蛋白质质谱分析论文

摘要：随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要综述 了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点、方法及蛋白质质谱分析的原理、方式和应用， 并对其发展前景作出展望。 关键词：蛋白质，质谱分析，应用 前言： 蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占 细胞干质量的 50%以上，作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行、 调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此蛋白质 也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家 极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立 体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断 成熟，使这一领域的研究发展迅速。 自约翰.芬恩(JohnB.Fenn)JohnB.Fenn)和田中耕一(JohnB.Fenn)Koichi.Tanaka)发明了对生物大分子进行确认 和结构分析的方法及发明了对生物大分子的质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的 迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一[1]。 它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施。质谱 法已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一，在对蛋白质结构分析的 研究中占据了重要地位[2]。 1．质谱分析的特点 质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：很高的灵敏度能为亚微克 级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定， 同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。 2．质谱分析的方法 近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种：1)电 喷雾电离质谱；2)基质辅助激光解吸电离质谱；3)快原子轰击质谱；4)离子喷雾电离质谱； 5)大气压电离质谱。在这些软电离技术中，以前面三种近年来研究得最多，应用得也最广 泛[3]。 3．蛋白质的质谱分析 蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，复杂结构主要包括以肽链为 基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级，三级或四 级]结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键 数目和位置。 3.1 蛋白质的质谱分析原理 以往质谱(JohnB.Fenn)ＭＳ)仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如介质 辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。 其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场 将具有特定质量与电荷比值(JohnB.Fenn)Ｍ/Ｚ值值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的 离子，确定离子的Ｍ/Ｚ值值，分析鉴定未知蛋白质。 3.2 蛋白质和肽的序列分析 现代研究结果发现越来越多的小肽同蛋白质一样具有生物功能，建立具有特殊、高效 的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。因此需要高效率、高灵敏度的肽和蛋白质序 列测定方法支持这些研究的进行。现有的肽和蛋白质测序方法包括Ｎ末端序列测定的化学末端序列测定的化学 方法 Edman 法、Ｃ末端酶解方法、Ｃ末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例末端酶解方法、Ｃ末端酶解方法、Ｃ末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例 如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的Ｎ末端序列测定的化学末端氨基酸苯异硫氰酸酯 (JohnB.Fenn)phenylisothiocyanate)PITC 分析法(JohnB.Fenn)即 Edman 法，又称 PTH 法)，测序速度较慢(JohnB.Fenn)50 个氨基酸残基/天)；样品用量较大(JohnB.Fenn)nmol 级或几十 pmol 级)；对样品纯度要求很高；对于 修饰氨基酸残基往往会错误识别，而对Ｎ末端序列测定的化学末端保护的肽链则无法测序[4]。