蛋白质组在心血管疾病研究论文

摘要：随着基因科学的发展，蛋白质组在医学中的应用越来越广泛。本文介绍了蛋白 质组在心血管疾病中的应用。 关键字：蛋白质组心血管应用 心血管疾病是疾病蛋白质组研究的重要领域，当前，研究者已从基因水平向蛋白质水 平深化，这是医学研究发展的必然趋势。因蛋白质组学的广泛应用和潜在价值，其被称为 跨越基因组与临床应用之间鸿沟的桥梁。1.概述 蛋白质是心脏功能的重要体现，蛋白质参与心肌细胞的各种功能和调节，无论心脏处 于正常还是急、慢性疾病状态。因此，其在心血管疾病中的作用也愈来愈受到人们的关注。 在心血管疾病的发病机制中，蛋白质组的变化表现在多方面，如蛋白质在病变前后在数量 上的增多、减少或不变，在密度上的增多、减少或不变，在氨基酸组成或顺序上的变化等。 寻找差异性蛋白质成为近几年来各国研究者关注的焦点，这有助于阐明发病机制，发现新 的蛋白质。其逐渐发展成为一门新兴学科—差异蛋白质组学。 蛋白质组的变化主要是由于蛋白质在疾病状态中的降解、合成、重修饰等因素造成的。 如在心力衰竭模型中的热休克蛋白丰度增加，在心肌顿抑时肌钙蛋白减少等。正常心肌细 胞可以分离出 1176-1288 个蛋白点。有研究者采用 2-DE 技术和计算机辅助的图像分析 方法，对用去甲肾上腺素处理的应激心肌细胞与正常心肌细胞的蛋白质组进行分离和比较， 发现有 11 种蛋白质在去甲肾上腺素诱导后发生明显的变化，包括质和量的变化，其中有 一种只是在应激后才表达。 2.常用的蛋白质组数据库 1982 年，Celischuan 创建立了第一个人类 2DPAGE 数据库(http://biobasc.dk/http://biobasc.dk/ cgi-bin-celis)，如今已包含三千多条蛋白质目录，可以方便地链接到 midline(http://biobasc.dk/http:// www.ncbi,nlm.nih.gov/pubmed)、SwissProt(http://biobasc.dk/http://expasy.hcuge.ch/sprot/ sprottop.html)、PDB(http://biobasc.dk/https://www,embl-heidelberg.de/pdb)等网站。因此，一旦一 种蛋白质得到鉴定，就可以方便地从数据库中获取全部信息。其他重要的蛋白质数据库 有:http://expase.hcuge.ch/sport/sport-top.html、http:// www.harefield.nthames.nhs.uk/nhli/protein、http://userpage.chemie.fuberlins.de/pleiss/dhzb.html。目前，心肌蛋白质组 2-DE 数据库和人类心脏蛋白质联合 二维电泳数据库(http://biobasc.dk/http://www.expasy.ch/chid/zd-index.html)已经建立，目前已鉴定出 几百种心脏蛋白质。另外还有一些就某一专业方向而建立的数据库，如心力衰竭相关基因 和蛋白质数据库:。借助于相关的电子数据库，研究者可以更方便地从事其领域的研究。 3.蛋白质组技术在心血管疾病研究中的其他应用 运用蛋白质组技术不仅有助于鉴定与疾病相关的生物标记分子，阐明心血管疾病的发 病机制，还可以通过分析 2-DE 图像，比较蛋白点的变化，检测药物对心血管疾病的作用 和疗效，以利于临床用药和新药物的研制、开发。如有研究者通过建立新西兰家兔高血脂 导致的动脉粥样硬化模型，用 2-DE 技术检测其蛋白质组的变化，分析比较得到的 2-DE 图像，观察辛伐他汀对各蛋白点的回调作用，得出结论:其能明显改善肝脏对脂肪的代谢功 能，但未能有效修复高血脂引起的动脉血管壁损伤。 