瘢痕成纤维细胞钙网蛋白表达论文

目的观察钙网蛋白(CRT)CRT))在瘢痕及正常皮肤成纤维细胞内的表达情况。方法采用免疫 细胞化学染色和原位 ELISA 技术对体外培养的瘢痕及正常皮肤成纤维细胞进行 CRT) 分布 定位及表达水平探究。结果瘢痕和正常皮肤成纤维细胞在处于增殖生长状态时，胞浆及核 内均有不同程度的 CRT) 表达，其中瘢痕成纤维细胞表达 CRT) 水平(CRT)A 摘 要:1.97±0.15,ELISA492nm)ELISA492nm))明显高于正常皮肤成纤维细胞水平(CRT)A 摘要:1.43±0.12),ELISA492nm)差 异有非常显著意义(CRT)P＜0.01)；而在已融合的瘢痕和正常皮肤成纤维细胞内则均无 CRT) 表 达。结论瘢痕成纤维细胞内 CRT) 的丰富表达对促进细胞迁移、信号传递及钙存储等方面均 有着积极功能。 Studyontheexpressionofcalreticulininhypertrophicscar-derivedfibroblasts 【AbstractObjectiveT)oinvestigatetheexpressionlevelandintracellulardistrib utionofcalreticulin(CRT)CRT))inhypertrophicscarderivedfibroblasts(CRT)HSF)andnorm)alskinderivedfibroblasts(CRT)NSF).MethodsUsingantiCRT)antibody,ELISA492nm)CRT)wasdetectedinHSFandNSFbyim)m)unocytochem)istryandELISAt echnique.ResultsCRT)waspresentinthecytoplasm)andnucleiinproliferatingHSFor NSFinculture,ELISA492nm)butHSFpossessedsignificantlyhigherexpressionlevelofCRT)thanNS F(CRT)P＜ 0.01).Whenthesecells(CRT)HSFandNSF)werefused,ELISA492nm)neitherintracellularnorintranucle arstainingforCRT)wasobserved.ConclusionInHSFandNSF,ELISA492nm)thedistributionofCRT)is widespread.BecauseofitsabundantexpressioninHSF,ELISA492nm)wepostulatethatCRT)asam)u ltifunctionalproteinplaysanim)portantroleinCa2+sequestering,ELISA492nm)integrinm)ediatedsignallingandcelladhesion. 【KeywordsHypertrophicscarFibroblastCalreticulinExpression 增生性瘢痕(CRT)Hypertrophicscar,ELISA492nm)HS)作为创伤及外科手术后常见且十分棘手的皮肤组 织疾病，瘢痕组织内成纤维细胞异常活化和细胞外间质过度沉积既是 HS 的重要组织学特 征，也是 HS 发生、发展的物质基础。钙网蛋白(CRT)Calreticulin,ELISA492nm)CRT))最早是作为一种存在于 非肌细胞内质网上的主要钙结合蛋白得以熟悉的［1］，近几年的探究发现摘要：除具有 钙离子储藏功能外，CRT) 在参和并调节众多细胞生物学活性功能上有着积极影响［25］，同时它还作为自身抗原在某些免疫性疾病的发病机制中有着极其重要的价值［6］。 我们通过 CRT) 抗体并利用原位 ELISA 及免疫细胞化学染色技术检测瘢痕成纤维细胞体外 表达 CRT) 水平，辅以正常皮肤成纤维细胞作对照，探索 CRT) 在瘢痕成纤维细胞发挥异常 生物学活性功能中的功能。 1 材料和方法 1.1 组织标本 增生性瘢痕及正常皮肤组织标本均取自住院病人，年龄 17～40 岁。