亚硒酸钠对大鼠肾小球系膜细胞表达论文

【摘要目的摘要：观察亚硒酸钠对大鼠肾小球系膜细胞系 HBZY1 表达 p38 丝裂原活 化蛋白激酶（p38MAPK）和单核细胞趋化蛋白和单核细胞趋化蛋白 1(MCP1)MCP1)的影响，从而探究硒在防治糖尿 病肾病（DN）和单核细胞趋化蛋白中的功能机制.方法摘要：分别以高葡萄糖、高胰岛素、过氧化氢和糖基化 终末产物（AGEs）和单核细胞趋化蛋白刺激 HBZY1 细胞；先给予 100nmol/L 亚硒酸钠预处理后，再分别以 上述 4 种刺激因素孵育 HBZY1 细胞，分别检测 HBZY1 细胞 p38MAPK 和 MCP1 的表达 并比较.结果摘要：4 种刺激因素均可作为独立因素，导致 HBZY1 细胞 p38MAPK 和 MCP1 表达量增加；亚硒酸钠能抑制上述 4 种因素所致的 p38MAPK 和 MCP1 的表达.结 论摘要：亚硒酸钠通过抑制 p38MAPK 和 MCP1 在 HBZY1 细胞的表达,从而有效防治 DN 的发生发展，表明硒在 DN 的防治过程中发挥积极功能. 【亚硒酸钠；p38 丝裂原活化蛋白激酶；单核细胞趋化蛋白 1；系膜细胞；糖尿病肾 病 【中图号 R587.24 0 引言 近年来国外探究表明单核细胞趋化蛋白 1(MCP1)monocytechemoattractantprotein1，MCP1)和糖尿病肾病 （diabeticnephropathy,DN）和单核细胞趋化蛋白有密切关系［1］.p38MAPK 是细胞信号传递的交汇点或 共同通路［2-3］，但它在 DN 发生中的功能及其和 MCP1 关系仍不十分清楚；硒是机体 必需微量元素之一，其缺乏可加剧 DN 的氧化应激，并可产生拟高血糖病理状态，从而加 剧 DN 的发生发展［4］.但其是否功能于 p38MAPK 和 MCP1 国内外未见文献报道.我们分 别给予高葡萄糖(MCP1)HG)、高胰岛素(MCP1)HI))、过氧化氢(MCP1)H2O2)和糖基化终末产物(MCP1)AGEs)孵育 HBZY1 细胞，观察 HBZY1 细胞 p38MAPK 和 MCP1 的表达以及亚硒酸钠对 HBZY1 细胞 p38MAPK 和 MCP1 表达的影响.从而明确二者在 DN 形成中的功能及硒在防治 DN 中的功 能机制. 1 材料和方法 1.1 材料大鼠肾小球系膜细胞系（HBZY1，中国典型培养物保藏中心 CCTCC）和单核细胞趋化蛋白；新 生牛血清、RPMI)1640 培养液、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 I)gG（二抗）和单核细胞趋化蛋白（北京中山生 物技术有限公司）和单核细胞趋化蛋白；亚硒酸钠(MCP1)KarolinskaI)nstitute 赠予)；柱离心式总 RNA 抽提试剂盒、 RTPCR 两步法试剂盒、PCR 相对分子量标准（TaKaRa 公司）和单核细胞趋化蛋白；PCR 引物合成（上海博 亚生物技术有限公司）和单核细胞趋化蛋白，蛋白质相对分子量标记物（BioRad 公司）和单核细胞趋化蛋白；磷酸化 p38MAPK 兔多抗（(MCP1)Promega 公司). 1.2 方法 1.2.1 细胞系 HBZY1 的培养 HBZY1 细胞常规培养于 200mL/LRPMI)1640 培养液中， 培养条件为 37℃，饱和湿度 50mL/LCO2，每 2~3 日用 0.2g/L 乙二胺四乙酸（EDTA）和单核细胞趋化蛋白 消化传代.HBZY1 细胞长满培养瓶底 40%后分为 9 组，以无血清培养液饥饿 24h,然后按 实验分组加入刺激（及干预）和单核细胞趋化蛋白因素. 