人肺上皮细胞蛋白酶激活论文

【摘要目的摘要:蛋白酶激活受体（proteaseactivatedreceptors,PARs）广泛分布广泛分布 在多种组织细胞上，但 4 种 PARs 在肺上皮细胞的表达情况尚不清楚.我们用 A549 细胞探 究 PARs 在肺上皮细胞的表达.方法摘要:采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）广泛分布、流式细胞流式细胞 仪和免疫荧光细胞染色分析技术分析肺上皮细胞系 A549 细胞 PARs 的表达情况.结果摘要: 4 种 PARs 在肺上皮细胞上均有不同程度的表达.结论摘要:肺上皮细胞同时表达 PAR1~44 种受体，这为进一步探究 PARs 在肺上皮细胞的功能奠定了基础. 【蛋白酶激活受体；肺上皮细胞；RTPCR；流式细胞术；免疫荧光细胞染色 0 引言 蛋白酶激活受体（proteaseactivatedreceptors,PARs）广泛分布属 G 蛋白耦联受体家族， 目前共发现 4 个成员摘要：PAR1，PAR2，PAR3，PAR4.蛋白酶可以酶切 PAR 的 N 末端， 暴露含有系锁配体的新的 N 末端，可自我激活 PAR 功能［1］.探究显示，PARs 分布在多 种组织细胞上，包括血小板、流式细胞白细胞、流式细胞肥大细胞、流式细胞内皮细胞、流式细胞血管平滑肌细胞、流式细胞成纤维细 胞、流式细胞消化道上皮细胞等.PAR 被激活后，可介导跨膜信号转导从而参和凝血、流式细胞炎症、流式细胞变态反 应等生理和病理过程的发生［2］.许多组织上皮表达的 PARs 可能在不同的病理过程中起 功能，虽然一些组织的 PARs 的分布已有探究，但 4 种 PARs 在肺上皮的表达情况和功能 还不是十分清楚.因此，我们利用培养的人肺癌上皮细胞系 A549 细胞探索四种 PARs 在肺 上皮细胞上的表达特征. 1 材料和方法 1.1 材料 人肺癌上皮细胞系 A549 细胞购自中国科学院上海细胞探究所,青、流式细胞链霉素、流式细胞非酶性细 胞分离液购于 Sigma 公司，DMEM 培养液、流式细胞胎牛血清（FBS）广泛分布购自 Gibco 公司， TRIZOLReagent 购自 Invitrogen 公司,TAKARALARTPCRkit,购自 TAKARA 公司， SYBRGreenI 核酸凝胶染料购自 BMA 公司,PCRMarkers 购自 Biolabs 公司.PE 标记的小 鼠抗人 PAR1 和 PAR2mAb,兔抗人 PAR3 和兔抗人 PAR4 多克隆抗体及相应的同型对照均 购自 SantaCruz 公司.FITC 标记的羊抗兔 IgG 二抗购自 BDPharmingen 公司.PCR 仪 PTC200 购自 MJResearch 公司，激光扫描共聚焦显微镜系统购自日本 Nikon 公司， FACSCalibur 流式细胞仪购自 BectonDickinson 公司. 1.2 方法 1.2.1 细胞培养人肺癌上皮细胞系 A549 细胞接种于 50mL 培养瓶内，用 DMEM 完全 培养液（含 100g/LFBS，1×105u/L 青霉素和 100mg/L 链霉素）广泛分布，于 37℃,50mL/ LCO2 培养箱中培养. 1.2.2RTPCR 收集培养的 A549 细胞，用 TRIZOLReagent 提取细胞总 RNA，具体 操作步骤按试剂说明进行.RNA 经 10g/L 琼脂糖电泳后，按 TAKARARTPCRkit 说明进行 cDNA 合成.逆转录的条件为摘要： oligod(T),42℃30min，99℃5min,5℃5min.PAR1，PAR2，PAR3，PAR4 和 βactinactin 的特异性引物均由上海博亚生物技术有限公司合 成.