患者在取标本前 无长时间外用各种防治增生性瘢痕药物史，不伴肿瘤及其他严重疾患；瘢痕组织生长时间 均在 6～9 个月之间。 1.2 主要试剂及物品预备 羊抗 CRT) 抗体摘要：Michalak 博士惠赠。辣根过氧化物酶标记兔抗羊 IgG(CRT)Zym)ed 公司)。DAB 及 OPD(CRT)Sigm)a 公司)。细胞培养基摘要：DMEM 添加 10%小牛血清(CRT)上海华 美生物技术有限公司)。96 孔塑料培养板及 100m)m) 培养皿(CRT)丹麦 Nunc 公司)。 1.3 成纤维细胞培养 手术切取增生性瘢痕及正常皮肤组织，去皮下脂肪，0.01%新洁尔灭浸洗 10m)in，PBS 洗 3 次，用组织剪将组织剪成细小碎块并接种于培养皿内，加少量 10%小 牛血清的 DMEM 培养基，37℃5%CO2 静止培养，3 天后补充少量培养剂，隔 2 天换液， 见有细胞从组织块爬出生长后天天换液，传代。 1.4CRT) 免疫细胞化学染色 体外培养的成纤维细胞去培养基后，PBS 轻洗，2%多聚甲醛固定 10m)in，0.3%双 氧水反应 5m)in，PBS 再洗；二抗血清 37℃20m)in，抗 CRT) 抗体 37℃功能 45m)in，HRP-兔抗羊 IgG37℃反应 1h，DAB 显色；显微镜下观察显色信号。 1.5CRT) 原位 ELISA 检测［7］ 选择第 5 代培养细胞为实验对象，用 0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞，调整细胞浓度 至 106/mlm)l，每孔 100μll 接种于 96 孔培养板内。培养 16h 后，去培养剂，PBS 清洗； 2%多聚甲醛固定 10m)in，0.3%双氧水反应 5m)in，PBS 洗；和 0.1%T)ritonX-1004℃ 功能 3m)in 后，进一步分别和 5%小牛血清(CRT)37℃、20m)in)、抗 CRT) 抗体 (CRT)37℃、1h)、5%小牛血清 PBS 稀释的 HRP-兔抗羊 IgG(CRT)37℃、1h)反应；PBS 清洗后加 入 OPD 底物液 100μll，功能 30m)in 后用 50μll1m)ol/mlL 硫酸中止反应。ELISAreader 上读 取 492nm) 的 P 值。 2 结果 2.1 成纤维细胞初代培养结果 在体外相同培养条件下，细小的瘢痕及正常皮肤组织块接种后 2 天见有部分贴壁，培 养 1 周后有少量的成纤维细胞从组织块边缘爬出，2 周后细胞在组织块四周呈晕状分布， 此后细胞开始向外旺盛扩散增殖。显微镜下观察瘢痕及正常皮肤组织来源的成纤维细胞形 态，发现细胞均呈细小梭外形，二者未见明显差异。 2.2 成纤维细胞 CRT) 表达的免疫细胞化学染色结果 原代培养的瘢痕及正常皮肤成纤维细胞在未生长融合前，细胞内均有不同程度的 CRT) 阳性表达；一旦细胞生长融合后，在融合区内的成纤维细胞中均未见有明显的 CRT) 阳性信 号出现，但在融合区边缘仍处于增殖、迁移扩散的瘢痕及正常皮肤成纤维细胞内，则仍有 CRT) 的阳性信号分布；就二种细胞内 CRT) 的表达信号强弱来看，瘢痕成纤维细胞内的 CRT) 阳性信号相对较强，而正常皮肤成纤维细胞内 CRT) 阳性信号相对较弱；另外，当瘢 痕及正常皮肤成纤维细胞以较高密度传代培养时，细胞内 CRT) 表达在接种后 16h 较为明 显，而在培养 24h 细胞接近融合时信号较弱。 此外，CRT) 在瘢痕及正常皮肤成纤维细胞内的表达区域无明显差异，往往在细胞浆、 核膜及核内均有表达。 2.3 成纤维细胞 CRT) 表达的 ELISA 检测结果 根据 CRT) 免疫细胞化学染色结果，我们对第 5 代瘢痕及正常皮肤成纤维细胞(CRT)接种后 培养 16h)进行 CRT) 表达的 ELISA 检测，其中正常皮肤成纤维细胞组的 CRT) 表达值为 1.43±0.12(CRT)A)，瘢痕成纤维细胞组为 1.97±0.15(CRT)A)，二组间差异有非常著性意义(CRT)P＜ 0.01)。 3 讨论 增生性瘢痕是伤口上皮化愈合后组织内成纤维细胞异常活化即继续旺盛增殖并分泌大 量胶原、纤维连接蛋白及蛋白多糖等细胞外间质所造成的一种组织病理改变，有关瘢痕成 纤维细胞为何异常活化一直是整形烧伤外科领域里重点探索的课题之一。