Ｃ末端酶解方法、Ｃ末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例末端化学降解 测序法则由于无法找到 PITC 这样理想的化学探针，其发展仍面临着很大的困难。在这种 背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学 家的广泛注意。在质谱测序中，灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低，所以肽的序列 分析比蛋白容易许多，许多研究也都是以肽作为分析对象进行的。近年来随着电喷雾电离 质谱(JohnB.Fenn)electrosprayionisation，ESI)及基质辅助激光解吸质谱 (JohnB.Fenn)matrixassistedlaserdesorption/ionization，MALDI)等质谱软电离技术的发展与完善， 极性肽分子的分析成为可能，检测限下降到 fmol 级别，可测定分子量范围则高达 100000Da，目前基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法(JohnB.Fenn)MALDITOFMS)已成为测定 生物大分子尤其是蛋白质、多肽分子量和一级结构的有效工具，也是当今生命科学领域中 重大课题——蛋白质组研究所必不可缺的关键技术之一[5]。目前在欧洲分子生物实验室 (JohnB.Fenn)EMBL)及美国、瑞士等国的一些高校已建立了 MALDITOFMS 蛋白质一级结构(JohnB.Fenn)序列)谱库， 能为解析 FAST 谱图提供极大的帮助，并为确证分析结果提供可靠的依据[6]。3 蛋白质的 质谱分析方式 质谱用于肽和蛋白质的序列测定主要可以分为三种方法：一种方法叫蛋白图谱 (JohnB.Fenn)proteinmapping))，即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用 质谱检测各产物肽分子量，将所得到的肽谱数据输入数据库，搜索与之相对应的已知蛋白， 从而获取待测蛋白序列。将蛋白质绘制“肽图”是一重要测列方法。第二种方法是利用待测 分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应 的氨基酸残基，其中亚稳离子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用诱导碎裂.第三种方法与 Edman 法有相似之处，即用化学探针或酶解使蛋白或肽从Ｎ末端序列测定的化学端或Ｃ末端酶解方法、Ｃ末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例端逐一降解下氨基酸 残基，形成相互间差一个氨基酸残基的系列肽，名为梯状测序(JohnB.Fenn)laddersequencing))，经 质谱检测，由相邻峰的质量差知道相应氨基酸残基。 3.3.1 蛋白消化 蛋白的基团越大，质谱检测的准确率越低。因此，在质谱检测之前，须将蛋白消化成 小分子的多肽，以提高质谱检测的准确率。一般而言，6-20 个氨基酸的多肽最适合质谱仪 的检测。现今最常用的酶为胰蛋白酶(JohnB.Fenn)trypsin)，它于蛋白的赖氨酸(JohnB.Fenn)lysine)和精氨酸 (JohnB.Fenn)arg)inine)处将其切断。因此，同一蛋白经胰蛋白酶消化后，会产生相同的多肽。 3.3.2 基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法(JohnB.Fenn)MALDI-TOFMS)[7] 简而言之，基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量仪是将多肽成分转换成离子信号， 并依据质量/电荷之比(JohnB.Fenn)mass/charg)e，m/z)来对该多肽进行分析，以判断该多肽源自哪一 个蛋白。待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化学基质(JohnB.Fenn)matrix)混合，此样品混 合物随即滴于一平板或载玻片上进行挥发，样品混合物残余水份和溶剂的挥发使样品整合 于格状晶体中，样品然后置于激光离子发生器(JohnB.Fenn)lasersource)。激光作用于样品混合物， 使化学基质吸收光子而被激活。此激活产生的能量作用于多肽，使之由固态样品混合物变 成气态。