糖尿病与糖尿病肾病关系论文

【摘要目的摘要：探索二酰基甘油酰基转移酶 1（DGAT1)K378N 基因多态性和中国 人 2 型糖尿病(T2DM)T2DM))及糖尿病肾病(T2DM)DN)的关系.方法摘要：运用荧光偏振模板依靠的染料 掺入反应法（TDIFP）技术检测技术检测 DGAT1K378N 基因多态性在 71 例 T2DM) 患者［29 例糖 尿病肾病患者（DN＋组）和组）技术检测和 42 例糖尿病非肾病患者（DN－组）］和组）技术检测］和 45 例健康对照者中 的等位基因和基因型分布频率.结果摘要：KK，KN 和 NN 基因型在 T2DM) 组的分布分别为 摘要：42,40,12 例；DN＋组）和组摘要：14,11,4 例；DN－组）］和组摘要：22,14,6 例；正常对照 组摘要：13,23,9 例.①T2DMT2DM) 患者 DGAT1K378 等位基因频率(T2DM)66.0％)高于健康对照组 （54.4％）技术检测，但未达显著性水平；② DN＋组）和组和 DN－组）］和组 K378N 等位基因及基因型分布无 显著差异（P%26gt;0.05）技术检测.结论摘要：K378 等位基因频率在 T2DM) 患者组有升高，但 未见 DGAT1K378N 基因多态性和中国人 T2DM) 及 DN 发生的明显相关关系. 【糖尿病，2 型；糖尿病肾病；多态性，单核苷酸；二酰基甘油酰基转移酶 1；TDIFP 技术 0 引言 二酰基甘油酰基转移酶(T2DM)DGAT)是微粒体酶，催化甘油二酯和脂肪酰基辅酶 A 以共价 健结合，是三酰甘油（TG）技术检测合成的限速酶.近来有报道 DGAT1 缺陷小鼠可反抗饮食诱导 的肥胖、提高胰岛素及瘦素敏感性.胰岛素反抗是 2 型糖尿病（T2DM)）技术检测发病的重要原因， 而肥胖是 T2DM) 最主要的危险因素之一.DGAT1 基因可列为 T2DM) 病因学探究的候选基 因，我们应用了具有高敏感性和特异性的检测单核苷酸多态性（SNPs）技术检测方法荧光偏振模板 依靠的染料掺入反应法（TDIFP）技术检测［1,2］检测了该基因第 378 位赖氨酸到天门冬酰胺 （K378N）技术检测多态性在 T2DM) 患者和健康人中的分布，以明确其和 T2DM) 及 DN 的关联性. 1 材料和方法 1．1 材料 1.1.1 血样标本 2 型糖尿病患者（T2DM) 组）技术检测摘要：94 例 T2DM) 患者均系我院内分 泌科就诊患者，依 1999 年世界卫生组织（WHO）技术检测糖尿病诊断标准诊断.按其是否发生肾 病并发症分为两组摘要：①糖尿病肾病组（DN＋组）和组）技术检测29（男 15，女 14）技术检测例，年龄 （58.5±7.2）技术检测岁，病史 5~12a，多次尿白蛋白阳性，排除感染、高血压引起的尿蛋白.糖 尿病肾病常和糖尿病视网膜病变同时存在，若同时有尿蛋白但无糖尿病视网膜病变，则尿 蛋白不能排除为高血压造成，因而该组剔除了有尿蛋白无视网膜病变同时有高血压患者共 17 例.② 糖尿病非肾病组（DN-组）技术检测42（男 20，女 22）技术检测例，年龄（54.9±10.6）技术检测岁，病 史 3~10a，尿白蛋白阴性，因有糖尿病视网膜病变多已伴发肾脏改变，可能尚处于病变 早期而无临床表现，因而该组剔除了尿白蛋白阴性但同时有糖尿病视网膜等微血管病变患 者共 6 例.健康对照组（Control 组）技术检测摘要：随机取我院体检中心体检健康者 45（男 21， 女 24）技术检测例，年龄（48.5±13.1）技术检测岁，经检查排除糖尿病、高血压、高血脂、冠心病、肥 胖及肾病等，且均无糖尿病家族史.