风湿性关节炎新疗法论文

Abdelaty 医师等回顾了有关类风湿性关节炎(RA)RA)的文献后指出，过去几十年来对 RA 免疫发病机制更多的了解，促进了更特异的新疗法的产生。非皮质类固醇抗炎药(RA)NSAID)) 的改进也对患者有益。本文报告了这些新疗法的重点。 一、抗肿瘤坏死因子(RA)TNF)[infliximab(cA2))[infliximab(cA2)infliximab(RA)cA2)疗法摘要： 1.药理功能 cA2 是由鼠抗人 TNF)[infliximab(cA2)－α 单克隆抗体(RA)mAb)的不同部位连接至人 IgG1κ 分子而构成的嵌合抗 TNF)[infliximab(cA2)－αmAb。它有两个基本的功能机制摘要：①和可溶性 TNF)[infliximab(cA2)－α 络合而使其失去生物活性并下调下游炎症事件。②和跨膜的 TNF)[infliximab(cA2)－α 结合，导致经 F)[infliximab(cA2)c 介导 的机制而使产生 TNF)[infliximab(cA2)－α 的细胞破坏，从而减少炎症细胞群。通过此二途径，均能阻滞 TNF)[infliximab(cA2)－α 对其他促炎细胞因子如 IL－1、IL－6、IL－8 和 GM－CSF)[infliximab(cA2) 的上调功能。另一机 制是通过滑膜和细胞内的吸附分子的下调而减少炎症细胞流入关节。 2.临床疗效在美国，cA2 用于 RA 正待批准。在首次 cA2 用于治疗 RA 的安慰剂对照 试验中，静脉输注(RA)IV))一次 cA210mg/kg 较 1mg/kg 的疗效高(RA)79％对 44％)，疗效维持 的中位期分别为 8 和 3 周。安慰剂组 12％有效。对复发者再给 cA210mg/kg，最多达 4 次，所有病例均获得有效控制，但 50％的患者有效期缩短。这被认为是人抗嵌合抗体 (RA)HACA)形成所致。另一首次安慰剂对照、双盲、长期探究中，纳入正在用小剂量甲氨蝶 呤(RA)MTX))治疗仍在活动期的 RA 患者，试验组不用或继续用 MTX)7.5mg/周，在第 1 天、 2、6、10 和 14 周时，分别接受 cA21、3 或 10mg/kgIV)，对照组接受安慰剂输注加 MTX)7.5mg/周，随访至第 26 周。结果呈剂量依靠性显著好转，10mg/kg 组中 60％显著 好转，许多患者疗效持续至 26 周，对照组 15％达 20％Paulus 有效标准(RA)根据症状，主客 观判定)。探究者认为 cA2 和 MTX) 的协同功能是由于 MTX) 减少了 HACA 的产生。 3.不良反应过敏反应如发热、寒颤、头痛、恶心、血管迷走神经反应和荨麻疹。21％ 发生感染，3％严重感染包括肺炎、皮肤感染和胆囊炎；安慰剂组分别为 11％和 2％，但 需指出，用药前感染率就高。8％患者产生抗双链 D)NA 抗体，仅 1 例发生系统性狼疮症状。 HACA 的产生是长期治疗的限制因素，调整剂量或伍用 MTX) 可能减少 cA2 的免疫原性。 4.适应证难治性 RA 患者。用法摘要：IV)，间隔最长 8 周。 二、人 TNF)[infliximab(cA2) 受体 p75－F)[infliximab(cA2)c 蛋白(RA)etanercept,ET) 1.药理功能 TNF)[infliximab(cA2)－α 和其同源分子 TNF)[infliximab(cA2)－β 相等地和 TNF)[infliximab(cA2) 细胞表面受体结合而介导它 们的生理和病理功能。