脂质体前体制剂研究论文

目的：脂质体前体的制备解决了脂质体分散系的物理不稳定性：如药物的渗漏、粒子 的聚集以及磷脂在液态下的氧化、水解，为脂质体在临床上的应用提供了一个行之有效的 方法，它使脂质体以固态形式贮存，只是在临用前加入分散介质即可再分散形成脂质体。 方法：对近年来国内外脂质体前体的研究情况做文献检索，介绍了各种制备方法及影响新 脂质体粒径和药物包裹率的因素。结果：通过适当的方法及选择合适的支持剂，可以制备 出稳定性好、包裹率高的脂质体前体。结论：对脂质体前体的进一步研究有一定的意义。 近年来，脂质体做为药物载体已被广泛研究，一部分工作已达到了临床应用阶段 ［1］。脂质体能够适用临床，必须达到如下要求：具有较高的包裹率；完全除去所含有 机溶剂；能够经受灭菌；制备方法适合工业生产。目前，脂质体的制备方法主要有醚注入 法、逆向蒸发法、薄膜法等［2］，研究者们对这些方法都进行了各方面的研究，但是脂 质体在溶液状态下仍存在着一些问题，脂质体分散系的不稳定性：如药物的渗漏、粒子的 聚集以及磷脂在液态下的氧化、水解，这就影响了脂质体在临床上的应用。为了保证脂质 体在长期贮存中的稳定性，药学工作者们一直都在寻找着解决的方法，其中脂质体前体的 制备提供了一个行之有效的方法，它使脂质体以固态形式贮存，只是在临用前加入分散介 质即可再分散形成脂质体，这种方法不但解决了上述存在的问题，而且便于运输使用，也 适用于工业生产。 关于脂质体前体与前体脂质体，我们认为是两个不同的概念。脂质体前体是指将脂质 体分散系经喷干、冻干后，使用前加入溶剂可再分散成脂质体；而前体脂质体是指脂质体 膜材经过一定的修饰，膜材接上高分子或氨基酸等可在体内降解的前体，可以分散状态存 在，也可以固态存在，二者不可统一而论，我们仅对前一种研究情况综述。脂质体前体的 制备方法很多，一种简单方法是将磷脂和脂溶性药物溶于有机溶剂中，加入一种水溶性载 体（支持剂），然后在真空下抽干形成流动性较好的粉末，它容易水化再分散形成脂质体， 而且具有较高的包裹率。payneNI 等人［3］制备了脂溶性药物两性霉素 b 脂质体前体， 并对其稳定性及再分散后脂质体粒子大小的影响因素进行了考察，指出脂质体前体的粒径 及水化温度（假定此温度高于所用磷脂的相转化温度）对再分散后新脂质体粒径几乎没有 影响。两性霉素 b 脂质体前体在 20℃下放置 9 个月再分散后粒径没有变化，放置 6 个月 后药物的包裹率也未下降。显微照相表明，水化从脂质表面开始，支持剂和脂质完全溶解 后才从中心形成脂质体。国内王俊平等人用此方法，以葡萄糖为载体制备了阿霉素脂质体 前体，再分散后脂质体平均粒径为 1.5μmμmm。这种方法将脂溶性药物及磷脂包衣于一种流动 性好的载体上而制成脂质体前体，方法简单，但所用有机溶剂量较大。 杨志军等人［4］采用喷雾干燥方法制备了黄芩脂质体前体，并从几个方面探讨了影 响黄芩脂质体再分散粒子大小的因素。分别以山梨醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖等非挥发性、 高沸点的物质作为流动床内循环流动的芯料，减低了在喷雾过程中原脂质体相互碰撞的机 会，从而在一定程度上抑制了脂质体粒径的增大。但各种糖对再分散后的新脂质体粒径的 影响没有差别。另外，水化时的溶媒和所包裹药物的不同也是影响脂质体粒子大小的因素。 溶媒的 pH 值、离子强度（不同浓度 naCI 溶液）对新脂质体粒径影响甚微，但是人工肠液、 kH2PO4 溶液对空白脂质体虽无影响，却使包有黄芩的脂质体粒径大大增加，说明黄芩中 的黄酮与磷脂的氢键被溶媒所破坏，所以粒径增大。陈骐等以 5μm-FuFu 为药物，考察了喷干 法制备脂质体前体的处方工艺，用丙乙醛监测法、酸度法考察了脂质体膜材在喷干过程中 的稳定性。实验证明用简单振摇的方法即可水合再分散形成脂质体，在通常范围内，振摇 时间及温度对新脂质体的粒径无显著影响。