乙型肝炎病毒C基因论文

【摘要目的摘要:构建乙型肝炎病毒(HBV)HBV))截短 C 基因和前 S1 基因重组原核表达质粒， 获得融合蛋白的表达并进行抗原性分析.方法摘要:PCR 扩增获得截短 C 基因片段和前 S1 基因，双酶切后克隆至原核表达质粒 pET28a，转化 E.coliDH5αα，酶切鉴定得阳性重组 质粒 pET28a 并测序；然后转化 E.coliBL21，IPTG 诱导融合蛋白表达,薄层扫描分析表达 蛋白组成；可溶性分析后用 Ni2+NTA 凝胶亲和层析柱纯化、透析并浓缩融合蛋白， WesternBlot 分析特异性和抗原性.结果摘要:成功构建了 HBV) 截短 C 基因和前 S1 基因融 合的原核表达质粒 pET28aCtpreS1，目的基因可高效表达，表达产物主要以包涵体形式 存在，Ni2+NTA 纯化可获得目的蛋白，纯化蛋白具有良好的抗原性和特异性.结论摘 要:HBV) 截短 HBcAg 和 preS1 抗原融合蛋白可高效表达并得到纯化，为探究新型乙肝疫 苗奠定了基础. 【乙型肝炎病毒；融合蛋白；原核表达；疫苗 0 引言 乙型肝炎病毒(HBV)hepatitisBvirus,HBV))导致的病毒性肝炎目前尚无十分有效的治疗办 法，疫苗接种是控制和预防乙型肝炎的重要手段，但部分人群对现有的疫苗不应答或低应 答而导致接种失败，因此需要研发新型 HBV) 疫苗.我们利用基因重组技术构建含截短 C 基 因和 preS1 基因联合的原核表达载体，在大肠杆菌中表达融合蛋白并进行纯化，初步分析 其免疫性和特异性，为比较不同来源的 HBV) 候选疫苗分子和深入探究 HBV) 新型疫苗奠定 基础. 1 材料和方法 1.1 材料 E.coliDH5αα 和 BL21 菌株由本实验室保存;pET28apET28a 质粒由范雄林博士惠赠;pET28a带 HBV) 截短 C 基因和 preS1 基因的质粒 pDE22CtpreS1w 由本实验室构建;pET28aTaqDNA 聚合酶、 限制性内切酶(HBV)TaKaRa 公司);pET28a胶回收试剂盒(HBV)上海华舜公司);pET28aT4DNA 连接酶(HBV)上海生物工程 公司);pET28aNi2+NTA 凝胶亲和层析柱(HBV)Qiagen 公司);pET28aHRP 标记羊人 IgG，DNA 分子标准和低 分子蛋白质标准(HBV)华美生物工程公司). 1.2 方法 1.2.1PCR 引物设计和合成根据 GenBank 中的 HBV)C 基因和前 S1 基因序列，利用 生物学信息软件设计其扩增引物,以扩增 C 基因编码蛋白 N 端 15α5α 个氨基酸的基因片段和 前 S1 全基因.上游引物 P1 摘要：5α′GCGGAATTCATGGACATTGACCCGTATAAAG3′,GCGGAATTCATGGACATTGACCCGTATAAAG3′GCGGAATTCATGGACATTGACCCGTATAAAG3′,,含 EcoRⅠ 酶切位点；下游引物 P2 摘要： 5α′GCGGAATTCATGGACATTGACCCGTATAAAG3′,GCGAAGCTTTTAACCCAGCCCGAATGCTCC3′GCGGAATTCATGGACATTGACCCGTATAAAG3′,，含 HindⅢ 酶切位点和终止码 TTA.交 上海生物工程公司合成. 1.2.2 目的基因的扩增以 pDE22CtpreS1w 质粒为模板进行 PCR 扩增，反应体系为 摘要：质粒（1∶100 稀释）5αμLL，10×Buffer5αμLL，10mmol/ LdNTPs4μLL，P1（100pmol/L）2μLL，P2（100pmol/L）2μLL，TaqDNA 聚合酶 2μLL， 用超纯水补至终体积 5α0μLL.反应条件摘要：预变性 94℃5αmin； 94℃1min，5α6℃5α0s，72℃1min,共进行 30 个循环，最后在 72℃延伸 10min.取 5αμLL 反应产物进行琼脂糖电泳分析. 1.2.3pET28aCtpreS1 重组质粒的构建及鉴定连接、转化、重组质粒鉴定均参照文献 ［1］进行，将酶切鉴定正确的重组质粒交由北京三博远志公司测序. 