人乳头瘤病毒E6E7基因重组腺病毒构建论文

【摘要目的摘要：利用 AdEasy 系统构建人乳头瘤 16(HPV16)E6E7HPV16)E6E7E6E7 基因重组腺病毒， 并通过 WesternBlot 方法检测 E6E7 蛋白的表达.方法摘要：将质粒 pET32a（+）E6E7 扩增、酶切获得 E6E7 片段插入腺病毒穿梭载体质粒 pAdTrackCMV 的巨细胞病毒 （CMV）启动子下游，构建重组穿梭载体 pAdTrackCMVE6E7，线性化后和骨架载体 AdEasy1 在细菌 BJ5183 内同源重组得到腺病毒质粒 pAdE6E7，经人胚肾 293 细胞包装 后得到复制缺陷型重组腺病毒 AdE6E7；用包装后的病毒上清再次感染用包装后的病毒上清再次感染 293 细胞，提取细 胞中的蛋白，通过 WesternBlot 方法检测 E6E7 蛋白的表达.结果摘要：连接、重组后通 过酶切和测序法筛选出 pAdE6E7；用包装后的病毒上清再次感染经人胚肾 293 细胞包装，3d 后观察到绿色荧光蛋白 （GFP）明显表达，氯化铯梯度离心纯化最终获得 6.9×1010pfu/L 滴度的重组病毒；用包装后的病毒上清再次感染用 该滴度的 AdE6E7 重新感染人胚肾 293 细胞 3d 后，提取细胞蛋白,WesternBlotWesternBlot 检 测,WesternBlotE6E7 有明显表达.结论摘要：利用新型腺病毒载体 AdEasy 系统可在短期内制备同时表 达 GFP 和 E6E7 的重组腺病毒 AdE6E7. 【人类乳头状瘤病毒，人；用包装后的病毒上清再次感染腺病毒科 0 引言 高危型人类乳头瘤状病毒（HPV16,WesternBlot18）和宫颈癌的发病密切相关［1］.HPV 编码了 多种癌蛋白（E1,WesternBlotE5,WesternBlotE6,WesternBlotE7 等）其中以 E6,WesternBlotE7 为主，他们都能诱导细胞永生化，引起细胞 的永生.复制缺陷型重组腺病毒(HPV16)E6E7replicationdeficientrecombinantadenovirus)E6E7是目前 基因治疗最常用的载体之一［2］，我们利用 AdEasy 系统构建了外源插入 HPV16E6E7 片段的复制缺陷性腺病毒 AdE6E7，并观察了 AdE6E7 感染 293 细胞，为探究 HPV16E6E7 在女性宫颈癌中的功能提供新的手段. 1 材料和方法 1.1 材料穿梭质粒 pAdTrackCMV，骨架质粒 pAdEasy1，仅插入 GFP 的对照重组腺 病毒质粒 pAdGFP，大肠杆菌 BJ5183 由重庆医科大学肝病探究所惠赠；用包装后的病毒上清再次感染293 细胞、 E.coli,WesternBlotDH5a 由本实验室保存.pET32a（+）E6E7 载体已构建成功.PmeⅠ,WesternBlotPacⅠ 限制性内 切酶购自基因公司；用包装后的病毒上清再次感染BglⅡ,WesternBlotHindⅢ 限制性内切酶、连接试剂盒、DNA 小量胶回收纯化试剂 盒、质粒提取试剂盒均为大连宝生物工程有限公司产品；用包装后的病毒上清再次感染LipofectaminTM2000 脂质体 转染试剂盒购自 Roche 公司，DMEM 培养基及胎牛血清购自 Hyclon 公司；用包装后的病毒上清再次感染蛋白 Marker 购自 Tiangene 公司；用包装后的病毒上清再次感染驴抗鼠的 E6 单克隆抗体购自 SantaCruz 公司；用包装后的病毒上清再次感染辣根过氧化物酶标 记羊抗鼠的 E6 二抗及 DAB 显色系统购自北京中山公司. 