转化生长因子 β1、肿瘤坏死因子 α、白细胞介素-1 和类胰岛素生长因子-1 等在增生性瘢痕组织内的过度 表达一直被认为是引起成纤维细胞异常活化不可忽视的因素，但越来越多实验探究表明瘢 痕成纤维细胞自身生物学特性改变是触发其功能异常的关键［8］。我们通过对细胞内 CRT) 的表达检测，进一步发现 CRT) 不但在瘢痕成纤维细胞内分布广泛，而且其表达量明 显高于正常皮肤成纤维细胞内水平。 CRT) 作为钙离子主要结合蛋白，早期探究认为 CRT) 主要是通过影响细胞内钙离子的 储存和释放而影响细胞的一些生物学活性效应，但近几年的探究结果表明 CRT) 除上述功能 外，它在细胞迁移扩散及细胞内相关基因表达等方面均有直接的介导和调节功能。1997 年，Zhu 等人［9］通过对 B16 细胞 CRT) 表达的深入探究发现实细胞内的 CRT) 分子经常 和整合素粘附分子的 α 链胞内区结合并成为双向传导细胞内外信号的复合体；Coppolino 等人［5］利用 CRT) 缺乏而整合素表达正常的胚胎干细胞进行细胞体外迁移粘附探究，证 实在正常培养条件下干细胞的迁移扩散能力很弱，而经转染 CRT) 基因后，细胞的迁移粘附 功能显著增强。因此，Coppolino 认为细胞内 CRT) 和整合素粘附分子直接参和细胞的信 号传导、粘附、迁移扩散等生物学活性功能。T)sai 等［10］曾利用体外结缔组织收缩模型 发现增生性瘢痕组织来源的成纤维细胞在体外有着比正常皮肤成纤维细胞更强的迁移扩散 能力，并认为其功能可能和细胞内肌动蛋白丝积聚有关。笔者在博士后探究工作阶段却发 现在相同培养条件下增生性瘢痕组织来源的成纤维细胞除有着较强迁移扩散能力外，还具 有高表达 β1、α1、α2、α3 及 α4 整合素粘附分子的特性［11］，从而提示瘢痕成纤维细 胞的强迁移扩散能力和高表达整合素粘附分子有关；而从本实验对 CRT) 在瘢痕成纤维细胞 内的表达情况来看，细胞内其 CRT) 表达并不属持续性表达，CRT) 的高表达期一般是在细 胞的迁移扩散阶段，而当细胞融合后细胞内 CRT) 表达甚少。但就和同一时期培养的正常皮 肤成纤维细胞相比，瘢痕成纤维细胞内的 CRT) 表达则显得更为丰富。因此，结合我们以往 的探究工作结果，我们认为摘要：瘢痕成纤维细胞异常的迁移扩散能力是细胞内丰富的 CRT)、整合素粘附分子表达及肌动蛋白丝积聚共同功能的结果，其中积聚的肌动蛋白丝是 其异常迁移扩散的重要动力来源，而有效表达的 CRT) 及整合素粘附分子则是细胞和细胞外 间质之间迁移动力的传递媒介；另外，CRT) 的丰富表达对瘢痕成纤维细胞钙离子的储存、 释放及其信号传导等也有着重要的意义。 【摘要目的摘要:蛋白酶激活受体（proteaseactivatedreceptors,ELISA492nm)PARs）广泛分布广泛分布 在多种组织细胞上，但 4 种 PARs 在肺上皮细胞的表达情况尚不清楚.我们用 A549 细胞探 究 PARs 在肺上皮细胞的表达.方法摘要:采用逆转录聚合酶链反应（RT)PCR）广泛分布、流式细胞 仪和免疫荧光细胞染色分析技术分析肺上皮细胞系 A549 细胞 PARs 的表达情况.结果摘要: 4 种 PARs 在肺上皮细胞上均有不同程度的表达.结论摘要:肺上皮细胞同时表达 PAR1~44 种受体，这为进一步探究 PARs 在肺上皮细胞的功能奠定了基础. 【蛋白酶激活受体；肺上皮细胞；RT)PCR；流式细胞术；免疫荧光细胞染色 0 引言 蛋白酶激活受体（proteaseactivatedreceptors,ELISA492nm)PARs）广泛分布属 G 蛋白耦联受体家族， 目前共发现 4 个成员摘要：PAR1，PAR2，PAR3，PAR4.蛋白酶可以酶切 PAR 的 N 末端， 暴露含有系锁配体的新的 N 末端，可自我激活 PAR 功能［1］.探究显示，PARs 分布在多 种组织细胞上，包括血小板、白细胞、肥大细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细 胞、消化道上皮细胞等.PAR 被激活后，可介导跨膜信号转导从而参和凝血、炎症、变态反 应等生理和病理过程的发生［2］.许多组织上皮表达的 PARs 可能在不同的病理过程中起 功能，虽然一些组织的 PARs 的分布已有探究，但 4 种 PARs 在肺上皮的表达情况和功能 还不是十分清楚.