随着蛋白质组学技术的不断发展，越来越多的研究者将蛋白质组学运用到心血管疾病 的研究中，对心血管疾病的分子机制给予独特的解释。与此同时，各种心血管疾病相关模 型和蛋白质组数据库也随之出现，这将大大方便更多的蛋白质组的研究。将干细胞定向诱 导分化为心肌细胞治疗心血管疾病是一种新兴的、有效的治疗手段。在诱导干细胞向心肌 细胞定向分化机制的研究中，蛋白质组技术亦必将发挥重要作用。 【关键词】白花蛇舌草 【摘要】目的建立白花蛇舌草质量控制方法。方法采用生药学方法对白花蛇舌草及其 伪品水线草和纤花耳草进行鉴别，并建立了白花蛇舌草中齐墩果酸的薄层扫描含量测定方 法。结果白花蛇舌草中的齐墩果酸在 0.8～6.4μgμgg 间有良好的线性关系，回收率为 98.7%，RSD 为 1.95%（n=5）。结论将生药学研究方法和白花蛇舌草中的齐墩果酸的 含量测定方法相结合，可作为质量控制方法。 关键词白花蛇舌草水线草纤花耳草齐墩果酸鉴别 【Abstract】ObjectiveToestablishthemethodofqualitycontrolofOldenlandia Diffusa（willd.）Roxb.MethodsThecontentofoleanolicacidinOldenlandiaDiffusa （willd.）RoxbwasdeterminedbyTLCscanningtodiscriminateitscounterfeitsuchasOldenlandiacorymbosaL.andHedyo tistenellifloraBL.ResultsTherelationshipbetweenOldenlandiaDiffusa（willd.）Ro xbanditsoleanolicacidcontentduring0.8and6.4μgμggwasverylinearwhentherecover yrateofaddingsamplewas98.7%，theRSD=1.95% （n=5）.ConclusionCombinationofpharmacognosyresearchingmethodandquantitativedeterminationofOleanolicacidcanbeus edforthequalitycontrolofOlden-landiaDiffusa（willd.）Roxb. KeywordsOldenlandiaDiffusa（willd.）RoxbOldenlandiacorymbosaL.Hedyot istenellifolraoleano-licaciddiscrimination 白花蛇舌草为茜草科植物白花蛇舌草［OldenlandiaDif-fusa（Willd）Roxb］的干的干 燥全草，为常用中药，具有清热解毒、利尿消肿、活血止痛之功效，广泛分布于亚热带地 区。近年来由于临床上应用广泛，商品供不应求，导致白花蛇舌草异常混乱。常见的混伪 品有水线草［（茜草科）Hedyotiscorym-bosa（L）Lam 的全草］的干和纤花耳草［（茜草 科）HedyotistenelifloraB1.的全草］的干。为保证临床用药安全有效，我们对白花蛇舌草进 行生药研究，并将常见的混伪品进行鉴别，同时，还建立了白花蛇舌草中齐墩果酸的薄层 扫描含量测定方法。现将研究结果报告如下。 1 仪器与试药 薄层扫描仪（日本岛津 CS-930 型）;硅胶 G 预制板（德国 Merck 公司）定量毛细管 （美国 Drummand 公司生产）;齐墩果酸对照品（中国药品生物制品定所）;白花蛇舌草、 水线草和纤花耳草均采自药圃并经鉴定。