牛磺酸对大鼠视网膜损伤论文

摘要摘要：目的观察饲料中添加牛磺酸对光化学损伤后大鼠光感受器细胞凋亡的影响， 并进一步从氧化应激基因 cfos 表达变化角度探索其防护机制。方法 70 只 SD 大鼠随机分 为对照组、牛磺酸组。分别喂饲标准饲料或添加 4％牛磺酸饲料喂饲 15dd 后接受 (3000±200)lxlx 持续 0，1，3，6，9，12,24h 光照，凋亡细胞原位末端标记法(TUNEL))lx 检测光感受器细胞凋亡情况并计算凋亡指数(AI))lx；RTPCR 法及免疫印迹法检测视网膜内 cfosmRNA 以及蛋白表达水平。结果感光细胞凋亡指数随光照时间延长逐渐增加，牛磺酸 组 AI) 显著低于对照组(P%26lt;005d)lx，其中光照 12h 牛磺酸组和对照组 AI) 分别为 (123±47)lx％和(324±62)lx％；视网膜 cfosmRNA 光照 1h 后一过性表达增高，牛磺酸组 较对照组低(P%26lt;005d)lx；光照后视网膜 cfos 蛋白表达逐渐升高，于 3h 达峰值，牛磺 酸组显著低于对照组(P%26lt;005d)lx。结论在视网膜光化学损伤条件下，牛磺酸可能通过抑 制视网膜 cfos 的转录及表达，阻断光感受器细胞凋亡转导从而保护视网膜。 摘要：牛磺酸；视网膜光化学损伤；凋亡细胞；cfos Effectsoftaurineoncfosexpressionofratretinaafterphotochemicaldamage Abstract 摘要： ObjectiveToobservetheeffectofdietarysupplementationwithtaurineonphotorece ptorapoptosisandfurtherinvestigatechangesofcfosexpressionofratretinaafterph otochemicaldamage.MethodsSeventyratswererandomlydividedintocontrolgrou p(Control)lxand4%taurinesupplementationgroup(Taurine)lx.Thesubjectswereexpo sedto(3000±200)lxlxtransmittedbysixcoldwhitelightsfor0,1,3,6,9,12,24h.Theapo ptoticphotoreceptorcellsweredetectedusingTUNEL)method;TotalRNAandprotein ofretinawereextracted;relativecfosmRNAlevelsweredeterminedusingRTPCRandcfosproteinlevelsweredetectedbywesternblotanalysis.ResultsWiththelightexposuretimeprolonged,apoptosisindex(AI))lxofp hotoreceptorcellswaselevated,amongwhichtheAI)of12hwere(12.3±4.7)lx%and(3 2.4±6.2)lx%inTaurineandcontrolgroup(P %26lt;0.05d)lx.ThecfosmRNAofratretinawastransientlyinducedafteronehourlightexposureanditwaslowerintaurinegroup(P %26lt;0.05d)lx;cfosproteinlevelincreasedafterthreehourexposureanditwaslowerin taurinegroup(P %26lt;0.05d)lx.ConclusionTaurinecanpartlyreducethetranscriptionandtranslationo fcfos,whichwouldfurtherinhibittheapoptosissignaltransductionandprotecttheratr etinafromphotochemicaldamage. Keywords 摘要：taurine;photochemicaldamage;apoptoticcell;cfos 视网膜是视觉形成的重要组织结构，若光照时间或光照强度等超过视网膜承受力，则 会导致光化学损伤〔1〕，损伤早期视功能减退，光感受器细胞丢失，后期内层神经元变 性坏死，最终导致失明〔12〕。