因此，我们利用培养的人肺癌上皮细胞系 A549 细胞探索四种 PARs 在肺 上皮细胞上的表达特征. 1 材料和方法 1.1 材料 人肺癌上皮细胞系 A549 细胞购自中国科学院上海细胞探究所,ELISA492nm)青、链霉素、非酶性细 胞分离液购于 Sigm)a 公司，DMEM 培养液、胎牛血清（FBS）广泛分布购自 Gibco 公司， T)RIZOLReagent 购自 Invitrogen 公司,ELISA492nm)T)AKARALART)PCRkit,ELISA492nm)购自 T)AKARA 公司， SYBRGreenI 核酸凝胶染料购自 BMA 公司,ELISA492nm)PCRMarkers 购自 Biolabs 公司.PE 标记的小 鼠抗人 PAR1 和 PAR2m)Ab,ELISA492nm)兔抗人 PAR3 和兔抗人 PAR4 多克隆抗体及相应的同型对照均 购自 SantaCruz 公司.FIT)C 标记的羊抗兔 IgG 二抗购自 BDPharm)ingen 公司.PCR 仪 PT)C200 购自 MJResearch 公司，激光扫描共聚焦显微镜系统购自日本 Nikon 公司， FACSCalibur 流式细胞仪购自 BectonDickinson 公司. 1.2 方法 1.2.1 细胞培养人肺癌上皮细胞系 A549 细胞接种于 50m)L 培养瓶内，用 DMEM 完全 培养液（含 100g/mlLFBS，1×105u/mlL 青霉素和 100m)g/mlL 链霉素）广泛分布，于 37℃,ELISA492nm)50m)L/ml LCO2 培养箱中培养. 1.2.2RT)PCR 收集培养的 A549 细胞，用 T)RIZOLReagent 提取细胞总 RNA，具体 操作步骤按试剂说明进行.RNA 经 10g/mlL 琼脂糖电泳后，按 T)AKARART)PCRkit 说明进行 cDNA 合成.逆转录的条件为摘要： oligod(CRT)T)),ELISA492nm)42℃30m)in，99℃5m)in,ELISA492nm)5℃5m)in.PAR1，PAR2，PAR3，PAR4 和 βactin 的特异性引物均由上海博亚生物技术有限公司合 成.βactin（F）广泛分布5′AGGGGCCGGACT)CGT)CAT)ACT)3′,ELISA492nm) （R）广泛分布5′GGCGGCAACACCAT)GT)ACCCT)3′，PAR1（F）广泛分布5′CAGCT)CCT)GGCT)GACACT)C T)T)T)GT)C3′， （R）广泛分布5′CGAGCAGGGT)T)T)CAT)T)GAGCACAT)3′,ELISA492nm)PAR2（F）广泛分布5′GCAGCCT)CT)CT)CT)CCT)G CAGT)GG3′， （R）广泛分布5′CT)GAGGCAGGT)CAT)GAAGAGAAT)GG3′，PAR3（F）广泛分布5′GGCT)GGACAGGAGC CACGAT)3′， （R）广泛分布5′AGCGGT)T)GAT)GCT)GAT)GCAGG3′,ELISA492nm)PAR4（F）广泛分布5′GGAT)CGCCT)ACCACCT)GCG T)G3′，（R）广泛分布5′CCCGT)AGCACAGCAGCAT)GG3′.βactin 的 PCR 扩增条件为摘要： 94℃2m)in,ELISA492nm)94℃30s,ELISA492nm)55℃30s,ELISA492nm)72℃30s,ELISA492nm)35 个循环,ELISA492nm)72℃10m)in.PAR1,ELISA492nm)PAR2,ELISA492nm)PAR3 和 PAR4 的 PCR 扩增条件为摘要：94℃2m)in,ELISA492nm)94℃30s,ELISA492nm)67℃30s,ELISA492nm)72℃1m)in,ELISA492nm)35 个循 环,ELISA492nm)72℃10m)in.PAR1,ELISA492nm)PAR2,ELISA492nm)PAR3 和 PAR4 扩增的目的片段分别为 500,ELISA492nm)461,ELISA492nm)403 和 401bp；βactin 的扩增片段为 202bp.PCR 扩增片段经测序验证. 