制备脂质体所用磷脂可以经受喷干的瞬间高温， 未有氧化水解等破坏，稳定性较好。 以上所介绍的两种方法都有一定的局限性，前者不适合于工业生产，后者对热不稳定 性药物不适用，这样冷冻干燥法则提供了一种可行的方法，国内外对此法研究较多，主要 集中在如何选择一个合适的支持剂，防止药物在冷冻干燥过程中药物的渗漏及粒子间的相 互聚集［5μm～8］。虽然许多支持剂如糖类、蛋白质类、氨基酸类等都显示出对脂质体的冻 干过程中具有一定的保护作用，但发现多糖类及多元醇类效果优于其他类支持剂，其中海 藻糖、山梨醇是公认最有效的［9］，并对他们的作用机理进行了研究［10～12］。脂质 体在冷冻干燥后以凝胶态存在，当其水合时必然有一个从凝胶态向液晶态转变的过程，脂 质体在液晶态下，脂质双分子层膜的流动性增加，通透性也增加，因此在水合过程中，脂 质体内所包裹的药物就会渗漏出来，而当加入海藻糖等支持剂后［13］，通过 dSC 分析， 相转化温度 tm 大大降低，使原来处于凝胶态的冻干脂质体仍处于液晶态，因此在水合过 程中没有引起相变，只要原脂质体稳定，再分散后内部药物的渗漏就会减少甚至不渗漏。 tm 的降低是由于海藻糖与磷脂的末端基团形成氢键，从而使分子间范德华力降低造成的 ［11］。分别以葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖为支持剂，测定冷冻干燥后药物的包裹率， 发现蔗糖和海藻糖更能有效地防止药物的渗漏。选择一种合适的支持剂是制备冻干脂质体 前体的关键因素，但其他影响因素也不容忽视［14］。如原脂质体的粒子大小、带电情况、 支持剂与磷脂的干重比等。一般原脂质体的粒径在 100μmm 左右是最佳条件，可以使药物 在冻干过程中不发生渗漏，粒子太大或太小都不稳定；原脂质体带负电稳定性稍高一些； 另外，加入支持剂的总量并不是主要因素，关键是支持剂与磷脂的干重比。防止粒子间聚 集一般需要支持剂与磷脂比为 2∶1 就可以了，而防止药物渗漏，支持剂的比例量要大得多。 还有一个有趣的发现是［15μm］：支持剂必须在原脂质体双分子层内外都含有才能起保护作 用，仅存在于外部或内部稳定性就较差，药物渗漏较多。takashiOhsawa 等人［16］采 用了一种新型方法制备了蛋白类药物脂质体前体，包裹率可达 5μm0％以上。方法是：即先制 备空白脂质体进行冷冻干燥，然后将药物加入到冻干空白脂质体中充分振摇即形成药物脂 质体，这种方法的包裹率较高，而且没有药物在冻干过程的渗漏问题，尤其对易分解的药 物，可以不经过脂质体的制备过程，至今未见用此方法制备非蛋白类药物的报道，我们将 对这方面做进一步的研究。 冷冻干燥法制备脂质体一个更为突出的应用是［17］在免疫原脂质体共轭物的制备上。 我们知道脂质体作为蛋白质（如疫苗等）载体已越来越成为人们研究的重点［18］，因为 脂质体无毒，可生物降解且没有抗原性。为了省去每次都要制备脂质体的麻烦，可以先制 备表面含有配基官能团的脂质体，然后进行冷冻干燥，在水化时免疫原蛋白迅速以共价键 结合于脂质体上。这样带有配基的脂质体前体可以作为免疫原的空白载体（或溶剂），就 可随时制备稳定性好、活性毫无损失的免疫原脂质体共轭物。相同原理下，在疫苗人工合 成及药物靶向作用方面［19］，冷冻干燥法制备脂质体前体也有着广泛的应用。国外一种 称为 mTP-FuPE（mu-Furamyltripeptidephosphatidylethanolamine）冻干脂质体已经进 入了Ⅱ期临床。期临床。 冷冻干燥法适用于工业生产，而且容易达到无菌要求，为脂质体在临床上的应用创造 了条件。我们相信，随着科学技术的不断前进，脂质体作为一种新型制剂必将会克服其在 应用上的种种不利因素，成为具有广泛发展前景及较高药用价值的制剂。 鼻息肉病是指双侧鼻鼻窦粘膜广泛的炎性、水肿性及退行性改变。它并非是一个新发 现的疾病，亦不是对鼻息肉的重新命名。