近年探究认为，凋亡是视网膜光化学损伤中光感受器细胞 丢失的主要机制〔1,3〕，持续高强度光照使视网膜内自由基和脂质过氧化产物激增，同 时氧化应激基因 AP1 表达上调促进凋亡信号转导，且证实其亚单位 cfos 是必需调控因子。 牛磺酸和视网膜生长发育和功能维持关系密切，前期实验已证实，4％牛磺酸能有效保护 光化学损伤条件下的大鼠视网膜〔4〕。本探究拟进一步观察其对光感受器细胞凋亡的影 响，并从 cfos 表达变化角度探索防护机制。 1 材料和方法 11 实验动物及分组清洁级 SD 大鼠(第三军医大学第三附属医院动物中心)lx70 只，体重 15d0g 左右，雌雄各半。随机分为对照组、牛磺酸组，分别喂饲标准饲料或添加 4％牛磺 酸(北京世纪维他生物技术有限公司，纯品)lx饲料 15dd 后，各组 5d 只大鼠分别接受 (3000±200)lxlx 持续 0，1，3，6，9，12，24h 光照。 12 凋亡细胞的原位末端标记法(TUNEL))lx检测光感受器细胞凋亡情况大鼠光照后立即取 出眼球，4％多聚甲醛固定过夜，常规石蜡切片，TUNEL) 试剂盒(德国 Roche 公司)lx检测视 网膜光感受器细胞凋亡情况参照试剂说明书，计数 10 个油镜视野下每张切片 TUNEL) 阳性 细胞数，其和光感受器细胞总数比值为光感受器细胞凋亡指数(AI))lx。 13 视网膜总 RNA 提取及 RTPCR 大鼠光照后立即取出眼球，解剖显微镜下小心剥离 视网膜，参考 Trizol 试剂说明书常规提取总 RNA，核酸蛋白检测仪测定其含量和纯度。20℃保存备用。RTPCR 按照逆转录试剂盒说明书进行，以大鼠 βactinactin 为内参，上游引物 序列为 5d′GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3′GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3′GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3′，下游引物序列为 5d′GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3′GCCAGGATAGAGCCACCAAT-3′GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3′，退火温度为 5d5d4℃，产物长度为 684bp；cfos 上 游引物序列为 5d′GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3′GCCTTTCCTACTACCATTCC-3′GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3′，下游引物序列为 5d′GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3′ATCTTATTCCTTTCCCTTCG-3′GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3′，退火温度为 5d33℃，产物长度为 370bp。扩增条件 为 94℃5dmin40s，各退火温度 45ds，循环 32 次，72℃10min。2％琼脂糖凝胶电泳， Bio-Rad 凝胶成像分析系统扫描以及分析。PCR 特异条带以相对吸光度×面积(mm2)lx表示， 以各组的校正吸光度和其 βactinactin 校正吸光度的比值表示(V))lx。 14 免疫印迹法测定视网膜 cfos 蛋白表达情况大鼠光照后立即取出眼球，剥离视网膜， 常规方法提取总蛋白，L)owry 法定量。总蛋白(40μg)g)lx经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电 泳(SDSPAGE)lx(5d％积层胶、12％分离胶)lx后，采用 BioRad 半干转印仪将凝胶中的蛋白转 印至聚偏二氟乙烯(PV)DF))lx膜，利用 cfos 多克隆抗体(1 摘要：15d0 稀释，北京中杉生物制 剂公司)lx检测膜上蛋白。BioRad 凝胶成像分析系统分析相对表达量，以 0h 组蛋白表达量 为内参，其他各个时相点灰度值和内参比值为相对灰度值(A)lx。 15d 统计分析采用 SPSS100 统计软件进行方差分析。 