1.2.3 流式细胞术分析待培养细胞生长至 70%~80%时，用非酶性细胞分离液悬浮细 胞，10g/mlLBSA/mlPBS 洗 2 次，调整细胞密度为 5×109~1×1010/mlm)L，40g/mlL 多聚甲醛 室温固定 10m)in,ELISA492nm)按说明书分别加入 1∶20PE 标记的抗 PAR1、抗 PAR2 小鼠抗人 m)Ab、1∶20 抗 PAR3、抗 PAR4 兔多克隆抗体及相应的同型对照抗体，4℃避光孵育 30m)in,ELISA492nm)10g/mlLBSA/mlPBS 洗 2 次;PAR3,PAR4PAR3,ELISA492nm)PAR4 管再加入 FIT)C 标记的羊抗兔 Ig 二抗，4℃避 光孵育 30m)in,ELISA492nm)10g/mlLBSA/mlPBS 洗 2 次,ELISA492nm)最后各管均加入 500μlL1×PBS 悬浮细胞，使用流 式细胞仪 CELLQUEST) 软件检测和分析上皮细胞 PAR 的表达情况. 1.2.4 免疫荧光细胞染色将 A549 细胞接种于 8 孔显微镜玻片培养过夜，用 10g/ml LBSA/mlPBS 漂洗后加入甲醇固定 20m)in,ELISA492nm)然后用 10g/mlLBSA/mlPBS 孵育 5m)in，加入 1∶20 的 PE 标记的抗 PAR1、抗 PAR2 小鼠抗人 m)Ab、抗 PAR3、抗 PAR4 兔多克隆抗体及相应 的同型对照抗体，室温避光孵育 1h,ELISA492nm)10g/mlLBSA/mlPBS 洗 3 次,ELISA492nm)PAR3，PAR4 管再加入 FIT)C 标记的羊抗兔 Ig 二抗，室温避光孵育 1h,ELISA492nm)10g/mlLBSA/mlPBS 洗 3 次,ELISA492nm)最后用甘油封片，共聚 焦显微镜下观察. 2 结果 2.1 肺上皮细胞 PARsm)RNA 的表达肺上皮细胞表达 PAR1，PAR2，PAR3 和 PAR4 的 m)RNA，扩增 PAR1，PAR2，PAR3 和 PAR4m)RNA 的长度分别为 500,ELISA492nm)461,ELISA492nm)403 和 401bp（Fig1）广泛分布. 2.2 肺上皮细胞 PARs 蛋白质的表达流式细胞仪检测发现肺上皮细胞表达 PAR1，PAR2，PAR3 和 PAR4，其中 PAR4 的表达为最强，PAR1 和 PAR3 的表达水平 较相似，PAR2 的表达水平最弱.免疫荧光细胞染色分析进一步证实上述 PARs 在肺上皮细 胞上的表达（Fig2）广泛分布. Fig2Im)m)unofluorescencestainingofPARsonlungepithelialcells 图 2 免疫荧光细胞染色分析检测肺上皮细胞 PAR 的表达 3 讨论 PARs 家族共有 PAR1，PAR2，PAR3 和 PAR44 个成员，凝血酶可激活 PAR1、PAR3 和 PAR4，而 PAR2 可被胰蛋白酶、肥大细胞类胰蛋白酶和活化的凝血因子 Ⅹ所激活［所激活［3-5］.另外，这些受体还可被相应的 PARs 激动肽所激活.其中 PAR1 是凝血酶 的高亲和力受体，而 PAR4 只能被高浓度凝血酶激活.探究显示，凝血酶通过 PAR1 和 PAR4 途径协同互补介导血小板的活化，而 PAR3 作为 PAR4 的辅助因子，在血小板活化 中也起着一定功能［6］，除参和凝血外，多种细胞类型 PARs 的广泛激活还可参和血管损 伤反应［7,ELISA492nm)8］.PAR2 的激活可参和细胞因子及炎症介质的释放,ELISA492nm)增加微血管的渗出以及中 性粒细胞的趋化,ELISA492nm)血管扩张,ELISA492nm)血管收缩,ELISA492nm)细胞增殖等炎症的病理过程.此外，在不同的生理和病 理条件下，体内不同的内源性蛋白酶的存在，可能会激活同一细胞上的 PAR2. 我们利用 RT)PCR、流式细胞仪和免疫荧光细胞染色分析技术检测到了 4 种 PARs 在肺 上皮细胞上的表达.肺上皮细胞作为首先接触吸入性抗原的组织细胞之一，在变态反应性疾 病的发病机制中起重要功能，它能够合成和释放许多前炎症细胞因子和趋化性细胞因子，