1.2.4 蛋白表达和可溶性分析自 DH5αα 中提取阳性重组质粒，转化大肠杆菌 BL21， 挑取单菌落（同时设空载体质粒转化的大肠杆菌 BL21 为对照），置 5αmLLB 培养液中 （含卡那霉素 5α0g／L），37℃振摇过夜，次日 1∶100 的稀释度加入 5αmLLB 培养液中 37℃振摇 3h 后，测定 A600nm 约 0.4～0.6 时加入 IPTG 至终浓度 1mmol/L，37℃继 续振摇 4～5αh，离心收菌.用 PBS(HBV)pH8.0)悬浮离心收集的细菌，加入溶菌酶至终浓度 0.1g/L，4℃放置 20min，超声破碎，4℃下 10000g 离心 10min，收集上清和沉淀.将 菌体沉淀、裂解上清、裂解沉淀和空质粒转化菌分别加入等体积的 2×样品缓冲液，沸水 中加热 5αmin，12000g 离心 5αmin，取上清，每孔 15αμLL 进行 SDSPAGE 电泳，电泳在恒 压下进行（浓缩胶中为 100V)，分离胶中为 120V)）.电泳结束后，将凝胶浸泡于考马斯亮 蓝染色液中染色 2h，然后用脱色液脱色至背景清楚.薄层扫描分析目的蛋白表达带占菌体 蛋白百分比. 1.2.5α 亲和层析法纯化表达蛋白参照 Qiagen 公司镍离子亲和层析柱(HBV)Ni2+NTA)操作 说明进行.首先离心收集 1L 诱导宿主菌，冰浴 15αmin；按 5αL/kg 湿菌的比例加入含 8mol/ L 尿素的 BufferB（pH8.0），室温下轻轻搅拌使细菌裂解至溶液清亮，4℃下 10000g 离心收集上清，弃去沉淀；将 1mLNi2+NTA 树脂悬浮液和一定量清亮裂解上清于室温轻 柔摇动混匀(HBV)100r/min 摇动 15α～60min)后，将其混合液装柱；依次用 BufferC（pH6.3）,BufferD（pH5α.9）,BufferE（pH4.5α）洗脱，分别收集洗脱液.取各 部分样品进行 SDSPAGE 分析. 1.2.6WesternBlot 检测表达蛋白将纯化蛋白进行 SDSPAGE 凝胶电泳，然后将蛋白 质进行电转移至 NC 膜上（滤膜孔径 0.22μLm，转移条件为恒流 100V)，1h）.用乙型肝炎 阳性患者抗 HbcAg，抗 preS1 阳性血清（来自西京医院检验科）作为一抗，HRP 标记羊 抗人的 IgG 作为二抗，DAB（0.6g／L）显色，至目的条带染色清楚时终止反应. 2 结果 2.1 重组表达质粒的鉴定阳性重组质粒酶切产物预期大小（约 630bp）处出现条带 （图 1）.序列测定结果和文献报道一致. 2.2 融合蛋白的表达和溶解形式分析经 SDSPAGE 电泳检测，在 Mr 约 24000 处有一 明显的条带，和预期的融合蛋白大小一致.该融合蛋白以包涵体形式存在于沉淀中，上清液 中几乎无诱导表达的融合蛋白.薄层扫描显示其占菌体蛋白的 40%（图 2）. 2.3 融合蛋白的大量表达及纯化目的蛋白在 BufferD（pH5α.9），BufferE（pH4.5α） 洗脱液中，扫描显示纯度在 90%以上（图 3）. 2.4 表达蛋白的 Westernblot 预期大小处可见条带染色清楚,纯化的蛋白很好地保持 了和 HBV) 阳性患者血清的结合活性（图 4）. 3 讨论 疫苗是预防 HBV) 感染的重要手段，但相当数量的接种者对现临床使用的疫苗无应答或 低应答，而为数众多的感染者需要有效的治疗，所以迫切需要新型 HBV) 疫苗. 抗原特异性 CTL 所介导的细胞毒功能在病毒感染的控制和痊愈过程中起核心功能［23］.多个 CTL 表位的疫苗探究策略是近年各类 HBV) 新型疫苗探究的热点.HBV) 核心 C 基因 在不同亚型间最为保守,在它编码的 180 多个氨基酸中，CTL 表位多位于第 15α0 位氨基酸 （aminoacid,AA）以前，其中 18～27 位 AA 为 HLAA0201 所限制，第 88～96 位 AA 被 HLAA11 所限制，第 141～15α0 位 AA 为 HLAAw68 和 HLAA31 分子所限制，此外第 75α～81 位 AA 或 72～88 位 AA 是很强的构像型 B 细胞表位，因此核心抗原是比较理想的 疫苗探究靶分子［4-5α］.在既往 HBV) 疫苗探究中人们大多选用 S 基因编码的蛋白，并辅以 CpG,IL2 等分子佐剂试图达到免疫目的，但效果并不理想［6-7］.