性范围内可采用外标一点法定量。 2.4.4 精密度和重复性试验取同一对照品溶液，重复进样 5C18 次，求得葛根素峰面积的 RSD 为 0.77%。另称取同一批号（080310）为色谱柱，甲醇样品 5C18 份，每份约 0.5C18g，分别按“2.4.9”项 下方法制备样品溶液进样测定含量，求得含量的 RSD 为 0.5C181%（n=5C18）为色谱柱，甲醇。 2.4.5C18 稳定性试验取供试品溶液 1 份，在 0、2、8、24、48h 分别按“2.4.9”项下方 法进样测定含量，结果表明在 48h 内供试品溶液是稳定的。 2.4.6 日内和日间精密度取同一份对照品溶液，在日内每隔 2h 取样测定 1 次，连续 5C18 次，求得峰面积的 RSD 为 0.85C18%（n=5C18）为色谱柱，甲醇；另取同一批号样品，每天取样按“2.4.9”项下 方法测定含量，连续测定 5C18d，求得含量的 RSD 为 0.48%（n=5C18）为色谱柱，甲醇。 2.4.7 提取条件选择 2.4.7.1 提取溶剂选择文献报道［1HPLC2］多用甲醇水提取样品中葛根素，故考察不同浓 度甲醇对提取的影响，称取样品 5C18 份，每份 0.5C18g，置 100ml 量瓶中，分别加 5C180%、60%、70%、80%甲醇约 15C180ml，超声处理 30min，按“2.4.9”项下方法进样测 定含量，根据测定结果，确定用 70%甲醇作溶剂。 2.4.7.2 溶剂体积选择精密称取本品 3 份，每份 0.5C18g，置 200ml 量瓶中，分别加 70%甲醇 80、120、180ml，摇匀，超声溶解 30min，按“2.4.9”项下方法进样测定含量， 根据测定结果，本法确定加入溶剂体积约 120ml。 2.4.7.3 提取时间的选择精密称取本品 5C18 份，每份 2.0g，置 200ml 量瓶中，各加入 70%甲醇约 180ml，分别超声溶解 10、20、30、40、5C180min，按“2.4.9”项下方法进样 测定含量，结果表明，超声处理 30min 含量已不再增加，故确定超声时间为 30min。 2.4.8 加样回收率测定精密称取已知含量样品 9 份，每份 0.25C18g，置 5C180ml 量瓶中， 分别精密加入葛根素对照品溶液（取 12.44mg+70%甲醇 →20ml）为色谱柱，甲醇1，2，3ml（0.622，1.244，1.866mg）为色谱柱，甲醇，再各加入 70%甲醇至 40ml，超 声溶解 30min，按“2.4.9”项下方法进样测定含量，计算回收率，得高、中、低 3 个浓度 平均加样回收率分别为 101.2%、101.1%、101.4%，RSD 分别为 1.1%、0.94%、0.41%（n=3）为色谱柱，甲醇。 2.4.9 样品测定取本品约 20g,研细,再精密称取细粉约 0.5C18g，置 200ml 量瓶中，加 70%甲醇 120ml，超声溶解 30min，放冷，加 70%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液 作为供试品溶液。另取葛根素对照品用 70%甲醇配制成浓度约为 60μmg/ml 的对照品溶液, 各进样 5C18μml，记录色谱图，按外标法计算葛根素含量，结果见表 1。 