βactinactin（F）广泛分布5′AGGGGCCGGACTCGTCATACT3′, （R）广泛分布5′GGCGGCAACACCATGTACCCT3′，PAR1（F）广泛分布5′CAGCTCCTGGCTGACACTC TTTGTC3′， （R）广泛分布5′CGAGCAGGGTTTCATTGAGCACAT3′,PAR2（F）广泛分布5′GCAGCCTCTCTCTCCTG CAGTGG3′， （R）广泛分布5′CTGAGGCAGGTCATGAAGAGAATGG3′，PAR3（F）广泛分布5′GGCTGGACAGGAGC CACGAT3′， （R）广泛分布5′AGCGGTTGATGCTGATGCAGG3′,PAR4（F）广泛分布5′GGATCGCCTACCACCTGCG TG3′，（R）广泛分布5′CCCGTAGCACAGCAGCATGG3′.βactinactin 的 PCR 扩增条件为摘要： 94℃2min,94℃30s,55℃30s,72℃30s,35 个循环,72℃10min.PAR1,PAR2,PAR3 和 PAR4 的 PCR 扩增条件为摘要：94℃2min,94℃30s,67℃30s,72℃1min,35 个循 环,72℃10min.PAR1,PAR2,PAR3 和 PAR4 扩增的目的片段分别为 500,461,403 和 401bp；βactinactin 的扩增片段为 202bp.PCR 扩增片段经测序验证. 1.2.3 流式细胞术分析待培养细胞生长至 70%~80%时，用非酶性细胞分离液悬浮细 胞，10g/LBSA/PBS 洗 2 次，调整细胞密度为 5×109~1×1010/mL，40g/L 多聚甲醛 室温固定 10min,按说明书分别加入 1∶20PE 标记的抗 PAR1、流式细胞抗 PAR2 小鼠抗人 mAb、流式细胞1∶20 抗 PAR3、流式细胞抗 PAR4 兔多克隆抗体及相应的同型对照抗体，4℃避光孵育 30min,10g/LBSA/PBS 洗 2 次;PAR3,PAR4PAR3,PAR4 管再加入 FITC 标记的羊抗兔 Ig 二抗，4℃避 光孵育 30min,10g/LBSA/PBS 洗 2 次,最后各管均加入 500μL1×PBSL1×PBS 悬浮细胞，使用流 式细胞仪 CELLQUEST 软件检测和分析上皮细胞 PAR 的表达情况. 1.2.4 免疫荧光细胞染色将 A549 细胞接种于 8 孔显微镜玻片培养过夜，用 10g/ LBSA/PBS 漂洗后加入甲醇固定 20min,然后用 10g/LBSA/PBS 孵育 5min，加入 1∶20 的 PE 标记的抗 PAR1、流式细胞抗 PAR2 小鼠抗人 mAb、流式细胞抗 PAR3、流式细胞抗 PAR4 兔多克隆抗体及相应 的同型对照抗体，室温避光孵育 1h,10g/LBSA/PBS 洗 3 次,PAR3，PAR4 管再加入 FITC 标记的羊抗兔 Ig 二抗，室温避光孵育 1h,10g/LBSA/PBS 洗 3 次,最后用甘油封片，共聚 焦显微镜下观察. 2 结果 2.1 肺上皮细胞 PARsmRNA 的表达肺上皮细胞表达 PAR1，PAR2，PAR3 和 PAR4 的 mRNA，扩增 PAR1，PAR2，PAR3 和 PAR4mRNA 的长度分别为 500,461,403 和 401bp（Fig1）广泛分布. 2.2 肺上皮细胞 PARs 蛋白质的表达流式细胞仪检测发现肺上皮细胞表达 PAR1，PAR2，PAR3 和 PAR4，其中 PAR4 的表达为最强，PAR1 和 PAR3 的表达水平 较相似，PAR2 的表达水平最弱.免疫荧光细胞染色分析进一步证实上述 PARs 在肺上皮细 胞上的表达（Fig2）广泛分布. Fig2ImmunofluorescencestainingofPARsonlungepithelialcells 图 2 免疫荧光细胞染色分析检测肺上皮细胞 PAR 的表达 3 讨论 PARs 家族共有 PAR1，PAR2，PAR3 和 PAR44 个成员，凝血酶可激活 PAR1、流式细胞PAR3 和 PAR4，而 PAR2 可被胰蛋白酶、流式细胞肥大细胞类胰蛋白酶和活化的凝血因子 Ⅹ所激活［所激活［3-5］.另外，这些受体还可被相应的 PARs 激动肽所激活.其中 PAR1 是凝血酶 的高亲和力受体，而 PAR4 只能被高浓度凝血酶激活.