1.2.2 体外制备 AGEs 参考文献［5］，按牛血清白蛋白 （bovineserumalbumin,BSA）和单核细胞趋化蛋白50g/L，和葡萄糖 90g/L，0.5mmol/LEDTA 及 0.2mmol/LPBS（pH7.4）和单核细胞趋化蛋白混匀后过滤除菌，37℃恒温培养箱卵孵育 60d.0.1mol/ LPBS（pH7.4）和单核细胞趋化蛋白中透析 48h，测定蛋白含量及荧光强度，分装后存于-80℃冰箱保存备用. 1.2.3 实验分组分别以一定浓度 HG,HI),H2O2 和 AGEs 刺激细胞系 HBZY1 一定时间； 先给予亚硒酸钠 100nmol/L 预处理 HBZY1 细胞 48h 后，再分别以上述 4 种刺激因素 （浓度、时间同前）和单核细胞趋化蛋白孵育 HBZY1 细胞，同时设对照组.分组情况如下摘要：①对照组摘要： 用等体积 PBS 培养细胞;②HGHG 组摘要：用 25mmol/L 葡萄糖刺激 HBZY1 细胞 72h;③HI) 组摘要：用 100nmol/L 胰岛素刺激 HBZY1 细胞 24h;④H2O2 组摘要：用 100μmol/mol/ LH2O2 刺激 HBZY1 细胞 1h;⑤AGEs 组摘要：用 100mg/LAGEs 刺激 HBZY1 细胞 6h;⑥ 亚硒酸钠+HGHG 组摘要：依次以 100nmol/L 亚硒酸钠和 25mmol/L 葡萄糖分别刺激 HBZY1 细胞 48h 和 72h;⑦ 亚硒酸钠+HGHI) 组摘要：依次以 100nmol/L 亚硒酸钠和 100nmol/L 胰岛素分别刺激 HBZY1 细胞 48h 和 24h;⑧ 亚硒酸钠+HGH2O2 组摘要：依次 以 100nmol/L 亚硒酸钠和 100μmol/mol/LH2O2 分别刺激 HBZY1 细胞 48h 和 1h;⑨ 亚硒酸 钠+HGAGEs 组摘要：依次以 100nmol/L 亚硒酸钠和 100mg/LAGEs 分别刺激 HBZY1 细胞 48h 和 6h. 1.2.4RTPCR 法检测 MCP1mRNA 表达以柱离心式总 RNA 抽提试剂盒提取细胞系 HBZY1 总 RNA，测定总 RNA 浓度，计算纯度，A260nm/A280nm 均在 1.8～2.0 之 间.MCP1 引物序列按文献［6］摘要：上游引物摘要： 5′ATCACCAGCAGCAGGTGTCCCAAAGAAGCT3′ATCACCAGCAGCAGGTGTCCCAAAGAAGCT3′ATCACCAGCAGCAGGTGTCCCAAAGAAGCT3′；下游引物摘要： 5′ATCACCAGCAGCAGGTGTCCCAAAGAAGCT3′AGAAGTGCTTGAGGTGGTTGTGGAAAAGAG3′ATCACCAGCAGCAGGTGTCCCAAAGAAGCT3′，扩增片段长度 258bp.βactinactin 引物 序列摘要：上游引物摘要：5′ATCACCAGCAGCAGGTGTCCCAAAGAAGCT3′TCCTCTGACTTCAACAGCGACACC3′ATCACCAGCAGCAGGTGTCCCAAAGAAGCT3′;下游引物摘要： 5′ATCACCAGCAGCAGGTGTCCCAAAGAAGCT3′TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGG3′ATCACCAGCAGCAGGTGTCCCAAAGAAGCT3′，扩增片段长度 228bp.以两步法 RTPCR 试剂盒 进行反转录扩增，扩增条件摘要：94℃变性 30s，55℃退火 1min,72℃延伸 1min,共 35 个循环，72℃最后延伸 7min.每次 PCR 反应至少重复 3 次.PCR 产物于 15g/L 琼脂糖 凝胶电泳，结果经图象分析系统扫描存图，并对目的条带进行密度分析. 1.2.5Westernblot 法检测 p38MAPK 蛋白表达培养的细胞系 HBZY1，经 4℃胞浆蛋 白提取液裂解，提取物在冰上孵育 2h，然后 12000g4℃离心 10min，沉淀加入 4℃预 冷核蛋白提取液，震荡混匀，冰浴 1h，再 12000g4℃离心 30min，取上清为核蛋白， 其蛋白浓度经考马斯亮蓝法定量.