而 preS1 基因编码蛋白 含有 HBV) 和肝细胞膜结合的位点，并且相当保守,肝细胞、B 细胞和 T 细胞均可表达针对 其第 21～47 位 AA 的受体，故前 S1 抗体是除表面抗体外又一重要的中和抗体［8］.因此 HBV) 的 C 基因和 preS1 基因已经成为近年来 HBV) 新型疫苗探究的重点［9］. 几乎所有新型 HBV) 疫苗如亚单位疫苗、DNA 疫苗、分枝肽合成疫苗、新载体疫苗或 植物转基因疫苗的前期探究工作中都需要候选分子高效表达,以便在体外评价疫苗候选分子 刺激细胞增殖的潜力和 CTL 杀伤效应,达到全面评价候选分子的目的［10-12］.而 HBV) 各 个基因片段原核表达难易程度不同，考虑到 C 基因原核表达难度低，本探究采用将截短 C 基因置于 preS1 基因前面的方式，构建了原核重组表达质粒并获得了高效表达.目的蛋白 纯化以后，Westernblot 进一步证实该浓缩蛋白可以和抗 HBcAg、抗 preS1 阳性患者血 清结合，具有很好的抗原性和特异性，可用于进一步的 HBV) 新型疫苗探究；和 Chen 等 ［9］采用经典的 preS1 基因在前、C 基因在后的表达方式所获取的同类蛋白相比，本探 究中蛋白表达量明显较高.在后续工作中，我们将选用新型的疫苗载体 BCG 运载候选疫苗 分子，进一步探究该蛋白在 CTL 免疫和体液免疫中的功能. 摘要摘要：目的观察饲料中添加牛磺酸对光化学损伤后大鼠光感受器细胞凋亡的影响， 并进一步从氧化应激基因 cfos 表达变化角度探索其防护机制。方法 70 只 SD 大鼠随机分 为对照组、牛磺酸组。分别喂饲标准饲料或添加 4％牛磺酸饲料喂饲 15αd 后接受 (HBV)3000±200)lx 持续 0，1，3，6，9，12,24h 光照，凋亡细胞原位末端标记法(HBV)TUNEL) 检测光感受器细胞凋亡情况并计算凋亡指数(HBV)AI)；RTPCR 法及免疫印迹法检测视网膜内 cfosmRNA 以及蛋白表达水平。结果感光细胞凋亡指数随光照时间延长逐渐增加，牛磺酸 组 AI 显著低于对照组(HBV)P%26lt;pET28a005α)，其中光照 12h 牛磺酸组和对照组 AI 分别为 (HBV)123±47)％和(HBV)324±62)％；视网膜 cfosmRNA 光照 1h 后一过性表达增高，牛磺酸组 较对照组低(HBV)P%26lt;pET28a005α)；光照后视网膜 cfos 蛋白表达逐渐升高，于 3h 达峰值，牛磺 酸组显著低于对照组(HBV)P%26lt;pET28a005α)。结论在视网膜光化学损伤条件下，牛磺酸可能通过抑 制视网膜 cfos 的转录及表达，阻断光感受器细胞凋亡转导从而保护视网膜。 摘要：牛磺酸；视网膜光化学损伤；凋亡细胞；cfos Effectsoftaurineoncfosexpressionofratretinaafterphotochemicaldamage Abstract 摘要： ObjectiveToobservetheeffectofdietarysupplementationwithtaurineonphotorece ptorapoptosisandfurtherinvestigatechangesofcfosexpressionofratretinaafterph otochemicaldamage.MethodsSeventyratswererandomlydividedintocontrolgrou p(HBV)Control)and4%taurinesupplementationgroup(HBV)Taurine).Thesubjectswereexpo sedto(HBV)3000±200)lxtransmittedbysixcoldwhitelightsfor0,1,3,6,9,12,24h.Theapo ptoticphotoreceptorcellsweredetectedusingTUNELmethod;pET28aTotalRNAandprotein ofretinawereextracted;pET28arelativecfosmRNAlevelsweredeterminedusingRTPCRandcfosproteinlevelsweredetectedbywesternblotanalysis.ResultsWiththelightexposuretimeprolonged,apoptosisindex(HBV)AI)ofp