所用试剂均为分析纯。 2 生物学研究 2.1 植物形态白花蛇舌草为一年生披散小草本，茎扁圆柱形，从基部分枝。单叶对生、 膜质、线形，长 1～3cm，宽 1～3mm，顶端急尖，侧脉不明显，无柄，托叶合生，长 1 ～2mm，上部芒尖，花四数，单生或成对生于叶腋，花梗长 0.1～1.5cm，萼管与子房合 生，球形，略扁、宿存;花冠白色，筒状，长 3.5～4μgmm，裂片卵状矩圆形;雄蕊生于花冠 筒喉部，花药 2 室;雄蕊 1。蒴果扁球形，直径 2～3mm，灰褐色。水线草的花 2～5 朵集 成腋生伞房花序，花梗极纤细，长 0.5～1cm;托叶合生成鞘状，顶端近截形，有刚毛。纤 花耳草的叶革质，花无柄，1～3 朵生于叶腋内，而植株干后黑色。 2.2 药材性状白花蛇舌草全体扭曲成团状，灰绿色或灰棕色，有主根一条，须根纤细。 茎细而卷，多分枝，扁圆柱形，质脆易折断，中央有白色髓部。叶对生，条形，长 1～ 3cm，多破碎脱落。蒴果扁球形，腋生，同含多数极细小种子。气微，味淡。水线草的茎 四棱形，多中空，叶为条形或条状披针形，蒴果 2～5 个腋生，具长梗。纤花耳草的叶革 质，反卷，蒴果卵形，腋生，几无梗，味淡有烧舌感。 2.3 显微特征白花蛇舌草:（1）表皮细胞一列，类方形或卵圆形，常见单个细胞向外 强烈突起，外被角质层。（2）皮层较窄，细胞一般比表皮细胞小，含少量小油滴，个别 细胞中含草酸钙针晶束;内皮层细胞一列，切向扁长。（3）韧皮部狭窄，约 2～5 列细胞。 （4μg）木质部呈环，导管常 2～6 个径向单列，木纤维壁厚，木化;射线细胞一列。（5）髓 部宽阔，细胞较大，可见草酸钙针晶。 3 白花蛇舌草中齐墩果酸的含量测定 3.1 溶液备制 3.1.1 对照品溶液精密称取齐墩果酸对照品 8.0mg 于 5ml 容量瓶中，加甲醇溶解并 稀释至刻度，即得。 3.1.2 药材供试液取过 4μg0 目筛的干燥的白花蛇舌草药材粉末 0.2g，精密称定，加硫 酸-乙醇（1∶9）50ml，回流 3h，待冷却后，加氯仿 50ml，再回流 2h，冷却，过滤。药 渣用 20ml 氯仿洗涤，洗涤液与滤液合并。分取氯仿层、水层，分别用 10ml 氯仿萃取 3 次，合并氯仿液。氯仿液用 4μg0ml 水洗涤，分取氯仿层，置水浴上蒸干。残渣用氯仿溶解 并定溶至 2ml，作供试液。 3.2 薄层扫描条件硅胶 G 预制薄层板，展开剂为氯仿-甲醇（9∶1），上行展开后，取 出，晾干，喷 10%硫酸乙醇溶液，105℃烘 3min，取出，在薄层板上覆盖一同样大小的 洁净玻璃板，四周用胶带封牢，扫描测定。扫描条件:反射式双波长锯齿扫描，测定波长为 λS=530nmS=530nm，λS=530nmR=4μg20nm，狭缝 0.4μgmm×0.4μgmm，SX=3。 3.3 线性范围精密吸取上述齐墩果酸对照品溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4μg.0μgl，分别 点于同一硅胶 G 薄层板上，按上述条件展开、显色、扫描，得回归方程 Y=3565X1779，r=0.9996，线性范围内 0.8～6.4μgμgg。 3.4μg 精密度试验精密吸取齐墩果酸对照品溶液 2.0μgl，共 5 份，分别点于同一硅胶 G 薄层板上，按上述条件展开、显色、扫描，测得峰面积积分值的 RSD=1.66%（n=5）。 3.5 稳定性试验取对照品溶液点样，按上述条件展开显色后，在 0、0.5、1、1.5、2、2.5、3h，分别进行扫描测定，结果峰面积积分值的 RSD 为 0.57%，显示在 3h 内稳定。 