采集所有受检对象空腹静脉血样标本，EDTA 抗凝，提 取 DNA，另一管送常规生化检验. 1.1.2 主要试剂及仪器 dNTP，TaqDNA 聚合酶、pGEM)TEasy 载体系统购自 Promega 公司.核酸外切酶 I、虾碱性磷酸酶、AcycloDNA 聚合酶和荧光偏振检测仪 Victor2 购自 PerkinElmer 公司.荧光标记终止子 AcycloTerminatorsTM)（AcycloGTPR110/AcycloCTPTAM)RA）技术检测为 PerkinElmer 公司 专利产品.DNA 引物 5′CACACCCCACCTACCTGATGC3′CACACCCCACCTACCTGATGC3′CACACCCCACCTACCTGATGC3′及 5′CACACCCCACCTACCTGATGC3′CCTGGGGGCTGGGATGG3′CACACCCCACCTACCTGATGC3′；探针 5′CACACCCCACCTACCTGATGC3′CTTCTGGCAGAACTGGAA3′CACACCCCACCTACCTGATGC3′由上海博亚生物技 术有限公司合成. 1.2 方法 1.2.1DNA 引物及探针设计根据引物设计的基本原则，应用 DNAStar 软件，结合 TDIFP 反应的非凡要求设计引物及探针.引物和探针序列不能重叠，探针的 3′CACACCCCACCTACCTGATGC3′末端必须紧邻 待测变异基因位点.特异性寡核苷酸探针及和变异碱基对应互补末端掺入的特异碱基 GTP/ CTP 是基于 DGAT1 基因扩增片段内的序列及变异碱基设计的，扩增靶片段长度为 140bp（Fig1）技术检测. 1.2.2DNA 的提取及 PCR 扩增用标准酚/氯仿法由四周血白细胞内提取基因组 DNA.取 DNA 模板 5μLL，dNTP150μLmol/L，引物各 0.25μLmol/L，M)gCl22.0mmol/L,TaqDNA 聚合酶 16.67nkat，反应体系共 25μLl.PCR 条件摘要：95℃4min； 94℃30s，52℃40s，72℃30s，40 个循环；72℃5min，扩增靶片段 DNA.标本 DNA 经扩增后所得产物用 20g/L 琼脂糖凝胶电泳检测.将经回收、连接、转化、筛选、测序正确 的发生和未发生变异的质粒 DNA 作为阳性和阴性标准品. 1.2.3DGAT1K378N 基因多态性的检测鉴定采用 TDIFP 方法对扩增产物中 K378N 变 异碱基进行检测.首先消化处理摘要：虾碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ混合物和混合物和 PCR 产物 37℃孵育 2h，可分别降解 PCR 产物中残余的 dNTPs 和引物，避免对后续反应的干扰； 而后 80℃热处理 15min 灭活酶.以此产物为模板和探针结合，再以 AcycloGTPR110 和 AcycloCTPTAM)RA 这两种荧光标记终止子为底物，在 AcycloDNA 聚合酶及其缓冲液中 于 95℃2min,然后 95℃15s，50℃30s，25 个循环杂交延伸,最后 15℃延伸 10min，4℃保存.PCR 产物模板和探针互补杂交，和模板互补的游离荧光标记终止子 AcycloG/CTP 掺入到探针末端，荧光素分子量增加，在荧光偏振检测仪上分别检测 AcycloGTPR110（波长 535nm）技术检测和 AcycloCTPTAM)RA（波长 595nm）技术检测的荧光偏振 （FP）技术检测值,据两种荧光的 FP 值,推断变异碱基类型. 