hotoreceptorcellswaselevated,amongwhichtheAIof12hwere(HBV)12.3±4.7)%and(HBV)3 2.4±6.2)%inTaurineandcontrolgroup(HBV)P %26lt;pET28a0.05α).ThecfosmRNAofratretinawastransientlyinducedafteronehourlightexposureanditwaslowerintaurinegroup(HBV)P %26lt;pET28a0.05α);pET28acfosproteinlevelincreasedafterthreehourexposureanditwaslowerin taurinegroup(HBV)P %26lt;pET28a0.05α).ConclusionTaurinecanpartlyreducethetranscriptionandtranslationo fcfos,whichwouldfurtherinhibittheapoptosissignaltransductionandprotecttheratr etinafromphotochemicaldamage. Keywords 摘要：taurine;pET28aphotochemicaldamage;pET28aapoptoticcell;pET28acfos 视网膜是视觉形成的重要组织结构，若光照时间或光照强度等超过视网膜承受力，则 会导致光化学损伤〔1〕，损伤早期视功能减退，光感受器细胞丢失，后期内层神经元变 性坏死，最终导致失明〔12〕。近年探究认为，凋亡是视网膜光化学损伤中光感受器细胞 丢失的主要机制〔1,3〕，持续高强度光照使视网膜内自由基和脂质过氧化产物激增，同 时氧化应激基因 AP1 表达上调促进凋亡信号转导，且证实其亚单位 cfos 是必需调控因子。 牛磺酸和视网膜生长发育和功能维持关系密切，前期实验已证实，4％牛磺酸能有效保护 光化学损伤条件下的大鼠视网膜〔4〕。本探究拟进一步观察其对光感受器细胞凋亡的影 响，并从 cfos 表达变化角度探索防护机制。 1 材料和方法 11 实验动物及分组清洁级 SD 大鼠(HBV)第三军医大学第三附属医院动物中心)70 只，体重 15α0g 左右，雌雄各半。随机分为对照组、牛磺酸组，分别喂饲标准饲料或添加 4％牛磺 酸(HBV)北京世纪维他生物技术有限公司，纯品)饲料 15αd 后，各组 5α 只大鼠分别接受 (HBV)3000±200)lx 持续 0，1，3，6，9，12，24h 光照。 12 凋亡细胞的原位末端标记法(HBV)TUNEL)检测光感受器细胞凋亡情况大鼠光照后立即取 出眼球，4％多聚甲醛固定过夜，常规石蜡切片，TUNEL 试剂盒(HBV)德国 Roche 公司)检测视 网膜光感受器细胞凋亡情况参照试剂说明书，计数 10 个油镜视野下每张切片 TUNEL 阳性 细胞数，其和光感受器细胞总数比值为光感受器细胞凋亡指数(HBV)AI)。 13 视网膜总 RNA 提取及 RTPCR 大鼠光照后立即取出眼球，解剖显微镜下小心剥离 视网膜，参考 Trizol 试剂说明书常规提取总 RNA，核酸蛋白检测仪测定其含量和纯度。20℃保存备用。RTPCR 按照逆转录试剂盒说明书进行，以大鼠 βactinactin 为内参，上游引物 序列为 5α′GCGGAATTCATGGACATTGACCCGTATAAAG3′,GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3′GCGGAATTCATGGACATTGACCCGTATAAAG3′,，下游引物序列为 5α′GCGGAATTCATGGACATTGACCCGTATAAAG3′,GCCAGGATAGAGCCACCAAT-3′GCGGAATTCATGGACATTGACCCGTATAAAG3′,，退火温度为 5α5α4℃，产物长度为 684bp；cfos 上 游引物序列为 5α′GCGGAATTCATGGACATTGACCCGTATAAAG3′,GCCTTTCCTACTACCATTCC-3′GCGGAATTCATGGACATTGACCCGTATAAAG3′,，下游引物序列为 5α′GCGGAATTCATGGACATTGACCCGTATAAAG3′,ATCTTATTCCTTTCCCTTCG-3′GCGGAATTCATGGACATTGACCCGTATAAAG3′,，退火温度为 5α33℃，产物长度为 370bp。