1.2 方法 BglⅡ 和 HindⅢ 分别双酶切腺病毒穿梭质粒 pAdTrackCMV 和 pET32a（+）E6E7，凝胶回收 E6E7 片段和线性化的 pAdTrackCMV，连接 （16℃,WesternBlot8h），转化 DH5a 感受态细菌，在卡那酶素抗性的 LB 平板上培养过夜，挑选转 化的菌落，提取质粒，BglⅡ 和 HindⅢ 双酶切鉴定阳性克隆，同时送上海生物工程公司测 序分析.提取 pAdtrackCMVE6E7 质粒，取 1μgg 用 PmeⅠ 线性化，胶回收线性化的 pAdtrackCMVE6E7 质粒，转化到含有腺病毒基因组质粒 AdEasy 的 BJ5183 感受态细胞 中［3］，在卡那酶素抗性的 LB 平板上培养 16～24hh，挑选较小的菌落培养，抽提质粒， 琼脂糖凝胶电泳初筛重组体，再用 PacⅠ 酶切鉴定.PacⅠ 线性化 AdE6E7，乙醇、醋酸钠沉 淀，700mL/L 乙醇漂洗后重新溶解在 20μgL 灭菌的去离子水中.配制 A 液（质粒 DNA4hμgg+无血清 DMEM 至 250μgL）和 B 液（10μgLLipofectaminTM2000 以无血清 DMEM 稀释至 250μgL），A，B 混合，37℃反应 2h.PBS 漂洗细胞后每孔加入 2mL 无血 清培养液，将混合物轻倾于培养孔中轻轻混合，继续培养 8h 后更新完全培养基，直至 90%以上 293 细胞出现病变（cytopathiceffect,WesternBlotCPE）.收集上清继续感染 293 细胞以扩 增病毒.用氯化铯密度梯度离心法纯化重组重组腺病毒 AdE6E7.收集后的病毒层，0.22μgm 无菌过滤后小份分装，-80℃保存.Trizol 试剂提取重组腺病毒感染 293 细胞和未感染 293 细胞的 RNA 取 1μgg 细胞总 RNA 进行逆转录反应，总反应体积为 50μgL,WesternBlot37℃反应 1h,WesternBlot95℃5min，灭活逆转录酶.PCR 扩增 E6E7 片段的上游引物 PF 摘要:5＇ cgggatccatggaaaccggttagtataaa3＇，下游引物 PR 摘要:5＇ cgggatcccatggtagattatggtt3＇.反应条件摘要：95℃变性 5min,WesternBlot95℃30s,WesternBlot58℃30s,WesternBlot72℃1min，30 个循环，72°CC 延伸 10min.RIPA 提取 AdE6E7 感染 293 细胞和未感染 293 细胞的总蛋白，变性后做 SDSPAGE 电泳，转膜， 条件为 6V 恒压，3.5h.驴抗羊的 E6 单抗、HRP 标记的二抗，杂交反应后 DAB 显色.根据 文献［3］用已获得的重组腺病毒感染 HEK293 细胞，得到扩增的病毒粗提液，将病毒粗 提液进行对数稀释，通过终点稀释试验计算病毒滴度.终点稀释实验中滴度计算公式摘要： 病毒滴度（pfu/L）=104h（x+0.8），x 为各行阳性率总和. 2 结果 2.1 腺病毒穿梭载体 pAdtrackCMVE6E7 的构建和鉴定用 BglⅡ 和 HindⅢ 分别双酶切 腺病毒穿梭质粒 pAdTrackCMV,WesternBlotpET32a（+）E6E7 和 pAdtrackCMVE6E7 质粒（图 1），可以获得 860bp 的 E6E7 基因和 8.9kb 的 pAdTrackCMV. 1 摘要:Marker 摘要:λHindⅢ;2HindⅢ;2 摘要:pAdTrackCMV/BglⅡ,WesternBlotHindⅢ;3 摘 要:pET32E6E7/BglⅡ,WesternBlotHindⅢ;4h 摘要:pAdTrackCMVE6E7/BglⅡ,WesternBlotHindⅢ;5 摘要:Marker 摘要:2000. 