磷酸化 p38MAPK 表达量采用 Westernblot 法检测，核 蛋白中加入等体积 2×上样缓冲液煮沸 5min.进行 10mol/LSDSPAGE，将蛋白转至 PVDF 膜后用 5g/LBSA 室温下封闭 2h，分别用 1∶2000 抗磷酸化 p38MAPK 兔多抗 4℃孵育过 夜，用 PBS 充分洗涤，再用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 I)gG1∶5000，37℃孵育 1h，用 PBS 充分洗涤，DAB 显色试剂盒显色.结果经图象分析系统对目的条带进行扫描存图并进 行密度分析. 统计学处理摘要：资料采用 SAS8.0 进行统计分析，组间两两比较用非参数统计分析， P%26lt;0.05 即认为有统计学差异. 2 结果 2.1 细胞系 HBZY1MCP1mRNA 表达细胞系 HBZY1MCP1mRNA 表达以 βactinactin 作 为内参照物调整后进行半定量分析，HG，HI)，H2O2 和 AGEs 均可作为独立因素使细胞 系 HBZY1MCP1mRNA 表达量均明显增加（P%26lt;0.01，表 1，图 1）和单核细胞趋化蛋白. 表 1 各组细胞系 HBZY1MCP1RTPCR 和磷酸化 p38MAPKWesternblot 半定量结果 （略）和单核细胞趋化蛋白 2.2 细胞系 HBZY1 磷酸化 p38MAPK 蛋白表达细胞系 HBZY1 磷酸化 p38MAPK 蛋 白表达以 βactinactin 作为内参照物调整后进行半定量分，HG，HI)，H2O2 和 AGEs 均可作为 独立因素激活 p38MAPK，使细胞系 HBZY1 磷酸化 p38MAPK 蛋白表达明显增加（P %26lt;0.01，表 1，图 2）和单核细胞趋化蛋白. 图 1RTPCR 法检测各组细胞系 HBZY1MCP1mRNA 和 βactinactinmRNA 表达（略）和单核细胞趋化蛋白 图 2Westernblot 法检测各组细胞系 HBZY1 磷酸化 p38MAPK 蛋白和 βactinactin 蛋白表 达（略）和单核细胞趋化蛋白 2.3 细胞系 HBZY1MCP1mRNA 表达细胞系 HBZY1MCP1mRNA 表达以 βactinactin 作 为内参照物调整后进行半定量分析.亚硒酸钠预处理后，再分别给予以上 4 种刺激因素孵育 细胞系 HBZY1，可见 MCP1mRNA 表达量分别较相应未经亚硒酸钠预处理各组明显减少 （P%26lt;0.01，表 1，图 1）和单核细胞趋化蛋白. 2.4 细胞系 HBZY1 磷酸化 p38MAPK 蛋白表达的影响 HBZY1 细胞磷酸化 p38MAPK 蛋白表达以 βactinactin 作为内参照物调整后进行半定量分析.先以亚硒酸钠预处理细胞系 HBZY1 后，再分别给予上述 4 种刺激因素刺激细胞系 HBZY1，可见磷酸化 p38MAPK 蛋 白表达量分别较相应未经亚硒酸钠预处理各组显著减少（P%26lt;0.01）和单核细胞趋化蛋白，但和对照组比 较仍有显著差异（P%26lt;0.01，表 1，图 2）和单核细胞趋化蛋白. 3 讨论 本探究结果显示 HG,HI),H2O2 和 AGEs 均可单独诱导细胞系 HBZY1，使其 MCP1mRNA 表达量明显增加.4 种刺激素诱导 HBZY1 细胞 MCP1mRNA 表达增加的机制， 结合文献和实验结果我们认为有以下几点摘要：①高糖有直接刺激 MCP1mRNA 及蛋白表 达增高的功能，该功能是 PKC，MAPKs 所介导，这可能是 DN 时肾小球中单核巨噬细胞 浸润的重要原因;②HG 大量 AGEs 可以和系膜细胞上的 AGEs 受体（RAGE）和单核细胞趋化蛋白相互功能，使 I)κBB 磷酸化而导致 NFκBB 激活；新近的探究表明［8］，AGEs 和 AGEs 受体（RAGE）和单核细胞趋化蛋白相 互功能可消耗细胞内谷胱甘肽，产生大量的氧自由基，从而导致细胞内信号传导改变，激 活核转录因子 NFκBB/AP1.