胰岛素非注射给药研究论文

胰岛素（INS）是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病（是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病（IDDM）是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病（的主要药物，属多肽类药物， 分子量大，半衰期短，脂溶性差，不易透过生物膜，长期以来一直以注射给药为主，不仅 用药不便而且会出现注射部位炎症，硬结等副作用及耐药性，为此，国内外学者一直致力 于 INS 非注射给药剂型的开发与研制，如口服、鼻腔、肺部、直肠、透皮制剂等，并已在 这些方面作出了一些成绩。现就近年来的有关研究动态做一简要综述。 1 口服给药 游离的 INS 口服无效是由于① INS 易被胃肠道中的酶水解失活，② INS 分子量大超过 6000，很难透过胃肠道上皮细胞，③肝脏首过效应。因此需要对 INS 加以保护及促进吸 收才能使口服成为可能。目前常用的技术手段和剂型如下。 1.1 制成微囊、毫微囊或纳米颗粒 Damage[1]等报道分别给予大鼠口服 12.5 和 50IUkg-1INS 微囊，可分别降低血糖 水平至 50-60%，达 6d 和 20d。对糖尿病模型大鼠及糖尿病狗依次不同剂量一次口服氰 基丙烯酸酯包裹的 INS 微囊，可维持 1-3 周的降糖效果，INS 可在小肠各部位吸收，其吸 收大小顺序为：回肠>空肠>十二指肠>结肠[2]。杨彩哲等[3]也报道给糖尿病大鼠一次口 服 120IUkg-1 的氰基丙烯酸酯毫微囊乳液，给药后第 1d 血糖下降，第 2d 降至正常，维 持正常血糖 3d，降糖幅度达 90%。 张强等[4]用氰基丙烯酸烷基酯包裹 INS，制成 INS 毫微球，比较了 INS 溶液皮下给药 和 INS 毫微球口服的降糖效果，结果表明 INS 毫微球口服后降血糖速度低于皮下给药，但 作用持续时间较长，血糖水平相对较为稳定，相对生物利用度为 7.58%。之后[5]又改进 了配方，比较两种 INS 毫微球的降糖作用，其生物利用度分别为 27.86%和 28.56%。毫 微球增加 INS 吸收的机制已明确的有两点：一是小于 500nm 的 NP 可以在肠道的派尔淋 巴集结（Peyer''''spatches）是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病（中累积，并以完整的结构通过淋巴结集中的 M 细胞，将药 物释放到循环中去[6]，其次是由于 INS 分子结合于毫微球，INS 受到 NP 的保护，与蛋白 水解酶的接触机会大大下降，从而增加了吸收的机会[7]。 段明显等[8]证明大部分 INS 分子（80%）是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病（是通过共价结合方式与形成的 NP 紧密相连， 处于包裹颗粒的表面，对蛋白水解酶的降解有一定抵抗作用，且证明了包裹颗粒被消化道 直接吸收的可能性。 1.2 制成脂质体 修志龙等[9]将 INS 包封脂质体内，体外实验证实 INS 与脂质体结合或混合后均能抗 胃蛋白酶、胰蛋白酶和 α-麋蛋白酶，小鼠口服用卵磷脂或磷脂酰肌醇包制的直径为 20100nm 的 INS 脂质体后呈现的生物有效性约为皮下注射的一半。实验表明卵磷脂-胆固醇 （7：2）是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病（配比包封 INS 降糖效果较好。 1.3 制成乳剂、微乳 Cortes 公司开发了 INS 微乳制剂，其水相中含 INS 及蛋白酶抑制剂，油相中含胆固 醇，磷脂和游离脂肪酸，口服后药物可被肠上皮细胞吸收，按 1IUkg-1 剂量给 3 例患者服 用，血糖均明显下降[10]。吴琼珠等[11]将 INS 制成复乳，给小鼠灌胃进行降糖实验研究， 在 3 组糖尿病小鼠中，第 1、2 组分别给予 70IUkg-1 的复乳和 INS 水溶液，第 3 组皮下 注射 2.5IUkg-1 的 INS 生理盐水溶液，结果发现第 1、2 组在给药后 40min 内血糖差异显 著，且复乳组与注射组疗效相当。孔艳等[12]将 50UINS 与 200mg 甘氨胆酸 （SGC）是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病（、300mg 脂肪酸制成去溶剂化乳剂，给家兔口服结果显示 SGC 与硬脂酸对 INS 的吸收有明显的协同作用，且棕榈酸的协同作用大于硬脂酸和脂肪酸。 1.4 结肠定向给药 Saffran 等[13]选用能被结肠微生物降解的偶氮化合物对胰岛素微丸进行包衣，并加 入水杨酸类做吸收促进剂，结果发现，微丸口服后可有效避免胃及小肠的酶破坏，顺利进 入结肠上部，衣层降解药物释放吸收，并产生明显的降糖作用。 1．5 增加口服 INS 制剂吸收的措施 可通过包肠溶衣（EudragitL-100）是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病（,加蛋白酶抑制剂[14]（如胆酸钠）是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病（和黏膜促吸收 剂（10%的水杨酸盐）是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病（[12]，提高生物利用度。