2 结果 21 牛磺酸对光照后大鼠视网膜光感受器细胞凋亡的影响对照组光照 6h 后，发现棕褐 色 TUNEL) 阳性细胞散在分布于外核层(ONL))lx内部，即受损的多为视杆细胞，而牛磺酸组 光照 9h 后才开始出现阳性细胞，随光照时间延长，阳性感光细胞增多，光照 24h 后视网 膜内核层、节细胞层也出现大量阳性细胞(图 1)lx。光化学损伤后 AI) 随光照时间延长逐渐增 高，牛磺酸组光照 12hAI) 值(123±47)lx％显著低于对照组(324±62)lx％，其他时相点也显 著低于对照组(P%26lt;005d)lx。 A 摘要：对照组，光照 0h；B 摘要：对照组，光照 9h；C 摘要：牛磺酸组，光照 9h 图 1 牛磺酸对光化学损伤后大鼠视网膜光感受器凋亡的影响(TUNEL)，×400)lx（略） 22 牛磺酸对光照后大鼠视网膜 cfos 转录以及表达的影响 221 牛磺酸对光照后大鼠视网膜 cfosmRNA 表达的影响光照后对照组和牛磺酸组大 鼠视网膜 cfosmRNA 表达均出现一过性增高，且在光照 1h 达到峰值，随着光照时间延长 其表达逐渐降低，于 6h 光照后其表达量接近未光照水平(图 2)lx。利用灰度扫描计算 V) 值发 现，光照 1h 时牛磺酸组大鼠视网膜 cfosmRNA 较对照组表达低(P%26lt;005d)lx。 222 牛磺酸对光照后大鼠视网膜 cfos 蛋白表达的影响光照后 2 组动物视网膜 cfos 蛋 白表达逐渐增高，于光照 3h 达到峰值，随光照时间延长其表达量逐渐降低，光照 12h 其 表达量接近未光照时水平(图 3)lx。A 分析提示牛磺酸组 3h 蛋白表达相对量比对照组低(P %26lt;005d)lx。 D 摘要：对照组；T 摘要：牛磺酸组 图 2 不同光照时间对大鼠视网膜 cfosmRNA 表达的影响（略） D 摘要：对照组；T 摘要：牛磺酸组 图 3 不同光照时间对大鼠视网膜中 cfos 蛋白表达的影响（略） 3 讨论 视网膜光化学损伤后光感受器细胞丢失的机制尚存在一定的争议，但大部分探究者认 为，凋亡是光化学损伤以及其他视网膜变性疾病光感受器细胞丢失的主要机制〔3，5d〕。 本探究在前阶段证实，4%牛磺酸能有效保护持续高强度光照〔(3000±20)lxlx，24h〕条 件下大鼠视网膜基础上，结合凋亡细胞生化特征，采用 TUNEL) 法检测凋亡细胞。实验结 果提示，牛磺酸减少了光照不同时相点凋亡指数，和其他探究报道〔6，7〕牛磺酸具有抗 神经元凋亡功能相符。近年探究发现，AP1 是调控光感受器细胞凋亡的重要影响因子，其 亚基 cfos 是必需的调控因子〔3，8〕。AP1 参和了许多生理过程如细胞增殖、分化、死 亡及恶性转化等，脂多糖、氧化应激、紫外线等均能增加其活性，并通过调节靶基因转录 发挥功能〔7〕，其中，cjun／cfos 二聚体形式的 AP1 复合物生物活性最强〔6〕。光损 伤条件下 cfos(-／-)lx大鼠光感受器细胞几乎未丢失，以及大鼠、小鼠和 661W 光感受器细 胞短期光照后 cfosmRNA 表达一过性增高，均说明 cfos 在光诱导光感受器细胞凋亡中促 进凋亡功能〔3，8〕。本探究发现,牛磺酸组 cfosmRNA 以及蛋白表达峰值均比对照组低， 推测牛磺酸可能通过抑制 cfos 表达，导致整个 AP1 复合物减少，阻断凋亡信号转导，从 而有效保护光感受器细胞。文献报道，TauCl 能降低 F)L)S 细胞 AP1 活性，而牛磺酸不能 〔9〕。因此，牛磺酸可能通过捕捉次氯酸(HOCI))lx形成 TauC1，TauCl 才是牛磺酸的活性 形式，上述推论还需进一步证实。 摘要：单磷酸阿糖腺苷 Ara-AMPDNA 病毒慢乙肝 单磷酸阿糖腺苷(arabinofuranosyladeninemonophosphate,Ara-AMP)lx是阿糖腺 苷(Ara-A)lx的单磷酸化合物，是人工合成的嘌呤核苷类化合物。实验和临床均证实它能选择 性地抑制病毒 DNA 多聚酶(DNAP)lx和核糖还原酶，并能掺入病毒的核苷酸链抑制其延长， 达到抑制 DNA 病毒复制的目的。它能抑制多种 DNA 病毒，包括单纯疱疹病毒、带状疱疹 病毒、牛痘病毒、乙型肝炎病毒(HBV))lx以及多种动物疱疹病毒和少数致癌 RNA 病毒等。现 介绍近几年有关 Ara-AMP 药理和临床探究情况并重点介绍 Ara-AMP 治疗慢性乙型肝炎 (慢乙肝)lx的新进展。 一、药理学探究 (一)lx抗病毒机制 Ara-AMP 主要功能是抑制病毒 DNA 的合成。