统计学处理摘要：正态分布资料用 x±s 表示，各组间基因型及等位基因频率比较采用 χ2 检验，组间均数比较采用 t 检验（方差不齐时用 t′CACACCCCACCTACCTGATGC3′检验）技术检测或方差分析，疾病危险因素分 析采用二分类 Logistic 回归，整个统计分析用 SSPS11.0 软件处理. 2 结果 2.1 临床特征 DN＋组）和组和 DN－组）］和和正常对照组的性别（Sex）技术检测、年龄(T2DM)Age)、体质指数 BM)I，均无显著差异(T2DM)P%26gt;0.05)，DN＋组）和组和 DN－组）］和的收缩压(T2DM)SBP)及舒张压(T2DM)DBP)水 平高于正常对照组(T2DM)P%26lt;0.05)，并且 DN+组收缩压高于 DN－组）］和组(T2DM)P %26lt;0.05,Tab1).表 1 各组临床特征比较（略）技术检测 2.2 生化特征 DN＋组）和组和 DN－组）］和和正常对照组的血胆固醇(T2DM)CHOL)、高密度脂蛋白 （HDL）技术检测等均无显著差异(T2DM)P%26gt;0.05)，DN＋组）和组和 DN－组）］和组的 TG 水平高于正常对照组 (T2DM)P%26lt;0.05,Tab2).表 2 各组生化指标特征比较（略）技术检测 2.3 反应体系及引物测试 PCR 扩增所有标本基因组 DNA 中 DGAT1 基因目的片断,显 示扩增片段长度为 140bp,无非特异扩增条带，和预期相符. 2.4TDIFP 方法检测 PCR 扩增产物消化后，和 DGAT1 基因特异探针及两种荧光标记 碱基混合反应，AcycloCTPTAM)RA 掺入，TAM)RAFP 值增高，对应 N378 等位基因； AcycloGTPR110 掺入，R110FP 值增高，对应 K378 等位基因；两者都有掺入时，为杂 和基因型.DN+，DN-，T2DM)，正常对照组基因型及等位基因频率经 χ2 检验符合 HardyWeinberg 遗传平衡定律(T2DM)P%26gt;0.05)，样本具有群体代表性.①T2DMT2DM) 患者 DGAT1K378 等位基因频率(T2DM)66.0％)和健康对照组（54.4％）技术检测比较未达显著性水平 （χ2=3.432,P=0.064,Tab3).②DN＋组）和组和 DN－组）］和组的 K378N 等位基因频率及基因型频 率无显著差异（P%26gt;0.05,Tab4).表 3T2DM) 组和正常对照组等位基因及基因型频率 比较（略）技术检测表 4DN+组和 DN-组等位基因及基因型频率比较（略）技术检测 2.5 用 Logistic 回归进行疾病危险因素分析以是否有 T2DM) 为因变量进行 Logistic 回 归分析，SBP（P=0.000）技术检测，TG（P=0.003）技术检测进入方程，提示 SBP（OR=1.122，95％CI 摘要:1.055～1.193）技术检测,TG 升高（OR=6.532，95％CI 摘 要:1.923～22.185）技术检测是 T2DM) 发生的危险因素. 3 讨论 DGAT 是 TG 合成的限速酶，包括 DGAT1 和 DGAT2 两种.DGAT1 的表达广泛，在 肾上腺皮质髓质、睾丸、小肠高表达，在甲状腺、胃、心、骨骼肌、肝中等量表达，而 DGAT2 表达较受限制［3］.已发现 DGAT1 缺陷小鼠可通过增加能量消耗反抗饮食诱导的 肥胖，组织 TG 水平降低，胰岛素及瘦素敏感性提高［4］.而过表达 DGAT 的胰岛 β 细胞 在高糖水平下培养 72h 后，糖刺激的胰岛素分泌明显受损［5］.DGAT 被认为和胰岛素反 抗密切相关，抑制该酶可能是治疗肥胖及糖尿病的新靶点.