同时 NFκBB 也是调节 RAGE 表达的一个启动子，它的位点 1 和 位点 2 的激活可使 RAGE 表达上调，NFκBB 的激活作为一种正反馈，又进一步促进了 AGEs 和 RAGE 的结合，导致 NFκBB 的持续活化，而活化的 NFκBB 可以上调 MCP1mRNA 和蛋白表达，从而在糖尿病所致肾脏损害中发挥重要功能;③ 过氧化氢可导致系膜细胞氧化 应激加剧，诱导细胞内 ROS 产生，从而迅速激活 NFκBB，上调 MCP1 表达，在 DN 发生发 展早期起重要功能［8］;④HI) 可能是通过激活 PKC，MAPKs 信号通路，引起系膜细胞氧 化还原状态发生变化，使细胞内 ROS 产生增加，导致 NFκBB 激活，从而使 MCP1 表达上 调. MCP1 介导糖尿病肾小球损伤.MCP1 不仅对血液中单核细胞有很强的趋化活性，也能 通过激活转录因子 NFκBB 和 AP1 来诱导非炎症细胞产生细胞因子和黏附分子，在诱导单核 细胞迁入内皮下间隙及渗入肾小球的过程中起重要功能［7-8］；同时，渗入到肾小球的 单核巨噬细胞反过来又刺激局部肾小球细胞，在巨噬细胞衍化生长因子如 PDGF 和 TGFβactin 等功能下导致系膜增生和细胞外基质聚集；此外通过炎症细胞因子功能，还可上调黏附分 子和趋化因子的分泌，从而进一步有利于白细胞渗入到肾小球［7］.近年来通过细胞实验 及对人和实验动物 DN 的探究发现，MCP1 在 DN 的发病机制中起重要功能. p38MAPK 可被多种细胞外刺激激活，导致细胞生长、增殖、分化和调控某些因子表 达［9-11］.本探究以糖尿病时存在的 4 种应激因素孵育大鼠肾小球系膜细胞系 HBZY1， 可见 p38MAPK 被激活，磷酸化表达增加. 硒是机体必需微量元素之一，是谷胱甘肽过氧化物酶的重要组成部分，缺硒可出现拟 高血糖症病理状态，引起白蛋白尿和肾小球硬化，从而加剧 DN 的发生发展；补充硒不仅 可预防氧化应激，而且可防止肾脏损伤［4,12］.本探究结果还显示，亚硒酸钠具有类似 p38MAPK 抑制剂所产生的功能，其机制可能是摘要：①通过保护系膜细胞免遭氧化损伤 而抑制 MCP1 的分泌；②通过抑制 p38MAPK 信号通路而抑制 MCP1 在系膜细胞的表达. 表明亚硒酸钠可能通过抑制 p38MAPK 而延缓 DN 的发生发展，但亚硒酸钠是否通过抗氧 化而抑制 p38MAPK 亦或功能于信号通路的其它环节尚需进一步深入探索，提示硒在防治 DN 发生发展过程中发挥着积极功能. 【摘要目的探索磁共振胰胆管成像（MRCP）和单核细胞趋化蛋白对十二指肠憩室的诊断价值。方法 2004 年 3 月～2005 年 2 月，使用 GESigna1.5TMR 扫描仪，对因上腹痛或伴有黄疸的 患者行 MRCP 检查，采用薄层（3mm 层厚，零间隔）和单核细胞趋化蛋白及厚层（50mm 层厚）和单核细胞趋化蛋白成像，在观 察胰胆管的同时，着重观察十二指肠及其四周结构，以期发现憩室或其他病变。结果共发 现 6 例十二指肠憩室，男 1 例，女 5 例；年龄 53～74 岁，平均 65 岁。所有憩室均位于 十二指肠降段和胰头之间。6 例中 2 例显示胆总管下段受压绕行，伴有胆总管及胰管的不 同程度扩张，2 例合并胆总管下端结石，1 例合并胆总管下段炎性狭窄，另 1 例较大憩室 因压迫胰头区而致胰胆管扩张。所有病例均经十二指肠镜检查证实。在 MRCP 图像上，十 二指肠憩室表现为一端连于十二指肠，另一端为游离的盲袋样结构，其形态及信号均类似 于十二指肠。