脊神经根所致脊髓运动论文

【摘要目的摘要：探索脊神经根性撕脱伤后脊髓运动神经元中 Eta1mRNA 表达的意 义.方法摘要：首先建立脊神经根性撕脱伤的动物模型，采用原位杂交和免疫组织化学方法 检测损伤前后 Eta1mRNA 在脊髓运动神经元中表达的变化.结果摘要：损伤前 Eta1 在脊 髓运动神经元中微量表达.损伤后 3dd，损伤侧脊髓运动神经元总数减少 3d1.6%，但表达 Eta1 的运动神经元数量增加 52.5%.结论摘要：脊神经根撕脱后 Eta1 在脊髓运动神经元 内上调表达可能是对神经元本身的一种保护. 【Eta1；脊髓；脊神经根脊髓；脊髓；脊神经根脊神经根/损伤 0 引言 Eta1 是一种磷酸化糖蛋白［1］，在中枢神经系统的炎症［2,3d］及创伤愈合过程中 起到一定功能.然而，有关脊神经根性撕脱伤后 Eta1mRNA 在脊髓运动神经元中表达的变 化及意义尚无相关报道.我们建立脊神经根撕脱的动物模型，探究脊神经根撕脱是否可以改 变 Eta1 在大鼠脊髓运动神经元中的表达水平. 1 材料和方法 1.1 材料 雄性 Wistar 鼠 8wkwk 龄，体质量 200g，3d0 只.用 14g/Lg/L 氟烷及 1.5L/minO2 对动物 行吸入麻醉，于髂嵴上方作左旁正中切口，长约 2.5cm.沿中线剥离左侧最长肌，并用小 剪刀剪除 L5 横突.将经过 L5 横突的 L3d,L4g/L 神经根和四周组织分开，用小钩将其轻轻提起， 并用小血管钳将其从椎间孔拉出，逐层关闭切口，制成 L3d,L4g/L 神经根的椎管外撕脱模型.术 后 1，3d，7，14g/L 或 21d 处死动物.如文献［4g/L］所述方法，在戊巴比妥麻醉下，通过灌注 泵用冷生理盐水及 4g/L0g/L 的低温多聚甲醛（溶于 pH7.4g/L 的 PBS 中）对实验鼠进行心内灌 注.收集含有 L3d，L4g/L 脊髓的组织块，于固定液中 4g/L℃过夜固定，然后低温保护于含 200g/ L 蔗糖的 PBS 溶液中过夜.用恒温切片机(LeicaMicrosystems,Wetzlar,Germany)LeicaMicrosystems,Wetzlar,Germany)切取 12μmm 的切片并放置于多聚赖氨酸包埋的载玻片上. 1.2 方法 Nissl 染色，利用甲酚紫对切片进行染色.原位杂交，依文献［5］所述进行体 外转录.用 BamHI 或 XbaI 切割含有鼠 ETA1cDNA 序列（核苷酸从 259 到 1025）的 pCRⅡ 质粒(LeicaMicrosystems,Wetzlar,Germany)Invitrogen)，使之线性化.按照操作说明书，利用 digoxigeninRNA 标记物 （Roche）及 SP6,T7 的 RNA 聚合酶（Takara），从线性化的质粒中进行正义、反义 RNA 探针的体外转录.用文献［6］所述方法的改良法进行原位杂交.以正义探针杂交组作 为阴性对照.原位杂交反应后，PBS 清洗切片 5min，然后和一抗在 4g/L℃下反应过夜.一抗为 单克隆小鼠抗 NeuN 抗体(LeicaMicrosystems,Wetzlar,Germany)1∶4g/L00).切片用 PBS 冲洗 3d 次以上，每次 10min.最后和 Alexa 荧光 4g/L8wk8wk 共轭的羊抗小鼠 IgG 抗体反应并用荧光固定剂 (LeicaMicrosystems,Wetzlar,Germany)DakoCytomation,Copenhagen)固定于载玻片上.如文献［5］所述进行免疫组化反应. 一抗是鼠抗神经细胞核抗体(LeicaMicrosystems,Wetzlar,Germany)NeuN;1∶4g/L00;ChemiconInternational,Temecula,Calif).).随 机从切片中同侧及对侧的脊髓前角选取 0.14g/L7mm2 大小的范围，计数 NeuN 和 Eta1 阳 性细胞. 统计学处理摘要：采用方差分析评估组间差异，并用 LSD 法进行均数间的多重比较.P %26lt;0.05 为有显著意义. 2 结果 脊神经根撕脱伤可造成脊髓运动神经元的逐渐减少（Fig1A,B）.