由于多肽分子倾向于吸收单一光子，故多肽离子带单一电荷.这些形成的多肽离子 直接进入飞行时间质量分析仪(JohnB.Fenn)TOFmassanalyzer)。飞行时间质量分析仪用于测量多肽 离子由分析仪的一端飞抵另一端探测器所需要的时间。而此飞行时间同多肽离子的质量/电 荷的比值成反比，即质量/电荷之比越高，飞行时间越短。最后，由电脑软件将探测器录得 的多肽质量/电荷比值同数据库中不同蛋白经蛋白酶消化后所形成的特定多肽的质量/电荷 比值进行比较，以鉴定该多肽源自何种蛋白.此法称为多肽质量指纹分析 (JohnB.Fenn)peptidemassfin-g)erprinting))。基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法操作简便， 敏感度高，同许多蛋白分离方法相匹配，而且，现有数据库中有充足的关于多肽质量/电荷 比值的数据，因此成为许多实验室的首选蛋白质谱鉴定方法。 3.3.3 电子喷雾电离质谱测量法(JohnB.Fenn)electrosprayion-izationmassspectrometry,ESIMS)[8] 同基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法在固态下完成不同，电子喷雾电离质谱 测量法是在液态下完成，而且多肽离子带有多个电荷，由高效液相层析等方法分离的液体 多肽混合物，在高压下经过一细针孔。当样本由针孔射出时，喷射成雾状的细小液滴，这 些细小液滴包含多肽离子及水份等其他杂质成分。去除这些杂质成分后，多肽离子进入连 续质量分析仪(JohnB.Fenn)tan-demmassanalyzer)，连续质量分析仪选取某一特定质量/电荷比值的 多肽离子，并以碰撞解离的方式将多肽离子碎裂成不同电离或非电离片段。随后，依质量/ 电荷比值对电离片段进行分析并汇集成离子谱(JohnB.Fenn)ionspectrum)，通过数据库检索，由这些 离子谱得到该多肽的氨基酸序列。依据氨基酸序列进行的蛋白鉴定较依据多肽质量指纹进 行的蛋白鉴定更准确、可靠。而且，氨基酸序列信息即可通过蛋白氨基酸序列数据库检索， 也可通过核糖核酸数据库检索来进行蛋白鉴定。4．蛋白质质谱分析的应用 1981 年首先采用 FAB 双聚焦质谱测定肽分子量，分析十一肽(JohnB.Fenn)Ｍｒ=1318)，质谱中 出现准分子离子[Ｍ+1]+=1319 强峰。分子量小于 6kDa 肽或小蛋白质合适用 FAB 质谱 分析，更大分子量的多肽和蛋自质可用 MALDI 质谱或 ESI 质谱分析。用 MALDI-TOF 质谱 分析蛋自质最早一例是 HillenKramp 等[9]于 1988 年提出用紫外激光以烟酸为基质在Ｔ ＯＦ谱仪上测出质量数高达谱仪上测出质量数高达 60kDa 蛋白质，精确度开始只有 0.5%，后改进到 0.10.2%。质谱技术主要用于检测双向凝胶电泳或“双向”高效柱层析分离所得的蛋白质及酶解 所得的多肽的质量，也可用于蛋白质高级结构及蛋白质间相互作用等方面的研究[10,11], 三条肽段的精确质量数便可鉴定蛋白质。近年来，串联质谱分析仪发展迅猛，其数据采集 方面的自动化程度、检测的敏感性及效率都大大提高，大规模数据库和一些分析软件 (JohnB.Fenn)如:SEQUEST)SEQUEST)的应用使得串联质谱分析仪可以进行更大规模的测序工作。目前，利用 2D 电泳及ＭＳ技术对整个酵母细胞裂解产物进行分析，已经鉴定出 1484 种蛋白质，包括完 整的膜蛋白和低丰度的蛋白质[12]；分析肝细胞癌患者血清蛋白质组成分[13]，并利用质 谱进行鉴定磷酸化蛋白研究工作[14]及采用质谱技术研究许旺细胞源神经营养蛋白 (JohnB.Fenn)SDNP)的分子结构[15]等。 结束语： 在蛋白质的质谱分析中，质谱的准确性(JohnB.Fenn)accuracy)对测定结果有很大影响，因此质谱 测序现在仍很难被应用于未知蛋白的序列测定。肽和蛋白的质谱序列测定方法具有快速、 用量少、易操作等优点，这些都非常适合于现在科学研究的需要。我们相信，随着各种衍 生化方法和酶解方法的不断改进，蛋白双向电泳的应用[16]以及质谱技术的不断完善，质 谱将会成为多肽和蛋白质分析最有威力的工具之一。 Lerner(JohnB.Fenn)1960)［4］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生 黑色素(JohnB.Fenn)melanin)的细胞发亮，故取其字首 Mela；同时由于它从 5-羟色胺(JohnB.Fenn)serotonin)衍 生而来，故取其后缀 tonin，因此，这种松果体激素取名为 Melatonin(JohnB.Fenn)褪黑激素)。褪黑 激素在体内含量极小，以 pg)(JohnB.Fenn)1×10-12g))水平存在。近年来，国内外对褪黑激素的生物学 功能，尤其是作为膳食补充剂的保健功能进行了广泛的研究，表明其具有促进睡眠、调节 时差、抗衰老、调节免疫、抗肿瘤等多项生理功能。 