有两个独特的 TNF)[infliximab(cA2) 受体即 p55 和 p75，此二型膜结合受体通过每 个分子的细胞外配体结合(RA)ligand_binding)部分的蛋白酶剪切而被转化为相应的可溶性 TNF)[infliximab(cA2) 受体(RA)sTNF)[infliximab(cA2)R)。sTNF)[infliximab(cA2)R 可抵销 TNF)[infliximab(cA2) 活性。健康人血循环中的 sTNF)[infliximab(cA2)R 水平为 1～2ng/ ml，而 RA 患者滑膜液内的 sTNF)[infliximab(cA2)R 可能要比之高 4～5 倍，可中和过量的 TNF)[infliximab(cA2)。ET 是由 2 个 p75 受体的细胞外部分和人 IgG1 的 F)[infliximab(cA2)c 段融合而成，可结合 2 个 TNF)[infliximab(cA2) 分子，且由于 F)[infliximab(cA2)c 而增加了循环半衰期，故被用以结合炎症部位过量的 TNF)[infliximab(cA2)。使 TNF)[infliximab(cA2) 不能和炎症靶细胞 的表面受体结合而失活。 2.临床疗效在一项Ⅱ期双盲、安慰剂对照的探究中，纳入Ⅱ期双盲、安慰剂对照的探究中，纳入期双盲、安慰剂对照的探究中，纳入 180 例 RA 患者，用 ET0.25、2 或 16mg/m2 皮下注射，每周 2 次，共 3 个月，用 50％美国风湿病学学会 (RA)ACR)有效率标准衡量，病的活动度显著下降，尤其在 57％用最大剂量的患者。最近在对 MTX) 疗效差的 RA 患者进行的Ⅲ期试验中，Ⅰ组联合用期试验中，Ⅰ组联合用组联合用 ET 和 MTX)，Ⅱ期双盲、安慰剂对照的探究中，纳入组单用 MTX)，共 6 个月，用 50％ACR 有效率标准评估，Ⅰ组联合用组有效率为 39％，Ⅱ期双盲、安慰剂对照的探究中，纳入组为 3％。Ⅰ组联合用组临床好转快， 疲惫等症状在 1～2 天内缓解，1～2 周内有客观进步。 3.不良反应患者耐受良好。最常见的不良反应为注射部位红斑或红斑加不适，不需治 疗，仅 1 例因此退出探究；还有轻度上呼吸道感染的咳嗽、鼻炎、鼻窦炎和咽炎。治疗组 和安慰剂组中有 5％产生抗双链 D)NA 抗体，但无狼疮的临床征象。1 例产生抗 ET 抗体。 对有隐匿的慢性感染如结核或丙型肝炎患者，所有 TNF)[infliximab(cA2) 抑制剂均应慎用。 4.适应证目前用于其他二线药无效的患者，用法摘要：25mg 皮下注射，2 次/周。 三、来氟米特(RA)leflunomide,LF)[infliximab(cA2)) 1.药理功能 LF)[infliximab(cA2) 为异恶唑衍生物，为一新的抗嘧啶抗风湿病情改善药(RA)D)MARD))，已被 证实有免疫调节性能。重点功能于自身反应性淋巴细胞，它很快被代谢为活性型 A771726 而抑制二氢乳清酸脱氢酶使核苷酸水平下降。淋巴细胞的活化需核苷酸库扩大 8 ～16 倍，故核苷酸的减少导致选择性自身反应性细胞的抑制。 2.临床疗效几项Ⅱ期双盲、安慰剂对照的探究中，纳入Ⅱ期双盲、安慰剂对照的探究中，纳入期探究观察不同剂量 LF)[infliximab(cA2) 的疗效和平安性，结果示每日 1 次 25mg 显著优于 10mg，二者均优于安慰剂。患者能很好耐受。一项Ⅱ期双盲、安慰剂对照的探究中，纳入双盲多中心探究中，358 例 活动性 RA 患者被随机分入①组，先服负荷量 LF)[infliximab(cA2)100mg/日共 3 日，使较快地达到稳态浓 度。以后 LF)[infliximab(cA2)20mg/日；②组，安慰剂；③组柳氮磺吡啶 2g/日。