2 鼻腔给药 鼻黏膜内血管丰富，黏膜上蛋白酶含量也比胃肠道中的少，减少了 INS 被酶破坏失活， 提高了药物的生物利用度。许多药动学研究表明鼻黏膜吸收 INS 的机制与体内内源性的 INS 释放极为相似，为鼻腔 INS 给药提供了理论依据。 鼻腔给药需要加入吸收促进剂，如胆酸盐、月桂醇酯等才能增加吸收效果。这些吸收 促进剂可暂时改变鼻腔黏膜的通透性，从而提高药物吸收率。William 等[15]以牛磺二褐 霉酸钠为吸收促进剂，制成的 INS 滴鼻液、液体喷雾剂及粉末气雾剂相对同剂量静脉给药 的生物利用度分别为 5.7%、37.4%、37.8%。认为粉末气雾剂是最佳剂型，其达峰时间 为 5-15min，维持疗效 90min，且粉末的固体状态有利于 INS 的化学稳定性。 陈春霞等[16]以 1%甘珀酸钠为吸收促进剂，制成 INS 气雾剂给糖尿病大鼠鼻腔给药， 60min 血糖下降约 50%，并维持疗效达 3h。刘素筠等[17]以氮酮为透皮促进剂，大鼠鼻 黏膜给予含 1%氮酮的 INS 溶液均有显著降糖作用，说明氮酮可促进 INS 透过鼻黏膜屏障， 且降糖作用持续时间长。 Schipper 等[18]发现 DM-β-CD 对 INS 溶液在兔和大鼠鼻腔给药的促进性有显著不 同，大鼠给药出现了显著的 INS 吸收，并伴发有强烈的低血糖反映，而在兔身上则表现不 明显，说明 β-CD 衍生物对不同物种表现出不同效应。另一方面当鼻腔给予含 DM-β-CD 的粉末剂时，兔的血糖浓度最大降低 50%，粉末给药绝对生物利用度是 134%，而溶液剂 为 11%。 Pollion 等[19]发现皂树皂甙极其衍生物也有促进 INS 大鼠鼻腔吸收的作用，而且这 种作用是剂量依赖性的。Takenaga 等[20]发现当 INS 与苯乙烯磺酸钠阴离子型树脂或苯 乙烯-二乙烯苯聚合物非离子树脂混合后兔鼻腔给药，呈现出吸收增强的作用，而聚丙烯非 离子树脂和考来烯胺阳离子树脂不具有促吸收作用。 Ando 等[21]发现豆甾醇混合物（SS）是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病（和类固醇糖苷混合物（SG）是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病（分别对 INS 的兔 鼻腔吸收也有促进作用。体外研究表明 SS 和 SG 对兔鼻腔黏膜的脂质有一定作用。 Callens 等[22]考察了鼓式干燥蜡质玉米淀粉（DDWM）是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病（，麦芽糖糊精和 Carbopol974P 不同配比对 INS 兔鼻腔黏膜吸收的影响。结果表明，在制得的 INS 粉末中 DDWM（5%）是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病（ 和 Carbopol974P（10%）是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病（促吸收效果最好，而且随 Carbopol974P 的含量下降，促吸 收效果也下降。另外，INS 与附加剂粉末的配比对降糖效果也有影响。 目前，美国已有 INS 鼻用制剂上市，商品名为 Nazlin 和 ZorolinNasal. 3 肺部给药 肺泡的总面积大，肺泡壁很薄，通透性良好，蛋白酶活性低于胃肠道，不存在首过效 应，所以经肺吸收可能成为大分子药物吸收进入全身循环的一条途径。但同时肺部给药也 存在一些问题，比如需要特殊的给药装置，给药剂量和实际吸入剂量不准确，长期使用对 肺部的安全性问题一直未受重视等。目前已报道的多种肺内给药系统，如脂质体，微球等， 因脂质体主要由磷脂组成，而磷脂是肺泡表面活性剂的重要组部分，所以脂质体特别适合 于肺内控释给药。 Shao 等[23]研究发现，环糊精能 INS 的肺部吸收，应用甘胆酸钠，亚油酸和月桂基β-D 麦芽吡喃甙，再加抑肽酶或杆菌肽配制制剂，将其肺部给药，降血糖作用明显持久， 且用杆菌肽者优于抑肽酶。 沈赞聪等[24]研究了以氰基丙烯酸树脂为载体的 INS 微球（INS-NP）是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病（经大鼠肺部给药 后的降血糖作用。其肺给药的相对生物利用度达到 59.2%，与 INS 溶液相比，INS-NP 经 大鼠肺部给药后能明显延长其血糖下降时间，作用时间达 12h 以上，有显著的缓释作用。 Kawashima 等[25]制备了用 PLGA 装载的 INS 微球，平均直径在 400nm。体外释 放有突释作用，85%的药物能很快释放，其余药物延长释放数小时。豚鼠经雾化吸入给药 后血糖水平显著下降，降糖作用延长至 48h，与 INS 溶液雾化吸入作用时间（6h）是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病（相比微 球的延长释放效果可能是由沉积在肺部的微球持续释放造成的。干粉 INS 的微球或脂质体 稳定性好，工艺简单，能有效地输送到下呼吸道，是一种良好的肺部给药形式。最近 Cenerex 公司成功地研制出了一种新型的 INS 吸入器，并且在进行临床试验，可望在两年 内投放市场 4 直肠给药 INS 直肠栓剂是代替注射给药的重要途径之一。为了增加吸收，需要向其中加入吸收 促进剂。