1 褪黑激素的生物合成 褪黑激素的生物合成受光周期的制约。［5，6］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生松果体在光神经的控制下，由色氨酸 转化成 5-羟色氨酸，进一步转化成 5-羟色胺，在 N-乙酰基转移酶的作用下，再转化成 N乙酰基-5-羟色胺，最后合成褪黑激素，［7］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生从而使体内的含量呈昼夜性的节律改变。夜 间褪黑激素分泌量比白天多 5～10 倍，［8］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生清晨 2：00 到 3：00 达到峰值。 ［9］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生Hakola 等对夜班工人唾液中褪黑激素含量的研究结果，也证实了这种昼夜节律性变 化。［10］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生褪黑激素生物合成还与年龄有很大关系，它可由胎盘进入胎儿体内，也可经哺 乳授予新生儿。因此，在刚出生的婴儿体内也能检出很少量的褪黑激素，直到三月龄时分 泌量才增加，并呈现较明显的昼夜节律现象，3～5 岁幼儿的夜间褪黑激素分泌量最高，青 春期分泌量略有下降，以后随着年龄增大而逐渐下降，到青春期末反而低于幼儿期，到老 年时昼夜节律渐趋平缓甚至消失。［11］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生 2 褪黑激素对睡眠的影响 Holmes 研究了褪黑激素的催眠作用和对神经化学的影响，大鼠给予 10mg)/kg)BW 褪 黑激素后，用 EEG 检测入睡时间，与服药前相比，缩短一半，觉醒时间也明显缩短，慢波 睡眠、异相睡眠明显延长而且容易唤醒；给予 2.5mg)/kg)BW，得到程度略低的、类似的 催眠效果。任何剂量的褪黑激素都不会改变标准 EEC 模型和干扰正常的睡眠规律。［3］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生 腹膜给予小鼠褪黑激素 25mg)/kg)BW 的催眠作用与 100mg)/kg)BW(JohnB.Fenn)腹膜)环己烯巴比妥 (JohnB.Fenn)催眠药)的作用相似。［12］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生Dollins 等(JohnB.Fenn)1994)［13］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生用低剂量褪黑激素对 20 名年青健 康志愿者进行催眠效果的研究，志愿者在上午 11：45 口服 0.1～10mg) 褪黑激素后，其 血清浓度达到正常人夜晚平均浓度水平；0.1、0.3、1.0 和 10.0 等各剂量组均使受试者 口腔温度下降、入睡时间明显缩短、睡眠持续时间明显延长、精力下降、疲劳感增加、情 绪低下、对 Wilkinson 听觉觉醒试验反应正确率下降。Waldhauser 等(JohnB.Fenn)1990)［14］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生也 对 20 名年轻健康志愿者进行口服 80mg) 褪黑激素催眠效果的研究。观察到服药 1h 后血 清药物浓度达到峰值(JohnB.Fenn)平均为 25817pg)/mL)，显著高于正常人血清浓度，睡前醒觉时间、 入睡时间缩短，睡眠质量改善，睡眠中觉醒次数明显减少，而且睡眠结构调整，浅睡阶段 缩短，深睡阶段延长，次日早晨唤醒阈值下降。Irina 等(JohnB.Fenn)1995)［15］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生在 18、20、21 时 给予志愿者口服 0.3mg) 和 1.0mg) 褪黑激素，能使入睡和进入睡眠第二阶段时间缩短，但 未影响 REM(JohnB.Fenn)Rapideyemovements，快速眼动)期，表明褪黑激素有助于改善失眠症。 因此，褪黑激素作为一种新型催眠药物，其独特的优点为： (JohnB.Fenn)1)小剂量(JohnB.Fenn)0.1～0.3mg))就有较为理想的催眠效果；［15］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生 (JohnB.Fenn)2)是一种内源性物质，通过对内分泌系统的调节而起作用，对机体来说并非异物，在 体内有其自身的代谢途径，不会造成药物及其代谢物在体内蓄积； (JohnB.Fenn)3)生物半衰期短，口服几小时后即降至正常人的生理水平； (JohnB.Fenn)4)毒性极小。 此外，褪黑激素还有较强的调节时差功能。