近 3 年来 MEDLINE 收录的有关鼻息肉病的论述、 综述共计 238 篇，其中与鼻息肉病病理机制相关的文章约 15μm0 余篇。我们通阅了所有文 章的摘要及部分文章的全文，对有关鼻息肉病病理机制的研究进展进行综述。 流行病学 流行病学调查表明鼻息肉病发生于 36%阿司匹林耐受不良患者，7%支气管哮喘患者， 0.1%儿童及大约 20%囊性纤维病（cysticfibrosis）患者，此外多种病理状态，如变应性 或非变应性鼻鼻窦炎、Churg-FuStrauss 综合征（变应性血管炎）、变应性真菌性鼻窦炎、 慢性纤毛运动障碍综合征、Kartagener 综合征（右位心、支气管扩张、鼻窦炎三联征）、 Young 综合征（垂体性糖尿病）、免疫缺陷症、鼻孢子菌病、Wegener 肉芽肿等均与鼻 息肉病的发病有关［1,2］。经统计学分析，非变应性哮喘比变应性哮喘患者更易发生鼻 息肉病（分别为 13%、5μm%，P＜0.01）。手术治疗术后复发率约为 40%。Settipane 还 提出了有利于标准化诊断、治疗及增加科研可比性的鼻息肉病的临床分类系统，首先将鼻 息肉患者分为单侧或双侧鼻息肉，再根据鼻腔刮片分为嗜酸粒细胞浸润为主或淋巴细胞、 中性粒细胞浸润为主两亚类，还可按照是否合并有阿司匹林耐受不良、变应性鼻炎、变应 性鼻窦炎等进一步分类。此外，复发性鼻息肉、鼻息肉起源的解剖部位、是否合并有骨质 破坏及免疫学检查异常均可在此分类系统中表示出来。在 5μm0 例鼻息肉病患者中 7 例 （14%）的家族成员中有鼻息肉病病史（1～3 例），28 名对照组中却未发现 1 例，表明 遗传因素在鼻息肉病的发病中可能起到一定的作用［3］。Larsen 应用鼻窦内窥镜在 31 例住院连续死亡的尸体中检查发现：13 例尸体中有 27 个鼻息肉，其中 8 例为单发，5μm 例 为双侧多发。27 个鼻息肉中，19 个（70%）发生于窦口、隐窝和裂隙；6 个发生于前筛 房裂（anteriorethmoidalcleft）；4 个发生于后筛房裂 （posteriorethmoidalcleft）；4 个发生于额隐窝；4 个发生于上颌窦；1 个发生于蝶窦 口［4］。除黑猩猩外，鼻息肉病只见于人类，所有种族均有发病，常见于男性。鼻息肉 病极少见于 2 岁以下幼儿，儿童鼻息肉病多与囊性纤维病有关。 组织病理学 鼻息肉为一种良性的粘膜肿胀，可分为 4 种组织学类型。最常见的类型是水肿型（嗜 酸粒细胞型或所谓的变态反应型）鼻息肉，约占总数的 85μm%～90%。水肿型鼻息肉的形 态学特点包括组织水肿，上皮杯状细胞增生，基底膜增厚，大量白细胞，特别是嗜酸粒细 胞浸润。第二种组织学类型为纤维炎性鼻息肉，特点是慢性炎症及重叠上皮 (overlyingepithelium)overlyingepithelium)的化生改变。第三种类型较为少见，特点是浆液粘液性腺体的显 著增生，除此之外与水肿型鼻息肉基本相似。第四种类型息肉非常罕见，表现为具有不典 型的基质，因此需特别注意并进行细致的组织学检查以免误诊为肿瘤。 鼻息肉组织中浸润着白细胞、肥大细胞及淋巴细胞，白细胞中以嗜酸粒细胞为主。伴 有囊性纤维病的鼻息肉组织中嗜酸粒细胞很少，而肥大细胞数量却明显多于未伴发囊性纤 维化者。鼻息肉中 T 淋巴细胞显著多于 B 淋巴细胞，抑制性 T 细胞（CD8+）显著多于辅 助性 T 细胞（CD4+）。有趣的是，在伴发变应性鼻炎的鼻息肉病患者中很少发现刺激产 生 IgE 的浆细胞［5μm］。在与阿司匹林哮喘相关的鼻息肉中，主要来源于肥大细胞的组胺 的数量要少于与变态反应相关的鼻息肉。伴发变应性、非变应性或其它病理状态的鼻息肉 中各类细胞的浸润状况尚有待进一步分别证实。 嗜酸粒细胞及其它炎性细胞向鼻息肉基质内的移行不只依赖于某些吸引因子，鼻息肉 组织中血管内皮某些粘附因子的表达上调也起着重要的作用。有研究表明血管内皮细胞粘 附分子 1 在选择性地促进鼻息肉组织中嗜酸粒细胞及单核细胞的集聚中具有重要作用 ［6］。