用 20％ACR 有效率标准 评估摘要：①组 56％、②组 21％、③组 50％，到达持续好转的平均时间分别为 7.3、10.1 和 8.3 周，①、③组平均持续好转为 17.7 和 17 周。在 6 个月治疗期间，LF)[infliximab(cA2) 减慢了 X) 线片所示病变进展，并改善了功能而无大的毒性功能。另有初步资料提示，MTX) 单药无效的患者，LF)[infliximab(cA2) 和 MTX) 伍用有协同功能。 3.不良反应 7％患者因不良反应而停用 LF)[infliximab(cA2)。最常见的不良反应有皮疹、过敏反应和胃 肠道(RA)GI)症状包括厌食、腹痛、恶心、呕吐、体重下降和可逆性脱发。有时有短暂的剂量 依靠性肝功能异常，减量后复常，有 2 例因此退出探究。患丙型肝炎或其他肝病者不宜用 LF)[infliximab(cA2)。据动物实验，LF)[infliximab(cA2) 可增加死胎或畸胎危险，故孕妇或将要怀孕者忌用。预备怀孕的妇女， 可服考来烯胺 8g，3 次/日，共 11 日，可快速清除体内的 LF)[infliximab(cA2)。 4.适应证在活动性 RA 患者，LF)[infliximab(cA2) 可用作 MTX) 的替代药，致血液病危险少。剂量摘要： 口服负荷量后，20mg/日。 四、ProsorbaA 蛋白柱 1.此装置已经 F)[infliximab(cA2)D)A 批准用于治疗 RA。A 蛋白是一些葡萄球菌株的成分，能和血循环 中络合了抗原的免疫球蛋白结合。Prosorbaa 蛋白柱用约 200mg 的 A 蛋白和一容积为 300ml 的聚碳酸酯容器内隋性的硅石基质共价结合，整个系统涂以 5000 单位的肝素。患 者通常在门诊分离性输血室内接受 2 小时的治疗，先用细胞分离器将患者血内细胞和血浆 分开，然后将血浆经 A 蛋白柱过滤，进行体外免疫吸附。 2.临床疗效一前瞻性、多中心、随机、双盲、假对照(RA)sham－confrolled)试验中，纳 入 109 例难治性 RA 患者，他们至少有 20 个压痛和 10 个肿的关节，治疗 1 次/周，共 12 周。在 19 或 20 周时，用 20％ACR 有效率标准评估，治疗组为 41.7％，对照组 15.6％ (RA)P=0.019)，两组 C 反应蛋白水平无差异，很多患者的改善超过 20％，平均关节改善数 ＞55％,平均改善期 37 周(RA)20～84 周)。 3.不良反应治疗时及其后有贫血、低血压、恶心、呕吐、疲惫、发热和关节痛加重。 正接受血管紧张素转换酶抑制剂(RA)ACEI)者为治疗的禁忌证，因 ACEI 抑制降解缓激肽的激 肽酶Ⅱ期双盲、安慰剂对照的探究中，纳入，从而使缓激肽增加而引起低血压、潮红甚至过敏反应。此法在过高凝固状态的患 者也禁用，因治疗时可发生凝血系统的一些激活。 4.适应证摘要：此法较为复杂，故主要用于其他一些疗法对之无效的中重度 RA 患者。 五、特异的环氧化酶 2 抑制剂，celecoxib(RA)CLB)和 rofecoxib(RA)RF)[infliximab(cA2)B) 1.药理功能 NASID) 的有效和不良功能都是通过由花生四烯酸转化为前列腺素、血栓烷 A2 和前列环素中的第一步所需的环氧化酶(RA)COX))的抑制。最近 COX) 的两个性质截然不同 的异构型 COX)－1 和 COX)－2 已被鉴定。COX)－1 基本上在血小板、胃粘膜及大多数组织 中表达，被认为在保持体内平衡功能包括胃和肾的完善方面起功能。