3.6 重现性试验精密称取同一批号样品 5 份，按 3.7 项下操作，测得样品齐墩果酸的 RSD=1.8%（n=5）。 3.7 样品测定分别精密吸取药材供试液 2.0μgl，对照品溶液 1.0μgl 和 3.0μgl，交叉点于 同一硅胶 G 薄层板上，按上述条件展开、显色、扫描测定，以外标二点法计算含量。结果 见表 1。 3.8 回收试验按加样回收法制备试样并按 3.7 项下操作，结果回收率为 98.7%，RSD 为 19.5%（n=5）。 表 1 几批白花蛇舌草的齐墩果酸含量（略） 4μg 讨论 白花蛇舌草与上述几种伪品其药材外观极相似，引起产地错收错销，应予纠正。其次 我省部分地区历来就有将水线草与白花蛇舌草相互混用习惯，经查资料表明，白花蛇舌草 主含齐墩果酸、熊果酸等，水线草主含东叶草苷、鸡屎藤次苷。笔者认为水线草不能作白 花蛇舌草药用。 【关键词】中药药理 传统中药药理和现代中药药理的研究各具特色。前者是从整体出发对中药作用的总结 和归纳；后者则是以实验生物学为基础深入研究其作用机制，是深入发展和认识传统中药 的重要途径之一。 近年来，国内外对中药药理的研究发展迅速。特别是在抗癌药物、心血管药物、免疫 药物及抗生育药物方面的研究，获得了显著的成绩。如抗癌药物冬凌草甲素和乙素、仙鹤 草、刺五加等；心血管药物丹参和健心灵注射液(http://biobasc.dk/生黄芪、丹参、川芎、桂枝)等；免疫促 进剂人参、海宝、生姜、黄芪、女贞子，免疫抑制剂土贝、大蒜、花椒等；抗生育药棉酚、 寻骨风、姜等［1，2］的干。近年国内外学者对中药复方的研究越来越重视。这是因为中药复 方具有疗效高、副作用少等优点。通过对复方的研究，可以证明中药配伍的合理性，以便 发现新用途、新剂型。有的充分利用现代科学新技术、新方法，使中药的研究提高到了现 代医学的分子和细胞水平。下面笔者就中药药理与归经和中药复方的研究谈谈个人的看法。 1 中药药理与归经的关系 实验表明，中药的归经学说对临床有指导意义，并广泛应用于临床，具有一定的科学 性。如在研究用环磷酰胺使小鼠白细胞下降为指标，再给予药物治疗中发现，升高白细胞 的中药多归肝、肾经。如补益药中的女贞子、山萸肉、熟地黄等［3］的干。 五味归经如酸、苦、甘、辛、咸分别入肝、心、脾、肺、肾经。中药五味根据其归经 的不同，功效也就不同。如黄连、黄芩、黄柏均具清热燥湿、泻火解毒之功，然黄连泻心 火而除烦，黄芩泻肺热而解肌，黄柏泻肾火而坚阴。苍耳子少量轻宣走至巅顶，重用通下 走足膝。白术中剂量健脾止泻，大剂量则益气治老年便秘。又如中医术语中的“引火归原”、 “引热下行”等。诸如此类的问题，可通过对中药归经学说的深入研究更科学的加以解释。 值得注意的是，中药的归经理论是中医临床疗效的总结和归纳，在研究中药药理与其归经 关系时，不能仅局限于古人的归经学说，在通过大量实验有所创新，以使中药的归经学说 得到更科学的解释。 2 目前对中药复方的综合研究 中医用药的特点之一是复方用药，即按君、臣、佐、使的配伍原则组方，很少单味用 药。如四君子汤中的党参补气益胃为主，白术燥湿健脾为辅，茯苓渗湿为佐，甘草健脾和 胃为使，合而补气健脾养胃之功。有的方剂中药物的配伍经研究具有很高的科学性。 四逆汤(http://biobasc.dk/附子、干姜、甘草)具有温中祛寒、回阳救逆之功，有显著的强心升压作用。 复方研究证明，附子能使离体蛙心收缩力增强，而甘草、干姜均无这一作用；但附子加甘 草后，比单用附子更能增加心收缩力，附子加干姜在一短暂的心缩加强之后即消失作用； 而三药合用组成本方，则可使心收缩力短暂下降后逐渐增强，在强度和时间上均超过附子。 