Ara-AMP 进入细胞后， 经过磷酸化生成阿糖腺苷二磷酸(Ara-ADP)lx及阿糖腺苷三磷酸(Ara-ATP)lx，其抗病毒活性 主要由 Ara-ATP 所引起，Ara-ATP 和脱氧腺苷三磷酸(dATP)lx竞争地结合到病毒 DNAP 上， 抑制了酶的活性及病毒 DNA 的合成。同时抑制病毒核苷酸还原酶的活性来抑制病毒 DNA 的合成，它还抑制病毒 DNA 末端脱氧核苷酸转移酶活性，使 Ara-AMP 掺入到病毒 DNA 中，并连结在 DNA 链 3′GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3′-OH 位置的末端，从而抑制了病毒 DNA 的合成。所以 Ara-AMP 既是病毒 DNAP 活性的抑制剂，又是病毒 DNA 合成的终止剂，双重抑制病毒的复制，有 效地达到抗病毒功能。 (二)lx药物代谢动力学 Ara-AMP 静脉点滴或肌内注射后，可被血液和组织中腺苷脱氨酶 代谢为阿糖次黄嘌呤(Ara-HX))lx，因此血液浓度很快下降。Ara-AMP 的峰时摘要：肌内注 射 3 小时，静脉点滴为 30 分钟。血浆半衰期(t1/2)lx为(0.14±0.05d)lx小时。Ara-AMP 在各 组织中浓度不同，在肝、肾、脾浓度最高，骨骼肌、脑内浓度低，脑脊液内的浓度为血浆 浓度的 35d%～5d0%以上。约 60%～80%的 Ara-AMP 以 Ara-HX) 的形式从尿排出或以 CO2 形式随呼吸排出。Ara-AMP 的药代动力学在正常人和慢乙肝患者中基本相同。 (三)lx药效学试验广州儿童医院病毒室以细胞培养进行药物抑制病毒试验结果说明抑制 DNA 病毒生长的最低有效浓度为 25dμg)g/ml，而对细胞最高无毒功能浓度为 5d00μg)g/ml， 药物选择指数为 20，效果及平安性均良好。 陈鸿珊［1］指出在 V)ero 细胞培养内有抑制疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型所致细胞病变的功能，型所致细胞病变的功能， 半数有效浓度为 30μg)g/ml,但对细胞毒性 Ara-AMP 比 Ara-A 小 3.33 倍，治疗指数可达 33.3 倍。Ara-AMP 对鸭肝炎病毒实验感染的治疗效果亦证实 Ara-AMP 有很好的抑制 DHBV)DNAP 功能，但停药后有一定回升。 (四)lx毒性试验急性毒性探究摘要：静脉点滴 L)D5d0 为(1227±88.0)lxmg/kg,肌内注射 L)D5d0 为(315d5d±78.0)lxmg/kg。 长期毒性探究摘要：用 Beagle 种犬肌内注射 Ara-AMP15d～70mg/kg，共 6 个月， 其血常规、血生化、尿常规及心电图等指标均在正常范围。尸检结果未见异常的药物毒性 损伤，说明 Ara-AMP 在天天肌内注射 70mg/kg 以下不会出现严重毒性反应，此剂量为临 床平均剂量的 10 倍，故临床应用是平安的。 动物试验证实 Ara-AMP 无致畸、致突变功能，天天应用 300mg/kg 以下不会引起大 鼠致畸效应，高剂量对胚胎发育可能有一些影响。 二、临床应用 (一)lx局部应用治疗 HSV) 角膜炎、角膜创伤及 CMV) 视网膜炎有效，局部用于生殖器疱 疹和唇疱疹等疾病亦有效。 (二)lx全身应用治疗 HSV) 脑炎、新生儿 HSV) 感染、带状疱疹、CMV) 感染、水痘及 EBV) 感染有效。 (三)lx治疗 HBV) 感染体外及动物体内试验对乙肝病毒的复制有一定的抑制功能，能使 HBeAg 阴转或 DNAP 下降或消失。 临床探究已进行了多年，取得了较好的临床疗效。1980 年 Wellers［2］报告应用 Ara-AMP 治疗慢乙肝 6 例，天天静脉点滴或肌内注射 Ara-AMP10～15dmg/kg，用 7～ 14 天后 DNAP 下降，但停药后又回升。1982 年他应用同法治疗 8 例慢乙肝患者，结果所 有患者停药时 DNAP 均下降，停药后 5d 例回升，3 例用小剂量维持一段时间，DNAP 持续 下降。Trepo［3］对 37 例慢乙肝患者进行随机对照探究，Ara-AMP 天天 5d～10mg/ kg，共 28 天，治疗结束时 HBeAg 或 DNAP 消失率治疗组为 5d5d%(10/18)lx，对照组为 26%(5d/19)lx。国外探究结果目前仍有分歧。Hoofnagle［4］总结了 6 篇 Ara-AMP 治疗 慢乙肝的结果，均系前瞻性随机对照探究。