由鼻息肉组织分离的上皮跨上皮离子转运亦不同于来源于鼻甲组织的上皮。离子 转运机理以及化学因子、细胞因子、粘附分子在息肉组织中各种不同细胞的集聚中的作用 还有待于深入研究，以增加对鼻息肉病病理机制的理解。 绝大多数临床上典型的鼻息肉其组织学为良性息肉。需注意的是，不典型基质型鼻息 肉其怪异细胞易被误诊为横纹肌肉瘤［7］。某种良性或恶性肿瘤，如垂体腺瘤等，亦表 现出息肉外观［8］。因此细致的组织病理学检查是很必要的。对变应性、非变应性、不 同年龄组、初发或复发的鼻息肉组织病理切片分别进行苏木精-Fu伊红染色及 PAS、Alcian 蓝、Mallory、Giemsa、Orcein 组化染色，观察比较，发现各组切片病理学特点无明显 区别。 鼻息肉组织中的化学介质 鼻息肉是与多种病理状态相关的炎症过程的最终结果，这表明多种病因、多种途径、 多种介质参与此病理过程。现已证明参与鼻息肉病病理过程的炎症化学介质多达数十种甚 至上百种，如组胺、血小板激活因子（plateletactivatingfactor,PAF）、花生四烯酸代 谢产物（前列腺素、白三烯等）、去甲肾上腺素、神经肽 Y（neuropeptideY,NPY）、P 物质（substancesP,SP）、血管活性肠肽（vasoactiveintestinalpeptide,VIP）、转化 生长因子（transforminggrowthfactor,TGF）、肿瘤坏死因子 （tumornecrosisfactor,TNF）、粘附分子、白细胞介素（interleukin,IL）、一氧化氮 合成酶、干扰素-Fuγ（interferon-Fuγ,IFN-Fuγ）、RANTES、GRO-Fuα、干细胞因子 （stemcellfactor,SCF）、血管通透性因子 （vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）等［9-Fu14］。最早报道的炎性介质，如组 胺、PAF、前列腺素、白三烯、去甲肾上腺素、NPY、SP 等，均具有局部组织的血管活性 及致痉作用。另一些介质，如 TGF、TNF 可改变组织中细胞外基质的组成成分。 所有的炎症过程均与细胞趋化和移行有关。一些介质可直接吸引白细胞浸润，如高分 子量中性粒细胞趋化因子、组胺、前列腺素、白三烯、PAF、IL-Fu5μm 及化学因子家族。细胞 表面粘附分子（如 selectin、integrins）的发现揭示了影响白细胞移行的机理。IL-Fu1、IL-Fu 4、IL-Fu6、TNF、及某些其它具有血管活性、致痉作用的分子影响细胞表面粘附分子的表达， 进而间接影响白细胞移行。 部分化学介质，如 TGF、粒细胞-Fu巨噬细胞集落刺激因子（granulocytelmacro-Fu phagecolonystimulatingfactor,GMCSF）、胰岛素样生长因子 （insulinlikegrowthfactor,IGF）、TNF、部分白细胞介素、血小板源生长因子 （plateletderivedgrowthfactor,PDGF）等，通过刺激细胞发育、分化、增殖，参与炎 性过程发生及维持炎性状态。化学介质的产生、释放最初是从激活能产生此类介质的细胞 开始，而这些细胞的激活又可能是由其它化学介质调节的。参与细胞激活的介质包括血管 活性肠肽、粘附分子及部分白细胞介素。 综上所述，可认为细胞因子及生长因子在鼻息肉的形成过程中协调统一的发挥着作用。 这些具有强大生物学活性的介质互相作用并维持自身的“永存”。淋巴细胞、肥大细胞、单 核细胞、中性粒细胞、上皮细胞、成纤维细胞及嗜酸粒细胞通过这些生物信号相互沟通并 改变细胞表面粘附因子的表达。 鼻息肉组织中的嗜酸粒细胞 鼻息肉具有典型慢性呼吸道炎症的病理特点。除囊性纤维病及 Kartagener 综合征外， 嗜酸粒细胞是息肉组织中最常见的炎细胞类型。