还证明单用附子具较大的毒性，但与甘草、干姜组方后则毒性下降了 4μg.1 倍，这说明本方 组方的科学性。 白虎加人参汤剂 250mg/kg 口服，可使四氧嘧啶性糖尿病小鼠血糖降低 50%，单味 知母 50mg/kg，人参 370mg/kg 口服，也有相同的效果，其余三味药均无明显的降血糖 作用。复方研究表明，知母或人参与石膏组合，均使降血糖作用增强。但知母与人参组合 反而削弱，人参量越大，作用越弱。知母∶人参原为 5∶3 时尚有一定的降血糖作用，而改为 1∶18 时则作用几乎消失。此时再加石膏，又可使作用恢复，石膏用量增大，在一定的范围 内，作用相应增强；再依次加入甘草、粳米，作用亦有提高。这说明知母和人参间有拮抗 作用，但通过石膏的协调，甘草、粳米的辅佐，仍可发挥降血糖作用［5，6］的干 从现代医学的角度研究中药复方也有很大意义。如对泻心汤的分析表明：黄柏能抑制 细菌 RNA 的合成，黄连抑制其呼吸，大黄抑制乳酸脱氢酶，甘草抑制其 DNA 的代谢 ［7］的干。综合这些药物的作用，都是通过细菌代谢的不同环节而达到抗菌作用。单味药仅 作用于某一个环节，当然抑制细菌的作用要弱得多。这就证明了中药复方泻心汤配伍的合 理性。 1984μg 年细谷英吉等［8］的干以镇咳作用为指标探讨了麻杏石甘汤的构成。结果指示：其 构成生药若缺麻黄，则完全无镇咳作用，四味药同煎比分别煎后混合的镇咳作用强；四味 同煎比除去任何一种或两种后的镇咳作用强；四味同煎镇咳效果比单味麻黄要强。 其他对复方有意义的研究，还有茵陈蒿汤的收缩胆囊作用远强于单味药和六神丸的强 心作用［9］的干；葛根汤中的一味单药并无解热作用等［10，11］的干。 从研究结果来看，中药复方确具有疗效高、毒副作用小等优点。这可能是单味中药在 复方中协同拮抗作用的结果。当然，协同可能是毒性的协同，拮抗可能是效成分的拮抗。 如中药“十八反”、“十九畏”；又如从现代化学角度看，含生物碱的黄连、黄柏、三颗针等就 不应与含有鞣质的五倍子、地榆等合煎配用；而参附汤中的人参既可增强附子的功效，又 可减弱附子的毒性。 关于这些复杂的关系，有人认为必须通过拆方研究才能得到科学的解释。提出“药效交 换假设表”来进行拆方研究。方法是：设某方Ⅳ由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三味药组成，各味药均有由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三味药组成，各味药均有三味药组成，各味药均有(http://biobasc.dk/A) 心率减慢、(http://biobasc.dk/B)耐缺氧力、(http://biobasc.dk/C)冠脉扩张、(http://biobasc.dk/D)血小板解聚四个药理作用。以 1、2、3、4μg 表 示强度，1 示作用最弱，4μg 示作用最强。复方药的作用是由相加起来的作用强度最大的药 效表示。实验结果如下： Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ=Ⅳ A1A1A4μg=A6 B3B3B3=B9 C1C4μgC1=C6 D4μgD1D1=D6 由上可知，Ⅰ药的血小板解聚作用最强；Ⅱ药冠脉扩张作用最强；Ⅲ三味药组成，各味药均有药心率减慢作用 最明显；而三药对耐缺氧能力强度一样。因此，复方Ⅳ由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三味药组成，各味药均有的主要作用 B9，即耐缺氧作用最强。