3 篇美国探究结果报告该药效果不好，而 3 篇 欧洲报告都证实治疗组 HBeAg 及 HBV)DNA 阴转率比对照组好，有统计学意义。目前 Ara-AMP 在欧洲仍广泛应用，他们采用中小剂量，短疗程，未见严重毒副功能，而美国因 用量大或疗程长，患者发生神经肌肉毒性功能常见，欧美疗效差异的原因不清，也许是人 种学上的原因［5d］。国内 1987 年组织对 Ara-AMP 进行临床多中心双盲对照治疗探究 ［6］。Ara-AMP 用法为第 1～5d 天天天静脉点滴 10mg/kg，第 6～28 天，天天肌内注 射 5dmg/kg。治疗结束时 HBeAg 阴转率为 38.1%，对照组为 7.3%，停药后 6 个月 10 例 HBeAg 阴转者中有 4 例又阳转，该探究未见明显毒副功能。1995d 年全国第二次 AraAMP 临床应用学术研讨会上共报告单独应用 Ara-AMP 治疗 382 例慢乙肝［7］，治疗结 束时 HBeAg 阴转率为 43.5d%(166/382)lx，HBV)DNA 阴转率为 41.5d%(132/318)lx，未见 严重毒副功能。国内采用中小剂量短疗程治疗慢乙肝取得了一定的抗 HBV) 疗效，未见严重 毒副功能，但停药后有反跳，远期疗效欠佳，国内探究结果和国外多数报告一致。 为了进一步提高 Ara-AMP 治疗慢乙肝的疗效，国内外学者进行了大量探索探究工作。 其中联合疗法取得了一定进展。国外有人采用 Ara-AMP 和干扰素联合治疗慢乙肝，1991 年 Trepo［3］报告 Ara-AMP 和干扰素联合疗法治疗慢乙肝阶段性总结认为取得了较好的 疗效，现正在深入探究中。干扰素能抑制肝脏的混合功能氧化酶系统(P-45d0)lx，故和 AraAMP 联用时，血清 Ara-AMP 浓度比单独应用时高，毒性亦可增加。Ara-AMP 联合干扰素 可以提高抗 HBV) 疗效，但毒副功能会增大，尤其是神经肌肉毒性，而且药费昂贵，国人难 以承受。因此，国内有人采用 Ara-AMP 联合免疫调节剂治疗慢乙肝并取得了初步效果。 1993 年仉洪田等［8］报告应用联合疗法治疗慢乙肝 106 例，并同期应用 Ara-AMP 单独 肌内注射治疗慢乙肝 35d 例为对照，Ara-AMP 第 1～5d 天天天肌注 10mg/kg,第 6～28 天 天天肌注 5dmg/kg，结果 Ara-AMP 加胸腺肽组(应用 Ara-AMP 的同时天天肌注胸腺肽 10mg，共用 28 天)lx和 Ara-AMP 加乙肝疫苗组(每 2 周肌内注射乙肝血源性疫苗 30μg)g， 共 6 次)lx较对照组抗 HBV) 疗效好。而激素撤除组疗效没有提高，副功能较大。经过 2 年多， 23 个省市 5d 千多例验证结果证实 Ara-AMP 联合免疫调节剂确能提高抗 HBV) 疗效 ［8，9］，并未增加毒副功能，其中 Ara-AMP 联合胸腺肽组疗效最好，治疗结束时 HBeAg 阴转率为 5d6.3%(448/885d)lx，HBV)DNA 阴转率为 5d9.7%(381/638)lx；随访 1 年 HBeAg 和 HBV)DNA 阴转率分别为 5d1.9%(27/5d2)lx和 42.3%(22/5d2)lx，将胸腺肽疗程延长 至 3 个月，抗 HBV) 远期疗效可进一步提高，治疗后一年 HBeAg 和 HBV)DNA 阴转率分别 为 62.1%(18/29)lx和 72.4%(21/29)lx。Ara-AMP 联合乙肝疫苗的疗效亦较好，治疗结束时 HBeAg 及 HBV)DNA 的阴转率分别为 5d0.7%(360/710)lx和 5d8.7%(297/5d06)lx，其中 30 例随访 1 年，其阴转率分别为 40.0%和 42.1%。 国内学者对 Ara-AMP 的剂量和疗程进行了大胆的探索探究。聂青和等［10］采用成 人天天肌内注射 0.4，28 天为 1 个疗程，共用 3 个疗程，治疗结束时 HBeAg 和 HBV)DNA 阴转率分别为 63.2%(24/38)lx和 5d1.2%(21/41)lx，对照组分别为 22.0%(8/31)lx 和 12.5d%(5d/40)lx，P 均＜0.01，治疗组 AL)T 复常率优于对照组(P＜0.01)lx。杨名宏等 ［11］采用 α-2b 干扰素 300 万 u，每周 3 次，用 3 个月，和 Ara-AMP(用 3 个疗程)lx合用 卡介苗进行对照探究，结果 HBeAg 阴转率(5d7.9%对 5d6.2%)lx及 HBV)DNA 阴转率(5d9.1%