探究显示，凝血酶通过 PAR1 和 PAR4 途径协同互补介导血小板的活化，而 PAR3 作为 PAR4 的辅助因子，在血小板活化 中也起着一定功能［6］，除参和凝血外，多种细胞类型 PARs 的广泛激活还可参和血管损 伤反应［7,8］.PAR2 的激活可参和细胞因子及炎症介质的释放,增加微血管的渗出以及中 性粒细胞的趋化,血管扩张,血管收缩,细胞增殖等炎症的病理过程.此外，在不同的生理和病 理条件下，体内不同的内源性蛋白酶的存在，可能会激活同一细胞上的 PAR2. 我们利用 RTPCR、流式细胞流式细胞仪和免疫荧光细胞染色分析技术检测到了 4 种 PARs 在肺 上皮细胞上的表达.肺上皮细胞作为首先接触吸入性抗原的组织细胞之一，在变态反应性疾 病的发病机制中起重要功能，它能够合成和释放许多前炎症细胞因子和趋化性细胞因子， 包括 IL1，IL6，IL8，GMCSF，MIP，RANTES 和 eotaxin 等［3,9］，还可以合成抗炎 因子如 PGE2 和 NO［10］.通过这些因子的功能来募集、流式细胞激活炎症性细胞从而调节机体的 炎症过程，尤其是 PAR2 的激活可多方面参和肺部炎症的发生和发展.我们也曾经用胰蛋白 酶和 PAR2 激动肽激活肺上皮细胞，诱导其产生了趋化性细胞因子 MCP1［11］，但其释 放的机制及肺上皮细胞表达 PARs 的生理和病理生理意义还有待进一步的探索. ［摘要］目的探索运用自制硅胶管逆行泪道插管术治疗慢性泪囊炎的手术效果。方法 对 30 例(31 眼)慢性泪囊炎患者行逆行泪道插管术。结果术后随访 6～12 个月,取得满足效 果。结论逆行泪道插管术治疗慢性泪囊炎，方法简便，效果良好，值得临床推广。 ［］慢性泪囊炎;PAR3,PAR4逆行泪道插管术 Treatmentofchronicdacryocystitiswithrecessiveplacementofnasolacrimalst ent ［Abstract］ObjectiveToevaluatetheefficacyofrecessiveplacementofdomes ticnasolacrimalstentintreatmentofchronicdacryocystitis.Methods30cases(31ey es)ofchronicdacryocystitishadundergonerecessiveplacementofdomesticnasola crimalstent.ResultsThefollowupperiodwas6upperiodwas6～ 12monthsafterreplacementandsatisfactorytreatmentresultshadgained.Conclus ionRecessiveplacementofnasolacrimalstentwasasimple,effectiveandsafetechni queintreatmentofchronicdacryocystitis,andworthyofwidelyuseinclinic. ［Keywords］chronicdacryocystitis;PAR3,PAR4recessiveplacementofnasolacrimalsten t 慢性泪囊炎是眼科门诊常见疾病之一，常规治疗方法需行鼻泪管吻合术，费用较高， 且面部切口易留瘢痕、流式细胞术后影响美观。我院自 2003 年 1 月至今，采用自制硅胶管逆行泪 道插管术治疗慢性泪囊炎 30 例（31 眼）广泛分布，取得良好效果，现报告如下。 1 资料和方法 1.1 一般资料本组 30 例(31 眼)慢性泪囊炎患者，男 7 例 7 眼，女 23 例 24 眼，年龄 最大 61 岁，最小 24 岁,其中 4 例 4 眼曾行泪道插管术后复发流泪、流式细胞溢脓，所有患者术前 泪道冲洗时，均有脓性分泌物反流，术前检查鼻腔无明显鼻疾，点抗生素眼水，术前 30min 使用镇静剂和止血药物，做好术前预备。 1.2 方法 1.2.1 术前预备（1）广泛分布备 30cm 长 4 号缝线 1 根；中弯尖头血管钳 1 把；泪道探针 1 套；14cm 长硬膜外导管 1 根；直径 3.5mm、流式细胞长 3cm 硅胶管 1 根；鼻镜、流式细胞枪状镊各 1 把； 1%地卡因液；0.5%麻黄素液备用［1］。