［16］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生 3 褪黑激素的抗衰老作用 机体内酶促反应和非酶促反应时可能产生自由基，自由基与衰老有着密切的联系。正 常机体内自由基的产生与消除处于动态平衡，一旦这种平衡被打破，自由基便会引起生物 大分子如脂质、蛋白质、核酸的损伤，导致细胞结构的破坏和机体的衰老。［17］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生褪黑激 素通过清除自由基，抗氧化和抑制脂质的过氧化反应保护细胞结构、防止 DNA 损伤、降 低体内过氧化物的含量。Russel 等人的研究发现，褪黑激素对黄樟素(JohnB.Fenn)一种通过释放自由 基而损伤 DNA 的致癌物)引起 DNA 损伤的保护作用可达到 99%，且呈剂量—反应关系。 ［18］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生褪黑激素对外源性毒物(JohnB.Fenn)如百草枯)引起的过氧化以及产生的自由基所造成的组织损 伤有明显的拮抗作用。［19］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生褪黑激素还能降低脑中 LPO 的含量，其作用在脑的不同区 域如大脑皮层、小脑、海马、下丘脑、纹状体等处，基本上是相同的，且均呈剂量依赖关 系。但不同品系大鼠如 Sprag)ue-Dawlay 和 Wistar 大鼠对褪黑激素的敏感性不同。 ［17］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生 4 褪黑激素的调节免疫作用 Maestron 发现，［20］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生功能性或药物性抑制褪黑激素的生物合成，均可导致小鼠体 液和细胞免疫效应受抑。褪黑激素能拮抗由精神因素(JohnB.Fenn)急性焦虑)所诱发的小鼠应激性免疫 抑制效应，以及防止由感染因素(JohnB.Fenn)亚致死剂量脑心肌病毒)诱致急性应激而产生的瘫痪和死 亡。［20］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生晏建军等［21］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生研究了褪黑激素对 H22 肝癌小鼠免疫的调节作用，发现能提 高荷瘤小鼠 CD4+CD8+值，协同 IL-2 提高外周血淋巴细胞及嗜酸性粒细胞数量，增强脾 细胞 NK 和 LAK 活性，促进 IL-2 的诱生；还研究了褪黑激素对 H22 肝癌小鼠巨噬细胞功 能的调节作用，［22］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生发现注射后巨噬细胞的杀伤活性及 IL-1 的诱生水平均明显提高，表 明对巨噬细胞的功能有选择性调节作用。Kethleen 等(JohnB.Fenn)1994)［23］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生研究发现，褪黑激素 具有活化人体单核细胞，诱导其细胞毒性及 IL-1 分泌的功能。 5 褪黑激素的抗肿瘤作用 Vijayalaxmi 等(JohnB.Fenn)1995)［24］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生体外研究发现，褪黑激素对 137Cs 的 γ 射线 (JohnB.Fenn)150cGy)所造成的人体外周淋巴细胞染色体损伤有明显的保护作用，且呈剂量—效应关 系；对自由基产生的物理和化学致突变性和致癌性有拮抗作用。体外试验表明，褪黑激素 对自力霉素 C 引起的致突变性也有保护作用。［25］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生褪黑激素能降低化学致癌物(JohnB.Fenn)黄樟素) 诱发的 DNA 加成物的形成，防止 DNA 损伤。［26］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生晏建军等研究了褪黑激素对 H22 肝 癌小鼠的抗肿瘤作用，发现能抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长，延长其存活时间，与 IL-2 存在明 显的协同性。［21］首次在松果体中分离出一种激素，由于这种激素能够使一种产生Danforth 等分别测定了正常、乳腺癌和乳腺癌易患者 3 组妇女的 24h 血浆褪黑激素水平，结果正常妇女有昼夜节律；乳腺癌患者的白昼节律与原发瘤的甾 体受体量明显相关。在雌激素(JohnB.Fenn)ER)或黄体酮(JohnB.Fenn)PR)受体阳性者昼至夜血浆褪黑激素均值显著 低于 ER 或 PR 阴性肿瘤病人，并与原发瘤中 ER 或 PR 受体量呈明显负相关，表明褪黑激