还有报道过表达 DGAT1 可减少 信号脂质(T2DM)DAG、磷脂酶 C、磷脂酶 A2 和膜脂质）技术检测而合成 TG，调节膜脂质和信号脂质的 合成，因而在调节细胞生长方面有重要功能［6］. SNPs 被目前认为是疾病临床表现的遗传基础.SNPs 的探究热点是启动子区的 SNPs 和 cSNPs 即及蛋白质编码区域内的 SNPs.cSNPs 又分同义 cSNPs 和非同义 cSNPs.非同 义 cSNPs 指碱基序列的改变可使以其为模板翻译的蛋白质序列发生改变，从而可能影响蛋 白质的功能，这种改变常是导致生物性状改变的直接原因.已有报道 DGAT1 基因启动子 C97T 变异和土耳其女性低体质量指数、高 HDLch 及低 DBP 有关［7］.但 Coudreau 等 ［8］探究则认为该变异和法国人肥胖无关.DGAT1 基因 SNPs 变异和糖尿病关系尚未见报 道.我们检索了美国国家生物技术信息中心 Entrez 的 SNP 数据库，检索到该基因的一个 cSNPs 变异 K378N 并进行了病例对照探究，T2DM) 患者 DGAT1K378 等位基因频率 (T2DM)66.0％)高于健康对照组（54.4％）技术检测，虽未达显著性水平；但不能否认该基因和糖尿病可 能存在关联.催化同样反应的 DGAT2，和 DGAT1 分属于不同的基因家族［9］，是否会补 偿由于 DGAT1K378N 基因多态性造成的异常.这有待 DGAT1 及 DGAT2 各自功能的进一 步阐明，以及基因变异和酶活性间的对应关系的探究.另外可能受到该基因其他多态性位点 的影响，如和 C97T 变异有无交互功能存在. 本探究还显示 DN＋组）和组和 DN－组）］和组 K378N 等位基因频率及基因型频率无显著差异， DGAT1 基因多态性和糖尿病肾病发生无关.Logistic 回归结果提示 TG 及 SBP 为糖尿病的 危险因素，因此可以从对 TG 代谢或对 SBP 有影响的众多候选基因中进行多基因筛查，这 将有助于糖尿病遗传学的探索. 【摘要目的摘要：利用 AdEasy 系统构建人乳头瘤 16(T2DM)HPV16)E6E7 基因重组腺病毒， 并通过 WesternBlot 方法检测 E6E7 蛋白的表达.方法摘要：将质粒 pET32a（+）技术检测E6E7 扩增、酶切获得 E6E7 片段插入腺病毒穿梭载体质粒 pAdTrackCM)V 的巨细胞病毒 （CM)V）技术检测启动子下游，构建重组穿梭载体 pAdTrackCM)VE6E7，线性化后和骨架载体 AdEasy1 在细菌 BJ5183 内同源重组得到腺病毒质粒 pAdE6E7，经人胚肾 293 细胞包装 后得到复制缺陷型重组腺病毒 AdE6E7；用包装后的病毒上清再次感染 293 细胞，提取细 胞中的蛋白，通过 WesternBlot 方法检测 E6E7 蛋白的表达.结果摘要：连接、重组后通 过酶切和测序法筛选出 pAdE6E7；经人胚肾 293 细胞包装，3d 后观察到绿色荧光蛋白 （GFP）技术检测明显表达，氯化铯梯度离心纯化最终获得 6.9×1010pfu/L 滴度的重组病毒；用 该滴度的 AdE6E7 重新感染人胚肾 293 细胞 3d 后，提取细胞蛋白,WesternBlot 检 测,E6E7 有明显表达.结论摘要：利用新型腺病毒载体 AdEasy 系统可在短期内制备同时表 达 GFP 和 E6E7 的重组腺病毒 AdE6E7. 【人类乳头状瘤病毒，人；腺病毒科 0 引言 高危型人类乳头瘤状病毒（HPV16,18）技术检测和宫颈癌的发病密切相关［1］.HPV 编码了 多种癌蛋白（E1,E5,E6,E7 等）技术检测其中以 E6,E7 为主，他们都能诱导细胞永生化，引起细胞 的永生.