（2）广泛分布取硅胶管压平一端制作中点尖两边长 2mm 斜面，4 号线沿尖点对穿打结，距第一节 10mm 另打第二结，距第二节 10mm 另 打第三结。（3）广泛分布泪点表面麻醉，向泪囊注入 1%地卡因 0.5ml，下鼻道内填入地卡因、流式细胞麻 黄素棉片 3 次，间隔 5min。 1.2.2 手术步骤泪点扩张，并用泪道探针探通，扩张到 8 号探针。以泪道探通同样的 方法将 14cm 长硬膜外导管插入泪道直达下鼻道，抽至鼻腔外，然后抽出金属丝芯。取自 制硅胶管线端插入硬膜外导管下端孔内固定，抽出硬膜外导管引线至泪点外，中弯尖头血 管钳夹持引线第二节处，牵引泪点外引线，中弯尖头血管钳顺引线方向进入下鼻道插入鼻 泪管至泪囊，引线第三节露出泪点外，血管钳扩张鼻泪管 1cm 稍大，固定引线、流式细胞抽出血 管钳，牵引泪点外引线，用枪状镊将自制硅胶管顺引线方向送入鼻泪管至泪囊顶部，下端 于下鼻道，引线用胶布固定鼻翼侧方。鼻腔有出血者，用麻黄素棉片压迫下鼻道 4min 即 可止血。 1.3 术中注重事项及术后处理术中拉线时应顺势拉出，不可强拉。术后每日滴抗生素 眼水 4～6 次，生理盐水冲洗泪道每日 1 次，持续 3～5 天，以后改每周 1 次，2 周内适当 使用类固醇药物，3 个月后从鼻腔拔除扩张管，冲洗泪道。 2 结果 术后随访 6～12 个月(手术疗效在 6 个月以后评定为准)，疗效评定标准及结果摘要： （1）广泛分布流泪消失，泪道冲洗通畅（冲洗液从鼻腔流出）广泛分布。1%荧光素钠滴眼，5～10min 鼻 腔显示该药液者 27 例 28 眼为治愈。（2）广泛分布流泪减轻，泪道冲洗通畅（冲洗液从鼻腔流 出）广泛分布。1%荧光素钠滴眼，5～10min 鼻腔无该药液显示者 2 例 2 眼为好转。（3）广泛分布仍有流 泪，指压泪囊区有分泌物从上下泪小点溢出，泪道冲洗不通者 1 例 1 眼为无效。 3 讨论 慢性泪囊炎是眼科常见病、流式细胞多发病，非凡是基层卫生条件差的地方、流式细胞发病率更高，常 规鼻泪管吻合术，面部易留瘢痕且费用较高，鼻泪内镜下鼻腔泪囊造口术，受设备限制而 难以开展。此法优点是面部不留瘢痕，泪囊四周组织损伤少，创口愈合快，不影响再次手 术。鼻腔造孔的口径于术后 3～5 个月逐渐缩小，5 个月后其口径基本稳定，一般缩小到 3 ～5mm。因此，手术时骨孔制作宜大不宜小，不可小于 1cm。由于鼻孔狭小，术区狭窄， 视线不清，操作不宜，因此，术者必须熟练把握正常组织结构及适应证［2，3］，鼻腔急 性炎症、流式细胞萎缩性鼻炎、流式细胞肥大性鼻炎及年幼患者应视为禁忌证。 Abdelaty 医师等回顾了有关类风湿性关节炎(RA)的文献后指出，过去几十年来对 RA 免疫发病机制更多的了解，促进了更特异的新疗法的产生。非皮质类固醇抗炎药(NSAID) 的改进也对患者有益。本文报告了这些新疗法的重点。 一、流式细胞抗肿瘤坏死因子(TNF)[infliximab(cA2)infliximab(cA2)疗法摘要： 1.药理功能 cA2 是由鼠抗人 TNF－α 单克隆抗体(mAb)的不同部位连接至人 IgG1κ 分子而构成的嵌合抗 TNF－αmAb。它有两个基本的功能机制摘要：①和可溶性 TNF－α 络合而使其失去生物活性并下调下游炎症事件。②和跨膜的 TNF－α 结合，导致经 Fc 介导 的机制而使产生 TNF－α 的细胞破坏，从而减少炎症细胞群。通过此二途径，均能阻滞 TNF－α 对其他促炎细胞因子如 IL－1、流式细胞IL－6、流式细胞IL－8 和 GM－CSF 的上调功能。另一机 制是通过滑膜和细胞内的吸附分子的下调而减少炎症细胞流入关节。 2.临床疗效在美国，cA2 用于 RA 正待批准。在首次 cA2 用于治疗 RA 的安慰剂对照 试验中，静脉输注(IV))一次 cA210mg/kg 较 1mg/kg 的疗效高(79％对 44％)，疗效维持 的中位期分别为 8 和 3 周。安慰剂组 12％有效。