而同功酶 COX)－2 主 要是被诱导的，因它是在对炎症介质、肿瘤启动子和生长因子应答时短暂表达，少量固有 的 COX)－2 在脑、子宫和肾中已被找到。常用的 NSAID) 抑制 COX)－1 和 COX)－2 二者而 很少有选择性。一般认为，它们的抗炎和止痛功能是通过抑制 COX)－2，而对 COX)－1 的 抑制和其胃毒性和出血有关。根据减少对胃肠的不良反应而不减抗炎功能的理论而开发的 CLB 是第一个被批准用于治疗 RA 的特异性 COX)－2 抑制剂。RF)[infliximab(cA2)B 只被批准用于骨关节炎 (RA)OT)和疼痛，正在等待 F)[infliximab(cA2)D)A 对它用于 RA 的评估。 2.临床疗效短期试验对患者总的情况、晨僵持续时间、压痛和疼痛关节数的减少来判 定，CLB 的抗炎功能和 NSAID) 萘普生相当。而胃肠道毒性则 CLB 低于萘普生。CLB 的另 一优点是较非选择性 NSAID) 引起的肾小球滤过率降低的发生率低。 3.不良反应 CLB 最常见的不良反应是头痛(RA)16％)，四周性水肿、眩晕和皮疹(RA)约 2％)，GI 的不良反应如恶心、消化不良和腹痛比安慰剂多，但比常用 NSAID) 仍少。COX) －2 抑制剂在体外减少前列环素的生物合成，后者是强有力的血小板抑制剂和血管扩张剂， 故对患冠心病或有心血管病和血栓形成危险者，建议选择 COX)－2 抑制剂和抗血小板制剂 伍用。因 CLB 有一磺胺链(RA)RF)[infliximab(cA2)B 无)，故对磺胺过敏者禁用。利福平降低 RF)[infliximab(cA2)B 的浓度 50％，故联用时需增加后者的剂量。又因 CLB 被 P450 系统代谢，故在用锂剂或氟康唑者 应注重 CLB 的体内浓度。和 MTX) 合用时 COX)－2 抑制剂可使前者浓度略升高，但一般无 临床重要性。 4.适应证有溃疡病史或有溃疡病或出血高危的 RA 患者的治疗，CLB 的剂量为口服 200mg2 次/日。 结论摘要：新疗法可改善很多 RA 患者的病情，ET 虽疗效最好，但在大多数患者仍留 有活动性病变，今后应着眼于联合用药方案的探究和寻找其他药物以达到＞70％有效率甚 至缓解。 【摘要目的摘要:构建乙型肝炎病毒(RA)HBV))截短 C 基因和前 S1 基因重组原核表达质粒， 获得融合蛋白的表达并进行抗原性分析.方法摘要:PCR 扩增获得截短 C 基因片段和前 S1 基因，双酶切后克隆至原核表达质粒 pET28a，转化 E.coliD)H5α，酶切鉴定得阳性重组 质粒 pET28a 并测序；然后转化 E.coliBL21，IPTG 诱导融合蛋白表达,薄层扫描分析表达 蛋白组成；可溶性分析后用 Ni2+NTA 凝胶亲和层析柱纯化、透析并浓缩融合蛋白， WesternBlot 分析特异性和抗原性.结果摘要:成功构建了 HBV) 截短 C 基因和前 S1 基因融 合的原核表达质粒 pET28aCtpreS1，目的基因可高效表达，表达产物主要以包涵体形式 存在，Ni2+NTA 纯化可获得目的蛋白，纯化蛋白具有良好的抗原性和特异性.结论摘 要:HBV) 截短 HBcAg 和 preS1 抗原融合蛋白可高效表达并得到纯化，为探究新型乙肝疫 苗奠定了基础. 【乙型肝炎病毒；融合蛋白；原核表达；疫苗 0 引言 乙型肝炎病毒(RA)hepatitisBvirus,HBV))导致的病毒性肝炎目前尚无十分有效的治疗办 法，疫苗接种是控制和预防乙型肝炎的重要手段，但部分人群对现有的疫苗不应答或低应 答而导致接种失败，因此需要研发新型 HBV) 疫苗.