扩增条件 为 94℃5αmin40s，各退火温度 45αs，循环 32 次，72℃10min。2％琼脂糖凝胶电泳， Bio-Rad 凝胶成像分析系统扫描以及分析。PCR 特异条带以相对吸光度×面积(HBV)mm2)表示， 以各组的校正吸光度和其 βactinactin 校正吸光度的比值表示(HBV)V))。 14 免疫印迹法测定视网膜 cfos 蛋白表达情况大鼠光照后立即取出眼球，剥离视网膜， 常规方法提取总蛋白，Lowry 法定量。总蛋白(HBV)40μLg)经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电 泳(HBV)SDSPAGE)(HBV)5α％积层胶、12％分离胶)后，采用 BioRad 半干转印仪将凝胶中的蛋白转 印至聚偏二氟乙烯(HBV)PV)DF))膜，利用 cfos 多克隆抗体(HBV)1 摘要：15α0 稀释，北京中杉生物制 剂公司)检测膜上蛋白。BioRad 凝胶成像分析系统分析相对表达量，以 0h 组蛋白表达量 为内参，其他各个时相点灰度值和内参比值为相对灰度值(HBV)A)。 15α 统计分析采用 SPSS100 统计软件进行方差分析。 2 结果 21 牛磺酸对光照后大鼠视网膜光感受器细胞凋亡的影响对照组光照 6h 后，发现棕褐 色 TUNEL 阳性细胞散在分布于外核层(HBV)ONL)内部，即受损的多为视杆细胞，而牛磺酸组 光照 9h 后才开始出现阳性细胞，随光照时间延长，阳性感光细胞增多，光照 24h 后视网 膜内核层、节细胞层也出现大量阳性细胞(HBV)图 1)。光化学损伤后 AI 随光照时间延长逐渐增 高，牛磺酸组光照 12hAI 值(HBV)123±47)％显著低于对照组(HBV)324±62)％，其他时相点也显 著低于对照组(HBV)P%26lt;pET28a005α)。 A 摘要：对照组，光照 0h；B 摘要：对照组，光照 9h；C 摘要：牛磺酸组，光照 9h 图 1 牛磺酸对光化学损伤后大鼠视网膜光感受器凋亡的影响(HBV)TUNEL，×400)（略） 22 牛磺酸对光照后大鼠视网膜 cfos 转录以及表达的影响 221 牛磺酸对光照后大鼠视网膜 cfosmRNA 表达的影响光照后对照组和牛磺酸组大 鼠视网膜 cfosmRNA 表达均出现一过性增高，且在光照 1h 达到峰值，随着光照时间延长 其表达逐渐降低，于 6h 光照后其表达量接近未光照水平(HBV)图 2)。利用灰度扫描计算 V) 值发 现，光照 1h 时牛磺酸组大鼠视网膜 cfosmRNA 较对照组表达低(HBV)P%26lt;pET28a005α)。 222 牛磺酸对光照后大鼠视网膜 cfos 蛋白表达的影响光照后 2 组动物视网膜 cfos 蛋 白表达逐渐增高，于光照 3h 达到峰值，随光照时间延长其表达量逐渐降低，光照 12h 其 表达量接近未光照时水平(HBV)图 3)。A 分析提示牛磺酸组 3h 蛋白表达相对量比对照组低(HBV)P %26lt;pET28a005α)。 D 摘要：对照组；T 摘要：牛磺酸组 图 2 不同光照时间对大鼠视网膜 cfosmRNA 表达的影响（略） D 摘要：对照组；T 摘要：牛磺酸组 图 3 不同光照时间对大鼠视网膜中 cfos 蛋白表达的影响（略） 3 讨论 视网膜光化学损伤后光感受器细胞丢失的机制尚存在一定的争议，但大部分探究者认 为，凋亡是光化学损伤以及其他视网膜变性疾病光感受器细胞丢失的主要机制〔3，5α〕。 本探究在前阶段证实，4%牛磺酸能有效保护持续高强度光照〔(HBV)3000±20)lx，24h〕条 件下大鼠视网膜基础上，结合凋亡细胞生化特征，采用 TUNEL 法检测凋亡细胞。实验结 果提示，牛磺酸减少了光照不同时相点凋亡指数，和其他探究报道〔6，7〕牛磺酸具有抗 神经元凋亡功能相符。近年探究发现，AP1 是调控光感受器细胞凋亡的重要影响因子，其 亚基 cfos 是必需的调控因子〔3，8〕。AP1 参和了许多生理过程如细胞增殖、分化、死