水杨酸钠（SS）是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病（便是重要的一种，但它的促进吸收能力较差，可能是二者在直肠 中吸收不同步造成的。马鸣超等[26]首次利用葡聚糖凝胶（DG）是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病（来特异地减慢 SS 从栓剂 中的释放速度，而不影响 INS 的释放，从而达到二者同步吸收的作用。试验证明含 200mgDG 的 INS 与不含 DG 的 INS 相比明显提高栓剂中 INS 在兔直肠中的吸收量，致使 兔血浆中 INS 最大浓度不变的情况下，持续时间明显延长，进而血糖浓度下降，当 DG 达 到 400mg 时效果反而不好，分析可能是过量的 DG 过度地减慢了 SS 从 INS 栓中的释放 速度，以至于 SS 始终不能达到促进 INS 吸收浓度。在此基础上马鸣超等[27]又制成了加 入甲硝唑的 INS，结果证实甲硝唑和 DG 对 SS 促进 INS 在兔直肠吸收具有协同作用。 Onuki 等[28]评价了不饱和脂肪酸如油酸、DHA（二十二碳六烯酸）是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病（、EPA（二十碳 五烯酸）是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病（作为 INS 直肠给药（W/O/W）是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病（复乳的吸收促进剂的效应和毒性。研究证明 DHA 有很强烈的促渗作用，而且不能或较少引起黏膜破坏。YUN 等[29]开发了一种热可逆性 INS 液体栓剂，该栓剂能在体温下发生相转变而成为黏附性凝胶，能提高 INS 的生物利用 度，当处方配比为 INS：聚合物 P407：聚合物 P198：聚卡波非：水杨酸钠为 100IU/g： 15：20：0.2：10%时，表现出适宜的物化特性和良好的安全性，并给出了较低的血糖水 平，水杨酸有促进吸收的作用。Barichello[30]开发了一种 PluronicF-127(PF-127)的 INS 直肠栓，证明含 20%PF-127 可能促进 INS 的吸收。 5 经皮给药 角质层对大分子肽类药物的透皮吸收能力差，但只要措施得当，仍可透过皮肤发挥全 身治疗作用。Ryszka 等[31]将 INS 制成软膏，通过 124I 标记证实了 INS 可从软膏基质中 释放出来，透过皮肤进入大循环，且体内外释药量有一定相关性。毛晓明[32]用脉冲电流 增加皮肤两侧的电流强度（不超过 0.6mA/cm2）是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病（，给糖尿病大鼠用 INS 治疗，结果显示 血糖下降，且在一定范围内下降幅度与脉冲电流强度和释放 INS 浓度成正比。 6 经眼给药 滴眼剂是一种简便易行的剂型，INS 主要通过眼结膜和鼻泪管黏膜吸收进入体循环而 达到降糖效果。一般眼内容量少，INS 作用时间短，生物利用度低，因此人们致力于研究 能延长 INS 作用时间的滴眼剂，并选择刺激性小滴眼剂。Yung 等[33]选用生物相容性好， 理化性质稳定且可生物降解的明胶海绵作骨架制成 INS 眼内给药装置，该装置含 5mgINS 和 20μgg 的 Brij-78 作吸收促进剂，经兔眼给药后，2h 血糖下降约 50-62%，且维持时间 达 4-6h，是普通滴眼剂的 10 倍。 李素霞[34]等通过对缓冲液，增粘剂和吸促进剂的筛选，确定了最佳处方组成： 2%INS，1%Brij-78,0.5%EDTA，1%玻璃酸钠的含 0.03%对羟基苯甲酸乙酯的硼酸缓 冲液，滴眼后吸收迅速，可显著降低糖尿病兔的血糖，EDTA 和 Brij-78 合用，促吸收效 果最佳。 吕敏[35]等以 1%EDTA 为溶媒，pH7.4 磷酸盐为缓冲液配成 0.5%INS 溶液经家兔眼 给药，降糖效果比静脉注射更为显著，说明 EDTA 能明显地促进 INS 眼部吸收。张文玉等 [36]进一步比较了 0.5%Brij-35 和 0.5%EDTA 的 1%INS 滴眼液的刺激性和降糖效果， 综合结果表明，含 0.5%Brij-35 的 1%INS 滴眼液对家兔黏膜无刺激作用，而降糖效果好， 故认为 Brij-35 比 EDTA 更为理想。 7 结语 近年来，对 INS 的非注射途径给药研究虽取得一些进展，但面临的困难仍然很多，黏 膜吸收促进剂的选择及如何降低刺激性仍是个问题。而且目前为止，报道的生物利用度最 高为 59.2%，相对来说较低，因此在这方面尚无突破性的进展，还需进一步深入研究开发， 寻找合适的给药途径及剂型。 摘要：随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要综述 了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点、方法及蛋白质质谱分析的原理、方式和应用， 并对其发展前景作出展望。 