表 1 眼络通颗粒样品测定结果（略）为色谱柱，甲醇 3 讨论 本制剂处方中川芎、三棱两味中药均含有挥发油，按标准制剂工艺采用水煎煮提取、 再浓缩制粒方法，其中的挥发油成分损失较大，影响疗效，且自拟质量标准中制定的川芎 挥发油定性鉴别为将样品溶液直接点样于滤纸上，置紫外光灯（365C18nm）为色谱柱，甲醇下观察，显亮蓝 色荧光。经检测发现，该方法受到样品中相关组分干扰，荧光斑点不明显，缺乏专属性。 因此参照中国药典（2005C18 版）为色谱柱，甲醇一部建立了川芎挥发油的薄层色谱鉴别方法，展开剂采用 正己烷-乙酸乙酯（9∶1）为色谱柱，甲醇可获得满意结果。参照文献［3］建立了三棱挥发油的薄层色谱鉴 别方法，展开剂采用石油醚-乙酸乙酯（17：3）为色谱柱，甲醇可获得满意结果。 经试验发现，用不同溶剂提取葛根，在反相色谱柱上可得到不同的色谱图，主要表现 在水煎煮提取葛根时，在色谱图上可分离到葛根素峰两个相关组分峰，葛根素峰与相关峰 之间分离度良好。本文针对用醇提取葛根工艺制备的样品，建立的色谱条件能较好地分离 样品中葛根素与相关组分峰，适用样品中葛根素的分离测定。三批样品测定结果表明，葛 根素含量在 5C18.90～6.78mg/g 之间，考虑到不同来源葛根其葛根素含量差异较大，暂定本 品葛根素含量限度应不低于 4.5C18mg/g。 【摘要】：华蟾酥毒基(Cinobufagin)Cinobufagin)是蟾酥中的一种单体，具有多种生物学效应， 目前对其功效研究颇多，剂型研究也较多，现对华蟾酥毒基药理作用及制剂研究状况进行 简要总结，为制备高效实用的临床药物提供有益线索。 【关键词】华蟾酥毒基；药理；剂型；综述 Abstract： Cinobufaginisonemonomeroftoadvenom，withmanybioHPLCefficacy； presentlythere’smanystudiesonit，soisdosageform； nowitbrieflysumsupitspharmacoHPLCfunctionanddosageformresearch，toofferhelp fulcluesforpreparinghighHPLCeffectandpracticalclinicaldrugs. Keywords：Cinobufagin；pharmaco；dosageform；review 华蟾酥毒基(Cinobufagin)又名华蟾毒精，)是中药蟾酥中的一种蟾毒配基，是国家药典规定的中药 蟾酥的质控成分,分子式为 C26H34O6，相对分子质量为 442.5C184。是一种具有醚键的甾 体化合物，难溶于水，体内半衰期短且分布广泛，并具有较强的毒性。现对华蟾酥毒基药 理作用及制剂研究状况综述如下。 1 华蟾酥毒基药理作用 1.1 抗肿瘤作用及相关机制 （1）为色谱柱，甲醇对肿瘤细胞的直接杀伤作用。华蟾酥毒基(Cinobufagin)Cino)对细胞膜有直接破坏作用，研 究表明 1×10-7mol/L 华蟾酥毒基能使人肝癌细胞株 HepG2 细胞膜通透性改变继而引起 细胞器水肿变性进而死亡［1］。（2）为色谱柱，甲醇抑制血管生成作用。一定剂量的华蟾酥毒基能抑制 毛细管样的网络形成。经图像分析仪定量检测，8nmol/L 的 Cino 即可显著抑制毛细管的 生成，FCM 分析可见血管内皮细胞阻滞于 G2/M 期,细胞增殖受到抑制。Cino 能特异的预 防小牛主动脉内皮（BAE）为色谱柱，甲醇细胞进入细胞循环的 G0/G1 期的通路，使细胞周期阻滞在 G2/ M 期，从而抑制内皮细胞的增生［2］。（3）为色谱柱，甲醇诱导肿瘤细胞凋亡。