我们利用基因重组技术构建含截短 C 基 因和 preS1 基因联合的原核表达载体，在大肠杆菌中表达融合蛋白并进行纯化，初步分析 其免疫性和特异性，为比较不同来源的 HBV) 候选疫苗分子和深入探究 HBV) 新型疫苗奠定 基础. 1 材料和方法 1.1 材料 E.coliD)H5α 和 BL21 菌株由本实验室保存;pET28apET28a 质粒由范雄林博士惠赠;pET28a带 HBV) 截短 C 基因和 preS1 基因的质粒 pD)E22CtpreS1w 由本实验室构建;pET28aTaqD)NA 聚合酶、 限制性内切酶(RA)TaKaRa 公司);pET28a胶回收试剂盒(RA)上海华舜公司);pET28aT4D)NA 连接酶(RA)上海生物工程 公司);pET28aNi2+NTA 凝胶亲和层析柱(RA)Qiagen 公司);pET28aHRP 标记羊人 IgG，D)NA 分子标准和低 分子蛋白质标准(RA)华美生物工程公司). 1.2 方法 1.2.1PCR 引物设计和合成根据 GenBank 中的 HBV)C 基因和前 S1 基因序列，利用 生物学信息软件设计其扩增引物,以扩增 C 基因编码蛋白 N 端 155 个氨基酸的基因片段和 前 S1 全基因.上游引物 P1 摘要：5′GCGGAATTCATGGACATTGACCCGTATAAAG3′,GCGGAATTCATGGACATTGACCCGTATAAAG3′GCGGAATTCATGGACATTGACCCGTATAAAG3′,,含 EcoRⅠ 酶切位点；下游引物 P2 摘要： 5′GCGGAATTCATGGACATTGACCCGTATAAAG3′,GCGAAGCTTTTAACCCAGCCCGAATGCTCC3′GCGGAATTCATGGACATTGACCCGTATAAAG3′,，含 HindⅢ 酶切位点和终止码 TTA.交 上海生物工程公司合成. 1.2.2 目的基因的扩增以 pD)E22CtpreS1w 质粒为模板进行 PCR 扩增，反应体系为 摘要：质粒（1∶100 稀释）5μLL，10×Buffer5μLL，10mmol/ LdNTPs4μLL，P1（100pmol/L）2μLL，P2（100pmol/L）2μLL，TaqD)NA 聚合酶 2μLL， 用超纯水补至终体积 50μLL.反应条件摘要：预变性 94℃5min； 94℃1min，56℃50s，72℃1min,共进行 30 个循环，最后在 72℃延伸 10min.取 5μLL 反应产物进行琼脂糖电泳分析. 1.2.3pET28aCtpreS1 重组质粒的构建及鉴定连接、转化、重组质粒鉴定均参照文献 ［1］进行，将酶切鉴定正确的重组质粒交由北京三博远志公司测序. 1.2.4 蛋白表达和可溶性分析自 D)H5α 中提取阳性重组质粒，转化大肠杆菌 BL21， 挑取单菌落（同时设空载体质粒转化的大肠杆菌 BL21 为对照），置 5mLLB 培养液中 （含卡那霉素 50g／L），37℃振摇过夜，次日 1∶100 的稀释度加入 5mLLB 培养液中 37℃振摇 3h 后，测定 A600nm 约 0.4～0.6 时加入 IPTG 至终浓度 1mmol/L，37℃继 续振摇 4～5h，离心收菌.用 PBS(RA)pH8.0)悬浮离心收集的细菌，加入溶菌酶至终浓度 0.1g/L，4℃放置 20min，超声破碎，4℃下 10000g 离心 10min，收集上清和沉淀.将 菌体沉淀、裂解上清、裂解沉淀和空质粒转化菌分别加入等体积的 2×样品缓冲液，沸水 中加热 5min，12000g 离心 5min，取上清，每孔 15μLL 进行 SD)SPAGE 电泳，电泳在恒 压下进行（浓缩胶中为 100V)，分离胶中为 120V)）.