3 例憩室内可见散在气泡影或气—液平面，以横轴位 T2WI) 显示较佳。1 例 较大憩室呈盘曲状，轴位像上呈多囊样改变，增强扫描囊壁和十二指肠壁呈同等强化，囊 内容物无强化。结论 MRCP 对发现十二指肠憩室较为敏感，也非常准确，并能显示某些并 发症；缺点是难以显示黏膜溃疡及一般炎症；但由于其为无创性检查，简便易行，患者无 痛苦，故仍不失为一种较好的检查方法。 【胰胆管成像；磁共振；十二指肠憩室；影像诊断 【AbstractObjectiveToevaluatethevalueofmagneticresonancecholangiopan creatography(MCP1)MRCP)indetectingduodenaldiverticulum.MethodsFromMarchof20 04toFeberuaryof2005，withGESigna1.5teslaMRequipment，MRCPwasperform edonaseriesofpatientswithabdominalpainortogetherwithjaundice.TheMRCPwas performedinboththinslice(MCP1)3mmthicknesswithnogap)andthickslice(MCP1)50mmthickn ess).I)nfilmreading，particularattentionwaspaidtotheobservationofduodenuma ndthesurroundedstructures，inadditiontotheobservationofcholangiopancreatic ducts，soastofindifanydiverticulumorotherabnormalitiesexist.Results6casesof duodenaldiverticulumwerefound.Amongthem，onewasmaleand5werefemale.T heagewasrangedfrom53to74years，withanaverageof65.Allofthediverticulawer esituatedbetweenthedescendingsectionofduodenumandthepancreatichead.2c aseswerecomplicatedbycholedocholith； onewithinflammatorystenosisofthecholedochoduct.I)nanothercase，thedivertic ulumwassolargethatthepancreaticheadwasheavilypressedandthecholangiopan creaticductsdilated.Allofthediverticulawereconfirmedbyendoscopicexaminatio ns.OnMRCPpictures，theduodenaldiverticulumpresentedasa“blindduct”，with oneendconnectedtothediverticulum，andtheotherendbeingfree.Theshapeands ignalintensityweresimilartotheduodenum.I)n3cases，gasbubbleorgasliquidlevelwasobservedinsideofthediverticulum，whichwasmoreclearlyshowed onT2WI).I)nonecase，thelargediverticulumwasconvolutedandappearedasmultipl