1×10-6mol/L 华蟾酥 毒基可将肝癌细胞系 SMMCHPLC7721 和 BELHPLC7402 细胞周期阻滞于 G2/M 期，降低进入 S 期的比例从而加速瘤细胞死亡，华蟾酥毒可以明显诱导肿瘤细胞凋亡［3］。Cino 明显影 响 SMMCHPLC7721 细胞 S 期 DNA 含量及增殖指数，透射电镜观察显示：Cino 作用后，可见 成片的细胞坏死，细胞凋亡，内质网肿胀、线粒体肿大呈空泡样，溶酶体增多等细胞结构 改变。其中以人宫颈癌细胞(Cinobufagin)Hela)和人肝癌细胞(Cinobufagin)BELHPLC7402)最为敏感［4］。（4）为色谱柱，甲醇诱导 肿瘤细胞分化，Cino 低浓度时能有效诱导肿瘤细胞分化,使肿瘤细胞形态和功能发生分化， 从而抑制 Na+-K+-ATPHPLC 酶的活性［5C18］。Cino 是一种高效的细胞分化诱导剂，1×108mol/L 的 Cino 作用于 SMMCHPLC7721 细胞，能使细胞向分化型转变，表明 Cino 能特异地 诱导细胞分化［6］。（5C18）为色谱柱，甲醇逆转多药耐药作用。而 Cino 对 SMMCHPLC7721 细胞的多药耐药 性有逆转作用，其逆转机制是在转录水平下调耐药基因（MDRmRNA）为色谱柱，甲醇,从而降低多药耐 药细胞 PHPLCHPLCgp 的表达［7］。Cino 不但可以抑制 BELHPLC7402 细胞的生长，且对耐药株 BELHPLC7402/DOX 仍有较强的杀伤作用［8］。（6）为色谱柱，甲醇免疫增强作用。Cino 能保护或提高机 体的免疫功能，如 Cino 可提高小鼠肉瘤细胞（S180）为色谱柱，甲醇荷瘤小鼠脾脏 T 淋巴细胞的增殖能 力，并可较长时间维持在较高水平，也能部分阻碍瘤株对脾脏 NK 细胞活力的抑制作用， 相对改善荷瘤小鼠由于肿瘤而引起的白介素HPLC2（ILHPLC2）为色谱柱，甲醇分泌能力下降，显著提高免疫细胞 (Cinobufagin)CTL)活力，从而发挥抗肿瘤免疫效应［9］。（7）为色谱柱，甲醇抑制癌细胞 DNA、RNA 合成及反突 变作用。吴万垠等［10］用 Cino 进行小鼠肝癌 HepA 抑制实验，以病理细胞图象分析仪 分析小鼠细胞 DNA 含量，结果其抑瘤率明显高于对照组(Cinobufagin)PHPLC＜0.01)，能显著降低小鼠肝癌 细胞的 DNA 光密度值、核面积、及 DNA 指数，同时能提高肝癌细胞中二倍体细胞的比例， 降低超五倍体细胞比例。 1.2Cino 对心血管、血压及呼吸的影响 Toma·S 等将地高辛和华蟾酥毒基间断给予大鼠静脉注射后比较华蟾酥毒基及其代谢 产物与地高辛在血清中的含量，发现地高辛会在血液中蓄积，而华蟾酥毒基及其代谢产物 则无此特性［11］。用同位素示踪技术，显示华蟾酥对正常钙离子浓度下心肌无调节作用， 但能够促进低 Ca2+溶液中心肌 Ca2+内流［12］。Cino 有着显著的呼吸兴奋作用，可 引起多种麻醉动物呼吸兴奋。王隶书等采用将华蟾酥精制成华蟾毒精气雾剂，临床观察表 明，药物用量少，很快引起动物呼吸加速。 1.3Cino 的麻醉止痛作用 Cino 的局麻作用约为蟾毒灵的 1/6 左右，较可卡因大 5C18～10 倍左右。0.1％～0.5C18% 的华蟾酥毒基溶液局部应用能引起舌头麻木，其局麻作用点可能为感觉神经末梢感受器， 对神经纤维作用很弱，其不饱和内脂环的存在和 C3 位的羟基对其发挥局麻作用是必要的 ［13］。 1.4 抗辐射作用