对复发者再给 cA210mg/kg，最多达 4 次，所有病例均获得有效控制，但 50％的患者有效期缩短。这被认为是人抗嵌合抗体 (HACA)形成所致。另一首次安慰剂对照、流式细胞双盲、流式细胞长期探究中，纳入正在用小剂量甲氨蝶 呤(MTX))治疗仍在活动期的 RA 患者，试验组不用或继续用 MTX)7.5mg/周，在第 1 天、流式细胞 2、流式细胞6、流式细胞10 和 14 周时，分别接受 cA21、流式细胞3 或 10mg/kgIV)，对照组接受安慰剂输注加 MTX)7.5mg/周，随访至第 26 周。结果呈剂量依靠性显著好转，10mg/kg 组中 60％显著 好转，许多患者疗效持续至 26 周，对照组 15％达 20％Paulus 有效标准(根据症状，主客 观判定)。探究者认为 cA2 和 MTX) 的协同功能是由于 MTX) 减少了 HACA 的产生。 3.不良反应过敏反应如发热、流式细胞寒颤、流式细胞头痛、流式细胞恶心、流式细胞血管迷走神经反应和荨麻疹。21％ 发生感染，3％严重感染包括肺炎、流式细胞皮肤感染和胆囊炎；安慰剂组分别为 11％和 2％，但 需指出，用药前感染率就高。8％患者产生抗双链 DNA 抗体，仅 1 例发生系统性狼疮症状。 HACA 的产生是长期治疗的限制因素，调整剂量或伍用 MTX) 可能减少 cA2 的免疫原性。 4.适应证难治性 RA 患者。用法摘要：IV)，间隔最长 8 周。 二、流式细胞人 TNF 受体 p75－Fc 蛋白(etanercept,ET) 1.药理功能 TNF－α 和其同源分子 TNF－βactin 相等地和 TNF 细胞表面受体结合而介导它 们的生理和病理功能。有两个独特的 TNF 受体即 p55 和 p75，此二型膜结合受体通过每 个分子的细胞外配体结合(ligand_binding)部分的蛋白酶剪切而被转化为相应的可溶性 TNF 受体(sTNFR)。sTNFR 可抵销 TNF 活性。健康人血循环中的 sTNFR 水平为 1～2ng/ ml，而 RA 患者滑膜液内的 sTNFR 可能要比之高 4～5 倍，可中和过量的 TNF。ET 是由 2 个 p75 受体的细胞外部分和人 IgG1 的 Fc 段融合而成，可结合 2 个 TNF 分子，且由于 Fc 而增加了循环半衰期，故被用以结合炎症部位过量的 TNF。使 TNF 不能和炎症靶细胞 的表面受体结合而失活。 2.临床疗效在一项Ⅱ期双盲、安慰剂对照的探究中，纳入期双盲、流式细胞安慰剂对照的探究中，纳入 180 例 RA 患者，用 ET0.25、流式细胞2 或 16mg/m2 皮下注射，每周 2 次，共 3 个月，用 50％美国风湿病学学会 (ACR)有效率标准衡量，病的活动度显著下降，尤其在 57％用最大剂量的患者。最近在对 MTX) 疗效差的 RA 患者进行的Ⅲ期试验中，Ⅰ组联合用期试验中，Ⅰ组联合用组联合用 ET 和 MTX)，Ⅱ期双盲、安慰剂对照的探究中，纳入组单用 MTX)，共 6 个月，用 50％ACR 有效率标准评估，Ⅰ组联合用组有效率为 39％，Ⅱ期双盲、安慰剂对照的探究中，纳入组为 3％。Ⅰ组联合用组临床好转快， 疲惫等症状在 1～2 天内缓解，1～2 周内有客观进步。 3.不良反应患者耐受良好。最常见的不良反应为注射部位红斑或红斑加不适，不需治 疗，仅 1 例因此退出探究；还有轻度上呼吸道感染的咳嗽、流式细胞鼻炎、流式细胞鼻窦炎和咽炎。治疗组 和安慰剂组中有 5％产生抗双链 DNA 抗体，但无狼疮的临床征象。1 例产生抗 ET 抗体。 对有隐匿的慢性感染如结核或丙型肝炎患者，所有 TNF 抑制剂均应慎用。 4.适应证目前用于其他二线药无效的患者，用法摘要：25mg 皮下注射，2 次/周。 三、流式细胞来氟米特(leflunomide,LF) 1.药理功能 LF 为异恶唑衍生物，为一新的抗嘧啶抗风湿病情改善药(DMARD)，已被 证实有免疫调节性能。重点功能于自身反应性淋巴细胞，它很快被代谢为活性型 A771726 而抑制二氢乳清酸脱氢酶使核苷酸水平下降。淋巴细胞的活化需核苷酸库扩大 8 ～16 倍，故核苷酸的减少导致选择性自身反应性细胞的抑制。