关键词：蛋白质，质谱分析，应用 前言： 蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占 细胞干质量的 50%以上，作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行、 调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此蛋白质 也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家 极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立 体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断 成熟，使这一领域的研究发展迅速。 自约翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)发明了对生物大分子进行确认 和结构分析的方法及发明了对生物大分子的质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的 迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一[1]。 它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施。质谱 法已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一，在对蛋白质结构分析的 研究中占据了重要地位[2]。 1．质谱分析的特点 质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：很高的灵敏度能为亚微克 级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定， 同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。 2．质谱分析的方法 近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种：1)电 喷雾电离质谱；2)基质辅助激光解吸电离质谱；3)快原子轰击质谱；4)离子喷雾电离质谱； 5)大气压电离质谱。在这些软电离技术中，以前面三种近年来研究得最多，应用得也最广 泛[3]。 3．蛋白质的质谱分析 蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，复杂结构主要包括以肽链为 基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级，三级或四 级]结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键 数目和位置。 3.1 蛋白质的质谱分析原理 以往质谱(ＭＳ)仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如介质 辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。 其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场 将具有特定质量与电荷比值(Ｍ/Ｚ值值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的 离子，确定离子的Ｍ/Ｚ值值，分析鉴定未知蛋白质。 3.2 蛋白质和肽的序列分析 现代研究结果发现越来越多的小肽同蛋白质一样具有生物功能，建立具有特殊、高效 的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。因此需要高效率、高灵敏度的肽和蛋白质序 列测定方法支持这些研究的进行。现有的肽和蛋白质测序方法包括Ｎ末端序列测定的化学末端序列测定的化学 方法 Edman 法、Ｃ末端酶解方法、Ｃ末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例末端酶解方法、Ｃ末端酶解方法、Ｃ末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例 如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的Ｎ末端序列测定的化学末端氨基酸苯异硫氰酸酯 (phenylisothiocyanate)PITC 分析法(即 Edman 法，又称 PTH 法)，测序速度较慢(50 个氨基酸残基/天)；样品用量较大(nmol 级或几十 pmol 级)；对样品纯度要求很高；对于 修饰氨基酸残基往往会错误识别，而对Ｎ末端序列测定的化学末端保护的肽链则无法测序[4]。Ｃ末端酶解方法、Ｃ末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例末端化学降解 测序法则由于无法找到 PITC 这样理想的化学探针，其发展仍面临着很大的困难。在这种 背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学 家的广泛注意。在质谱测序中，灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低，所以肽的序列 分析比蛋白容易许多，许多研究也都是以肽作为分析对象进行的。近年来随着电喷雾电离 质谱(electrosprayionisation，ESI)及基质辅助激光解吸质谱 (matrixassistedlaserdesorption/ionization，MALDI)等质谱软电离技术的发展与完善，