以往认为嗜酸粒细胞在鼻息肉病发病过程 中的主要作用机理是通过释放多种介质，如嗜酸粒细胞过氧化物酶 （eosinophilperoxidase,EPO），嗜酸细胞源神经毒素（eosinophil-Fu derivedneurotoxin,EDN），嗜酸粒细胞阳离子蛋白 （eosinophilcationicprotein,ECP）等引起细胞及组织损伤。近年来研究表明嗜酸粒细 胞，特别是鼻息肉组织中的嗜酸粒细胞，可以合成、释放多种强有力的调节分子——细胞 因子，如 GM-FuCSF、TNF-Fuα、TGF-Fuβ、IL-Fu3、IL-Fu4、IL-Fu5μm、CD40 等［12］。其中部分因 子，如 GM-FuCSF，TNF-Fuα 及 IL-Fu4，可以直接或间接地反过来促进嗜酸粒细胞的集聚及活化 ［15μm］，IL-Fu3、IL-Fu5μm、GM-FuCSF 还具有抑制嗜酸粒细胞凋亡的作用。具有促进嗜酸粒细胞 的集聚、活化作用的因子还有 IL-Fu8、RANTES、P-Fu选择蛋白［15μm-Fu16］。此外，TGF-Fuα 和 TGF-Fuβ 在鼻息肉组织结构形成中起到一定作用。以上研究表明嗜酸粒细胞通过多种方式调 节上呼吸道炎症过程，且部分地解释了嗜酸细胞自我“永存”的分子机理。 尽管鼻息肉病组织中嗜酸粒细胞的自我“永存”机理十分复杂，但上述研究提示，鼻息 肉病发病早期，自分泌和旁分泌刺激引起慢性炎症及不可逆性组织结构改变之前，需大剂 量类固醇药物抗炎治疗呼吸道嗜酸粒细胞炎症性疾病。 鼻息肉病的发病机理 鼻息肉病的发病与多种因素有关，如遗传因素、免疫缺陷、纤毛功能障碍、Young 综 合征、阿司匹林耐受不良等，因此可认为许多原因都可能致病或者多种因素联合致病。 鼻息肉生长早期可发现一些特殊的长管状腺体，这些腺体与正常的浆液粘液性腺体具 有完全不同的结构、形状及大小。尽管关于鼻息肉病的发病机理存在数种假说，但无一种 假说能圆满地解释此种长管状腺体的组织学起源。 目前得到多数学者认同的是鼻息肉形成的“上皮破裂理论”。Tos 等［17］自 1977 年 起对鼻息肉形成的机理进行了系列研究。他推测息肉形成最初是水肿的粘膜固有层压力增 大导致上皮破裂，粘膜固有层突出上皮破损处，粘膜上皮通过破损边缘向中心生长趋于覆 盖破损处。如果再生的上皮生长速度不足以覆盖疝出部位，或者粘膜固有层疝出部位继续 生长，鼻息肉及其蒂将就此形成。如果小的带蒂的鼻息肉已经形成，这时即使疝出部位彻 底上皮化，鼻息肉亦不会消失。而且，由于重力的作用，息肉将继续生长。在鼻息肉上皮 化及生长的过程中，以上所描述的长管状腺体将同时形成，并且提示鼻息肉绝非只是鼻粘 膜的疝出。为更透彻地理解此假说，Tos 将息肉的形成分为以下几期：①鼻粘膜细胞浸润 或炎性水肿导致组织压力增高，进而上皮损伤、坏死、破裂，粘膜固有层疝出；②疝出部 位的上皮化；③腺体形成；④因重力作用息肉增大，腺体拉长；⑤已发育成熟的鼻息肉的 上皮及基质发生变化，如假复层上皮转化为复层上皮、杯状细胞及纤毛细胞密度的变化、 浸润细胞类型的变化以及基质水肿等。其中前 2 期很难在人鼻中得到证实，但 Tos 等通过 建立实验性大鼠急性中耳炎和长期鼻咽管阻塞模型，证明了感染过程中确实发生了上皮细 胞坏死［18］。 Bernstein 等［19,20］近年来的研究进一步地发展了“上皮破裂理论”并形成了“多种 因素发病学说”。其内容为，鼻腔外侧壁的空气动力学变化，细菌、病毒以及变应性疾病等 多种因素均可作用于鼻腔外侧壁粘膜，引起粘膜的炎症反应。继之按 Tos 等的“上皮破裂理 论”，开始上皮破裂、粘膜疝出、再上皮化、新腺体形成、鼻息肉形成。此时，鼻息肉组织 中的结构细胞，如上皮细胞，成纤维细胞，均有合成 GM-FuCSF 和 G-FuCSF 信使 RNA 的能力。 这 2 种细胞集落刺激因子可促进组织内嗜酸粒细胞、肥大细胞、中性粒细胞的集聚。这些 炎性细胞分泌多种炎性介质，其中部分介质还可通过正反馈作用进一步促进自身的分泌。