电泳结束后，将凝胶浸泡于考马斯亮 蓝染色液中染色 2h，然后用脱色液脱色至背景清楚.薄层扫描分析目的蛋白表达带占菌体 蛋白百分比. 1.2.5 亲和层析法纯化表达蛋白参照 Qiagen 公司镍离子亲和层析柱(RA)Ni2+NTA)操作 说明进行.首先离心收集 1L 诱导宿主菌，冰浴 15min；按 5L/kg 湿菌的比例加入含 8mol/ L 尿素的 BufferB（pH8.0），室温下轻轻搅拌使细菌裂解至溶液清亮，4℃下 10000g 离心收集上清，弃去沉淀；将 1mLNi2+NTA 树脂悬浮液和一定量清亮裂解上清于室温轻 柔摇动混匀(RA)100r/min 摇动 15～60min)后，将其混合液装柱；依次用 BufferC（pH6.3）,BufferD)（pH5.9）,BufferE（pH4.5）洗脱，分别收集洗脱液.取各 部分样品进行 SD)SPAGE 分析. 1.2.6WesternBlot 检测表达蛋白将纯化蛋白进行 SD)SPAGE 凝胶电泳，然后将蛋白 质进行电转移至 NC 膜上（滤膜孔径 0.22μLm，转移条件为恒流 100V)，1h）.用乙型肝炎 阳性患者抗 HbcAg，抗 preS1 阳性血清（来自西京医院检验科）作为一抗，HRP 标记羊 抗人的 IgG 作为二抗，D)AB（0.6g／L）显色，至目的条带染色清楚时终止反应. 2 结果 2.1 重组表达质粒的鉴定阳性重组质粒酶切产物预期大小（约 630bp）处出现条带 （图 1）.序列测定结果和文献报道一致. 2.2 融合蛋白的表达和溶解形式分析经 SD)SPAGE 电泳检测，在 Mr 约 24000 处有一 明显的条带，和预期的融合蛋白大小一致.该融合蛋白以包涵体形式存在于沉淀中，上清液 中几乎无诱导表达的融合蛋白.薄层扫描显示其占菌体蛋白的 40%（图 2）. 2.3 融合蛋白的大量表达及纯化目的蛋白在 BufferD)（pH5.9），BufferE（pH4.5） 洗脱液中，扫描显示纯度在 90%以上（图 3）. 2.4 表达蛋白的 Westernblot 预期大小处可见条带染色清楚,纯化的蛋白很好地保持 了和 HBV) 阳性患者血清的结合活性（图 4）. 3 讨论 疫苗是预防 HBV) 感染的重要手段，但相当数量的接种者对现临床使用的疫苗无应答或 低应答，而为数众多的感染者需要有效的治疗，所以迫切需要新型 HBV) 疫苗. 抗原特异性 CTL 所介导的细胞毒功能在病毒感染的控制和痊愈过程中起核心功能［23］.多个 CTL 表位的疫苗探究策略是近年各类 HBV) 新型疫苗探究的热点.HBV) 核心 C 基因 在不同亚型间最为保守,在它编码的 180 多个氨基酸中，CTL 表位多位于第 150 位氨基酸 （aminoacid,AA）以前，其中 18～27 位 AA 为 HLAA0201 所限制，第 88～96 位 AA 被 HLAA11 所限制，第 141～150 位 AA 为 HLAAw68 和 HLAA31 分子所限制，此外第 75～81 位 AA 或 72～88 位 AA 是很强的构像型 B 细胞表位，因此核心抗原是比较理想的 疫苗探究靶分子［4-5］.在既往 HBV) 疫苗探究中人们大多选用 S 基因编码的蛋白，并辅以 CpG,IL2 等分子佐剂试图达到免疫目的，但效果并不理想［6-7］.而 preS1 基因编码蛋白 含有 HBV) 和肝细胞膜结合的位点，并且相当保守,肝细胞、B 细胞和 T 细胞均可表达针对 其第 21～47 位 AA 的受体，故前 S1 抗体是除表面抗体外又一重要的中和抗体［8］.因此 HBV) 的 C 基因和 preS1 基因已经成为近年来 HBV) 新型疫苗探究的重点［9］.