ecystsinaxialimages，thewallofwhichhadasameenhancementasthatoftheduod enumonGdDTPAenhancingscan，whilethecontentsdidn’tenhance.ConclusionMRCPissensit iveandaccurateindetectingduodenaldiverticulum，andfurthermorecanshowso meofit’scomplications.Theshortcomingsofitincludetheweaknessindetectingthe ulcerandgeneralinflammationofthemucosa.Nevertheless，duetotheharmless， easinessandpainlesscharacteristics，MRCPshouldbeconsideredasagoodmetho dindetectingduodenaldiverticulumandit’scomplications. 【Keywordscholangiopancreatography；magneticresonance； duodenaldiverticulum；imagingdiagnosis 十二指肠憩室较为常见，多发生于十二指肠降段，以往主要以上消化道钡餐造影或十 二指肠镜检查诊断。2004 年 3 月～2005 年 2 月我院在对因上腹痛或伴有黄疸的患者行 磁共振胰胆管成像（MRCP）和单核细胞趋化蛋白检查时，诊断了 6 例十二指肠憩室，后均经十二指肠镜检查 证实，现报告如下。 1 资料和方法 1.1 一般资料 6 例中男 1 例，女 5 例。年龄 53～74 岁，平均 65 岁。均经十二指肠镜 检查证实。6 例患者均因上腹疼痛不适，2 例伴有黄疸而来院就诊，病史 3 天～6 个月。 1.2 扫描方法使用 GESigna1.5TMR 扫描仪，TORSOPA 线圈。常规行轴位 SET1WI)、快速自旋回波（FSE）和单核细胞趋化蛋白T2WI) 及脂肪抑制 T2WI)(MCP1)T2FS)。T1WI)TR360ms，TE10ms，2 次激励，矩阵 256×192，视野 36cm×36cm；T2WI)TR750ms，TE84.4ms，2 次激励，矩阵 320×256，视野 36cm×27cm，层厚 5mm，间隔 1mm。薄层 MRCP 取冠状位，快速恢复 FSE(MCP1)FRFSE) 序列，TR6666ms，TE137ms，层厚 3mm，间隔 0mm，3 次激励，矩阵 320×192。 厚层 MRCP 采用轴位像定位辐射状扫描，单次激发快速自旋回波（SSFSE）和单核细胞趋化蛋白序列， TR3594ms，TE1104ms，层厚 50～60mm，1 次激励，矩阵 320×256。检查前禁饮 水 4h。其中 1 例加做了 MR 增强扫描，行轴位 T1WI)、T1FS 和冠状位 T1WI)。造影剂为 先灵公司生产的马根维显，15ml 静脉注射。 2 结果 2.1MRI) 表现 6 例十二指肠憩室均表现为十二指肠降段和胰头之间的盲袋样结构，其 信号强度和十二指肠降段相同（图 1、图 2）和单核细胞趋化蛋白。在 MRCP 图像上均显示盲袋样结构，一端 连于十二指肠，另一端游离（图 3、图 4）和单核细胞趋化蛋白。3 例憩室内可见气泡影或气—液平面，以横轴 位 T2WI) 显示较佳（图 2、图 5）和单核细胞趋化蛋白。6 例中 2 例显示胆总管下段受压绕行，伴有胆总管及胰 管的不同程度扩张；2 例合并胆总管下端结石。1 例合并胆总管下段炎性狭窄。1 例较大憩 室呈盘曲状，轴位像呈多囊样改变（图 5）和单核细胞趋化蛋白，增强扫描囊壁和十二指肠壁呈同等强化（图 6）和单核细胞趋化蛋白。