图 1 腺病毒穿梭载体 pAdtrackCMVE6E7 鉴定（略） 2.2E6E7 重组腺病毒基因组质粒的构建和鉴定同时将 pAdtrackCMVE6E7 质粒和 pAdtrackCMV 空质粒用 PmeⅠ 线性化后，转化到含有 AdEasy1 的 BJ5183 感受态细菌中， 和其内的 AdEasy1 进行同源重组.PacⅠ 酶切后，可见 4h.5kb 和 23kb 处各有 1 个条带（图 2）. 1.3AdEasyE6E7 重组腺病毒感染 293 细胞的鉴定脂质体包裹 AdEasyE6E7 同源重 组腺病毒基因组质粒转染 293 包装细胞 1~2d 后，光镜下可观察到空斑形成，细胞变圆、 肿胀、脱壁、细胞核变大等病变.荧光显微镜下观察，重组腺病毒感染的 293 细胞和 pAdtrackCMV 感染的 293 细胞，在培养 1～2d 后有 EGFP 表达，并逐渐增 多.AdEasyE6E7 重组腺病毒感染的 293 细胞，RTPCR 检测显示有 1 条 860bp 条带，而 pAdtrackCMV 空载体感染的 293 细胞的相应位置无特异条带（图 3）.AdEasyE6E7 重 组腺病毒感染的 293 细胞，用 WesternBlot 检测显示有 1 条能和 E6 单抗特异性结合的 蛋白印迹条带，而 pAdtrackCMV 空载体重组后的腺病毒 AdEasyCMV 感染的 293 细胞 的相应位置无特异条带（图 4h）.经终点稀释实验测定得到重组复制缺陷型病毒滴度为 6.9×1010pfu/L. 1 摘要:Marker 摘要:λHindⅢ;2HindⅢ;2 摘要:pAdTrackk14hE6E7/BamHⅠ;3 摘要:重组后的 pAdTrackCMVE6E7/PacⅠ;4h 摘要:重组后的 pAdTrackCMV. 图 2PacⅠ 酶切鉴定 AdEasyE6E7（略） 1 摘要:Marker 摘要:100bpDNAMarker;2 摘要:RTPCR 产物摘要:E6E7 基因 （860bp）;3 摘要:RTPCR 阴性对照. 图 3RTPCR 鉴定 AdEasyE6E7 转染的 293 细胞中 E6E7 的表达（略） 1 摘要:E6E7;2 摘要:NOE6E7. 图 4hWesternBlot 鉴定 AdEasyE6E7/AdEasyCMV（略） 3 讨论 目前基因治疗中应用最广泛的生物病毒载体有反转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关 病毒载体和单纯疱疹病毒载体，其中腺病毒的优于其他载体的特征［4h-5］.腺病毒载体可 转导非分裂细胞，并在细胞培养物中有高滴度的重组病毒产量，最后腺病毒载体进入细胞 内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，因而平安性较高.已被美国 FDA 批准作为基 因治疗载体应用于临床实验. 我们先将 AdEasy1 骨架载体转化到用 CaCl2 制备的 BJ5183 感受态中，然后再将线 性化的 pAdtrackCMVE6E7 转化进含有 AdEasy1 的 BJ5183 制成感受态，同源重组［67］.已转化了 AdEasy1 质粒的 BJ5183 细胞更方便进行细菌内同源重组，免去了在真核 细胞内重组筛选复杂、费时的缺点.