复制缺陷型重组腺病毒(T2DM)replicationdeficientrecombinantadenovirus)是目前 基因治疗最常用的载体之一［2］，我们利用 AdEasy 系统构建了外源插入 HPV16E6E7 片段的复制缺陷性腺病毒 AdE6E7，并观察了 AdE6E7 感染 293 细胞，为探究 HPV16E6E7 在女性宫颈癌中的功能提供新的手段. 1 材料和方法 1.1 材料穿梭质粒 pAdTrackCM)V，骨架质粒 pAdEasy1，仅插入 GFP 的对照重组腺 病毒质粒 pAdGFP，大肠杆菌 BJ5183 由重庆医科大学肝病探究所惠赠；293 细胞、 E.coli,DH5a 由本实验室保存.pET32a（+）技术检测E6E7 载体已构建成功.PmeⅠ,PacⅠ 限制性内 切酶购自基因公司；BglⅡ,HindⅢ 限制性内切酶、连接试剂盒、DNA 小量胶回收纯化试剂 盒、质粒提取试剂盒均为大连宝生物工程有限公司产品；LipofectaminTM)2000 脂质体 转染试剂盒购自 Roche 公司，DM)EM) 培养基及胎牛血清购自 Hyclon 公司；蛋白 M)arker 购自 Tiangene 公司；驴抗鼠的 E6 单克隆抗体购自 SantaCruz 公司；辣根过氧化物酶标 记羊抗鼠的 E6 二抗及 DAB 显色系统购自北京中山公司. 1.2 方法 BglⅡ 和 HindⅢ 分别双酶切腺病毒穿梭质粒 pAdTrackCM)V 和 pET32a（+）技术检测E6E7，凝胶回收 E6E7 片段和线性化的 pAdTrackCM)V，连接 （16℃,8h）技术检测，转化 DH5a 感受态细菌，在卡那酶素抗性的 LB 平板上培养过夜，挑选转 化的菌落，提取质粒，BglⅡ 和 HindⅢ 双酶切鉴定阳性克隆，同时送上海生物工程公司测 序分析.提取 pAdtrackCM)VE6E7 质粒，取 1μLg 用 PmeⅠ 线性化，胶回收线性化的 pAdtrackCM)VE6E7 质粒，转化到含有腺病毒基因组质粒 AdEasy 的 BJ5183 感受态细胞 中［3］，在卡那酶素抗性的 LB 平板上培养 16～24h，挑选较小的菌落培养，抽提质粒， 琼脂糖凝胶电泳初筛重组体，再用 PacⅠ 酶切鉴定.PacⅠ 线性化 AdE6E7，乙醇、醋酸钠沉 淀，700mL/L 乙醇漂洗后重新溶解在 20μLL 灭菌的去离子水中.配制 A 液（质粒 DNA4μLg+无血清 DM)EM) 至 250μLL）技术检测和 B 液（10μLLLipofectaminTM)2000 以无血清 DM)EM) 稀释至 250μLL）技术检测，A，B 混合，37℃反应 2h.PBS 漂洗细胞后每孔加入 2mL 无血 清培养液，将混合物轻倾于培养孔中轻轻混合，继续培养 8h 后更新完全培养基，直至 90%以上 293 细胞出现病变（cytopathiceffect,CPE）技术检测.收集上清继续感染 293 细胞以扩 增病毒.用氯化铯密度梯度离心法纯化重组重组腺病毒 AdE6E7.收集后的病毒层，0.22μLm 无菌过滤后小份分装，-80℃保存.Trizol 试剂提取重组腺病毒感染 293 细胞和未感染 293 细胞的 RNA 取 1μLg 细胞总 RNA 进行逆转录反应，总反应体积为 50μLL,37℃反应 1h,95℃5min，灭活逆转录酶.PCR 扩增 E6E7 片段的上游引物 PF 摘要:5＇ cgggatccatggaaaccggttagtataaa3＇，下游引物 PR 摘要:5＇ cgggatcccatggtagattatggtt3＇.