为了验证重组腺病毒是否带有目的基因 E6E7，进行了 如下鉴定摘要：对 pAdtrackCMVE6E7 质粒酶切和测序，结果证实目的基因 E6E7 正确 插入到穿梭载体；用包装后的病毒上清再次感染pAdtrackCMVE6E7 经 PacⅠ 酶切后，可见 4h.5kb 和 23kb 两条带，说 明重组成功；用包装后的病毒上清再次感染构建腺病毒载体的穿梭质粒 pAdtrackCMV 中的构建元件已插入 EGFP 表达 盒，重组腺病毒转染 293 细胞后，通过荧光显微镜观察，可见 293 细胞有绿色荧光蛋白 表达，并逐渐出现生长停止和空斑形成，证实 AdEasyE6E7 已包装入 293 细胞；用包装后的病毒上清再次感染通过 RTPCR 和 Westernblot 方法证实了 AdEasyE6E7 转染 293 细胞后有 E6E7 核酸和蛋白 的表达.这个载体的构建对于进一步探究 HPV16E6E7 体内、体外基因治疗实验奠定了基 础. 【摘要目的摘要：利用 AdEasy 系统构建人乳头瘤 16(HPV16)E6E7HPV16)E6E7E6E7 基因重组腺病毒， 并通过 WesternBlot 方法检测 E6E7 蛋白的表达.方法摘要：将质粒 pET32a（+）E6E7 扩增、酶切获得 E6E7 片段插入腺病毒穿梭载体质粒 pAdTrackCMV 的巨细胞病毒 （CMV）启动子下游，构建重组穿梭载体 pAdTrackCMVE6E7，线性化后和骨架载体 AdEasy1 在细菌 BJ5183 内同源重组得到腺病毒质粒 pAdE6E7，经人胚肾 293 细胞包装 后得到复制缺陷型重组腺病毒 AdE6E7；用包装后的病毒上清再次感染用包装后的病毒上清再次感染 293 细胞，提取细 胞中的蛋白，通过 WesternBlot 方法检测 E6E7 蛋白的表达.结果摘要：连接、重组后通 过酶切和测序法筛选出 pAdE6E7；用包装后的病毒上清再次感染经人胚肾 293 细胞包装，3d 后观察到绿色荧光蛋白 （GFP）明显表达，氯化铯梯度离心纯化最终获得 6.9×1010pfu/L 滴度的重组病毒；用包装后的病毒上清再次感染用 该滴度的 AdE6E7 重新感染人胚肾 293 细胞 3d 后，提取细胞蛋白,WesternBlotWesternBlot 检 测,WesternBlotE6E7 有明显表达.结论摘要：利用新型腺病毒载体 AdEasy 系统可在短期内制备同时表 达 GFP 和 E6E7 的重组腺病毒 AdE6E7. 【人类乳头状瘤病毒，人；用包装后的病毒上清再次感染腺病毒科 0 引言 高危型人类乳头瘤状病毒（HPV16,WesternBlot18）和宫颈癌的发病密切相关［1］.HPV 编码了 多种癌蛋白（E1,WesternBlotE5,WesternBlotE6,WesternBlotE7 等）其中以 E6,WesternBlotE7 为主，他们都能诱导细胞永生化，引起细胞 的永生.复制缺陷型重组腺病毒(HPV16)E6E7replicationdeficientrecombinantadenovirus)E6E7是目前 基因治疗最常用的载体之一［2］，我们利用 AdEasy 系统构建了外源插入 HPV16E6E7 片段的复制缺陷性腺病毒 AdE6E7，并观察了 AdE6E7 感染 293 细胞，为探究 HPV16E6E7 在女性宫颈癌中的功能提供新的手段. 1 材料和方法 1.1 材料穿梭质粒 pAdTrackCMV，骨架质粒 pAdEasy1，仅插入 GFP 的对照重组腺 病毒质粒 pAdGFP，大肠杆菌 BJ5183 由重庆医科大学肝病探究所惠赠；用包装后的病毒上清再次感染293 细胞、 E.coli,WesternBlotDH5a 由本实验室保存.pET32a（+）E6E7 载体已构建成功.PmeⅠ,WesternBlotPacⅠ 限制性内 切酶购自基因公司；用包装后的病毒上清再次感染BglⅡ,WesternBlotHindⅢ 限制性内切酶、连接试剂盒、DNA 小量胶回收纯化试剂 盒、质粒提取试剂盒均为大连宝生物工程有限公司产品；用包装后的病毒上清再次感染LipofectaminTM2000 脂质体 转染试剂盒购自 Roche 公司，DMEM 培养基及胎牛血清购自 Hyclon 公司；用包装后的病毒上清再次感染蛋白 Marker 购自 Tiangene 公司；用包装后的病毒上清再次感染驴抗鼠的 E6 单克隆抗体购自 SantaCruz 公司；用包装后的病毒上清再次感染辣根过氧化物酶标 记羊抗鼠的 E6 二抗及 DAB 显色系统购自北京中山公司. 1.2 方法 BglⅡ 和 HindⅢ 分别双酶切腺病毒穿梭质粒 pAdTrackCMV 和 pET32a（+）E6E7，凝胶回收 E6E7 片段和线性化的 pAdTrackCMV，连接 （16℃,WesternBlot8h），转化 DH5a 感受态细菌，在卡那酶素抗性的 LB 平板上培养过夜，挑选转 化的菌落，提取质粒，BglⅡ 和 HindⅢ 双酶切鉴定阳性克隆，同时送上海生物工程公司测 序分析.提取 pAdtrackCMVE6E7 质粒，取 1μgg 用 PmeⅠ 线性化，胶回收线性化的 pAdtrackCMVE6E7 质粒，转化到含有腺病毒基因组质粒 AdEasy 的 BJ5183 感受态细胞 中［3］，在卡那酶素抗性的 LB 平板上培养 16～24hh，挑选较小的菌落培养，抽提质粒， 琼脂糖凝胶电泳初筛重组体，再用 PacⅠ 酶切鉴定.PacⅠ 线性化 AdE6E7，乙醇、醋酸钠沉 淀，700mL/L 乙醇漂洗后重新溶解在 20μgL 灭菌的去离子水中.配制 A 液（质粒 DNA4hμgg+无血清 DMEM 至 250μgL）和 B 液（10μgLLipofectaminTM2000 以无血清 DMEM 稀释至 250μgL），A，B 混合，37℃反应 2h.PBS 漂洗细胞后每孔加入 2mL 无血 清培养液，将混合物轻倾于培养孔中轻轻混合，继续培养 8h 后更新完全培养基，直至 90%以上 293 细胞出现病变（cytopathiceffect,WesternBlotCPE）.收集上清继续感染 293 细胞以扩 增病毒.用氯化铯密度梯度离心法纯化重组重组腺病毒 AdE6E7.收集后的病毒层，0.22μgm 无菌过滤后小份分装，-80℃保存.Trizol 试剂提取重组腺病毒感染 293 细胞和未感染 293 细胞的 RNA 取 1μgg 细胞总 RNA 进行逆转录反应，总反应体积为 50μgL,WesternBlot37℃反应 1h,WesternBlot95℃5min，灭活逆转录酶.PCR 扩增 E6E7 片段的上游引物 PF 摘要:5＇ cgggatccatggaaaccggttagtataaa3＇，下游引物 PR 摘要:5＇ cgggatcccatggtagattatggtt3＇.反应条件摘要：95℃变性 5min,WesternBlot95℃30s,WesternBlot58℃30s,WesternBlot72℃1min，30 个循环，72°CC 延伸 10min.RIPA 提取 AdE6E7 感染 293 细胞和未感染 293 细胞的总蛋白，变性后做 SDSPAGE 电泳，转膜， 条件为 6V 恒压，3.5h.驴抗羊的 E6 单抗、HRP 标记的二抗，杂交反应后 DAB 显色.根据 文献［3］用已获得的重组腺病毒感染 HEK293 细胞，得到扩增的病毒粗提液，将病毒粗 提液进行对数稀释，通过终点稀释试验计算病毒滴度.终点稀释实验中滴度计算公式摘要： 病毒滴度（pfu/L）=104h（x+0.8），x 为各行阳性率总和. 2 结果 2.1 腺病毒穿梭载体 pAdtrackCMVE6E7 的构建和鉴定用 BglⅡ 和 HindⅢ 分别双酶切 腺病毒穿梭质粒 pAdTrackCMV,WesternBlotpET32a（+）E6E7 和 pAdtrackCMVE6E7 质粒（图 1），可以获得 860bp 的 E6E7 基因和 8.9kb 的 pAdTrackCMV. 