反应条件摘要：95℃变性 5min,95℃30s,58℃30s,72℃1min，30 个循环，72°CC 延伸 10min.RIPA 提取 AdE6E7 感染 293 细胞和未感染 293 细胞的总蛋白，变性后做 SDSPAGE 电泳，转膜， 条件为 6V 恒压，3.5h.驴抗羊的 E6 单抗、HRP 标记的二抗，杂交反应后 DAB 显色.根据 文献［3］用已获得的重组腺病毒感染 HEK293 细胞，得到扩增的病毒粗提液，将病毒粗 提液进行对数稀释，通过终点稀释试验计算病毒滴度.终点稀释实验中滴度计算公式摘要： 病毒滴度（pfu/L）技术检测=104（x+0.8）技术检测，x 为各行阳性率总和. 2 结果 2.1 腺病毒穿梭载体 pAdtrackCM)VE6E7 的构建和鉴定用 BglⅡ 和 HindⅢ 分别双酶切 腺病毒穿梭质粒 pAdTrackCM)V,pET32a（+）技术检测E6E7 和 pAdtrackCM)VE6E7 质粒（图 1）技术检测，可以获得 860bp 的 E6E7 基因和 8.9kb 的 pAdTrackCM)V. 1 摘要:M)arker 摘要:λHindⅢ;2HindⅢ;2 摘要:pAdTrackCM)V/BglⅡ,HindⅢ;3 摘 要:pET32E6E7/BglⅡ,HindⅢ;4 摘要:pAdTrackCM)VE6E7/BglⅡ,HindⅢ;5 摘要:M)arker 摘要:2000. 图 1 腺病毒穿梭载体 pAdtrackCM)VE6E7 鉴定（略）技术检测 2.2E6E7 重组腺病毒基因组质粒的构建和鉴定同时将 pAdtrackCM)VE6E7 质粒和 pAdtrackCM)V 空质粒用 PmeⅠ 线性化后，转化到含有 AdEasy1 的 BJ5183 感受态细菌中， 和其内的 AdEasy1 进行同源重组.PacⅠ 酶切后，可见 4.5kb 和 23kb 处各有 1 个条带（图 2）技术检测. 1.3AdEasyE6E7 重组腺病毒感染 293 细胞的鉴定脂质体包裹 AdEasyE6E7 同源重 组腺病毒基因组质粒转染 293 包装细胞 1~2d 后，光镜下可观察到空斑形成，细胞变圆、 肿胀、脱壁、细胞核变大等病变.荧光显微镜下观察，重组腺病毒感染的 293 细胞和 pAdtrackCM)V 感染的 293 细胞，在培养 1～2d 后有 EGFP 表达，并逐渐增 多.AdEasyE6E7 重组腺病毒感染的 293 细胞，RTPCR 检测显示有 1 条 860bp 条带，而 pAdtrackCM)V 空载体感染的 293 细胞的相应位置无特异条带（图 3）技术检测.AdEasyE6E7 重 组腺病毒感染的 293 细胞，用 WesternBlot 检测显示有 1 条能和 E6 单抗特异性结合的 蛋白印迹条带，而 pAdtrackCM)V 空载体重组后的腺病毒 AdEasyCM)V 感染的 293 细胞 的相应位置无特异条带（图 4）技术检测.经终点稀释实验测定得到重组复制缺陷型病毒滴度为 6.9×1010pfu/L. 1 摘要:M)arker 摘要:λHindⅢ;2HindⅢ;2 摘要:pAdTrackk14E6E7/BamHⅠ;3 摘要:重组后的 pAdTrackCM)VE6E7/PacⅠ;4 摘要:重组后的 pAdTrackCM)V. 图 2PacⅠ 酶切鉴定 AdEasyE6E7（略）技术检测 1 摘要:M)arker 摘要:100bpDNAM)arker;2 摘要:RTPCR 产物摘要:E6E7 基因 （860bp）技术检测;3 摘要:RTPCR 阴性对照. 图 3RTPCR 鉴定 AdEasyE6E7 转染的 293 细胞中 E6E7 的表达（略）技术检测 1 摘要:E6E7;2 摘要:NOE6E7.