1 摘要:Marker 摘要:λHindⅢ;2HindⅢ;2 摘要:pAdTrackCMV/BglⅡ,WesternBlotHindⅢ;3 摘 要:pET32E6E7/BglⅡ,WesternBlotHindⅢ;4h 摘要:pAdTrackCMVE6E7/BglⅡ,WesternBlotHindⅢ;5 摘要:Marker 摘要:2000. 图 1 腺病毒穿梭载体 pAdtrackCMVE6E7 鉴定（略） 2.2E6E7 重组腺病毒基因组质粒的构建和鉴定同时将 pAdtrackCMVE6E7 质粒和 pAdtrackCMV 空质粒用 PmeⅠ 线性化后，转化到含有 AdEasy1 的 BJ5183 感受态细菌中， 和其内的 AdEasy1 进行同源重组.PacⅠ 酶切后，可见 4h.5kb 和 23kb 处各有 1 个条带（图 2）. 1.3AdEasyE6E7 重组腺病毒感染 293 细胞的鉴定脂质体包裹 AdEasyE6E7 同源重 组腺病毒基因组质粒转染 293 包装细胞 1~2d 后，光镜下可观察到空斑形成，细胞变圆、 肿胀、脱壁、细胞核变大等病变.荧光显微镜下观察，重组腺病毒感染的 293 细胞和 pAdtrackCMV 感染的 293 细胞，在培养 1～2d 后有 EGFP 表达，并逐渐增 多.AdEasyE6E7 重组腺病毒感染的 293 细胞，RTPCR 检测显示有 1 条 860bp 条带，而 pAdtrackCMV 空载体感染的 293 细胞的相应位置无特异条带（图 3）.AdEasyE6E7 重 组腺病毒感染的 293 细胞，用 WesternBlot 检测显示有 1 条能和 E6 单抗特异性结合的 蛋白印迹条带，而 pAdtrackCMV 空载体重组后的腺病毒 AdEasyCMV 感染的 293 细胞 的相应位置无特异条带（图 4h）.经终点稀释实验测定得到重组复制缺陷型病毒滴度为 6.9×1010pfu/L. 1 摘要:Marker 摘要:λHindⅢ;2HindⅢ;2 摘要:pAdTrackk14hE6E7/BamHⅠ;3 摘要:重组后的 pAdTrackCMVE6E7/PacⅠ;4h 摘要:重组后的 pAdTrackCMV. 图 2PacⅠ 酶切鉴定 AdEasyE6E7（略） 1 摘要:Marker 摘要:100bpDNAMarker;2 摘要:RTPCR 产物摘要:E6E7 基因 （860bp）;3 摘要:RTPCR 阴性对照. 图 3RTPCR 鉴定 AdEasyE6E7 转染的 293 细胞中 E6E7 的表达（略） 1 摘要:E6E7;2 摘要:NOE6E7. 图 4hWesternBlot 鉴定 AdEasyE6E7/AdEasyCMV（略） 3 讨论 目前基因治疗中应用最广泛的生物病毒载体有反转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关 病毒载体和单纯疱疹病毒载体，其中腺病毒的优于其他载体的特征［4h-5］.腺病毒载体可 转导非分裂细胞，并在细胞培养物中有高滴度的重组病毒产量，最后腺病毒载体进入细胞 内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，因而平安性较高.已被美国 FDA 批准作为基 因治疗载体应用于临床实验. 我们先将 AdEasy1 骨架载体转化到用 CaCl2 制备的 BJ5183 感受态中，然后再将线 性化的 pAdtrackCMVE6E7 转化进含有 AdEasy1 的 BJ5183 制成感受态，同源重组［6-