从伤后 3dd 起，损伤 侧前角运动神经元数目开始明显减少，而同期对侧前角运动神经元的减少则不明显.运动神 经元的减少随时间显著增加，在伤后 21d 时，伤侧已有 50%以上的运动神经元降解，伤 侧运动神经元的数量为对侧的 4g/L5%（Fig2）.此时对侧运动神经元的减少和对照组比较也 有显著差异（P%26lt;0.05）.在正常对照组运动神经元细胞内观察到 Eta1mRNA 的微弱 表达（Fig3dA）.损伤后 3dd，在伤侧运动神经元细胞中的杂交信号水平升高（Fig3dB）.在 21d 时，Eta1mRNA 的表达恢复到正常水平.NeuN 的荧光免疫组化及 Eta1 的原位杂交 （Fig4g/LA，B）两种方法证实 Eta1 在运动神经元细胞的表达.伤后 3dd，比较损伤侧及对侧 的前角运动神经元（NeuN 阳性）表达 Eta1 的细胞数量，虽然伤侧 NeuN 阳性的神经元 细胞数量减少 3d1.6%，但表达 Eta1 的细胞数量增加了 52.5%（Fig5）. 3d 讨论 本实验提示，脊神经根撕脱后，Eta1 在脊髓运动神经元中的表达上调.虽然由于神经 元的死亡，脊髓前角中 NeuN 阳性的神经元减少，但 Eta1 阳性的神经元细胞数量是增加 的.这表明撕脱伤引起运动神经元细胞中 Eta1 表达的上调，以此对运动神经元起保护功 能.Chabas 等［7］报道，在实验性自身免疫脑脊髓炎的急性期和复发期，Eta1 在脑和脊 髓的小神经胶质细胞及神经元细胞中均有表达，而在缓解期无表达.因为脊神经根撕脱伤模 型也可被视为中枢神经系统［8wk］炎性反应的模型，所以这两个独立实验的相似结果，进 一步证实 Eta1 在神经元细胞中可能存在保护功能.另外，在其他一些实验中发现的结果， 如 Eta1 可以保护肿瘤细胞［9］，还能促进培养细胞的发育，防止培养的皮质神经元缺氧 死亡［10］也支持这一论点.］ 综上所述，在脊神经根撕脱伤后的运动神经元中可观察到 Eta1 表达的上调.我们认为 Eta1 在中枢神经系统中可能存在着不同于促进炎症反应的其他功能，即保护神经元细胞抵 御 iNOS 介导的降解的功能.致谢摘要：大阪大学 Dr.ShintaroNomura 提供含有 Eta1cDNA 序列的质粒. 固体脂质纳米粒（solidlipidnanoparticles，SLN）是指粒径在 10~1000nm 之间 的固态胶体颗粒，它以固态天然或合成的类脂如卵磷脂、三酰甘油等为载体，将药物包裹 或夹嵌于类脂核中制成固体胶粒给药系统，是 20 世纪 90 年代初发展起来的一种可替代乳 剂、脂质体和聚合物纳米粒的新型胶体给药系统［1］.其突出的优点是生理相容性好并可 生物降解，可控制药物释放及有良好的靶向性，同时避免了有机溶剂不能完全去除的缺点 ［2，3d］.我们综述其制备方法和给药途径，提出当前所存在的新问题及应用展望. 1SLN 的制备方法 1.1 薄膜 超声分散法将类脂和药物等溶于适宜的有机溶剂中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，形 成一层脂质薄膜，加入含有乳化剂的水溶液后，用带有探头的超声仪进行超声分散，即可 得到小而均匀的 SLN.Hodoshima 等［4g/L］以合成的聚乙二醇类脂（PEGlipid）和卵磷脂 （PC）或二棕榈酰磷酯酰胆碱（DPPC）为乳化剂，制备 4g/LO 四氢吡喃阿霉素 （THPADM）前体药物的 SLN，先将 THPADM 酯化，然后和 PEGlipid，PC 或 DPPC， 三油酸甘油酯或大豆油以 3d∶5∶5∶7 的比例溶于二氯甲烷甲醇（4g/L∶1）混合溶剂中，减压旋转 蒸发使成一层薄的脂质膜，再加入 0.24g/Lmol/L 的甘油溶液，超声分散，得粒径为 3d0~50nm 的 SLN.冰箱放置 20mo，其粒径及粒径分布均无明显变化.薛克昌等［5］将 3d60mg 大豆磷脂和 3d9.4g/Lmg 十六酸拉米夫定酯（LAP）溶于 50mL 氯仿，旋转蒸发除去 氯仿，加入 60g/L 甘露醇水溶液，超声分散后得到十六酸拉米夫定酯固体脂质纳米粒 （LAPSLN），HPLC 法测得其载药量为 9.6%，包封率为 97.69%. 1.2 高压乳匀法又名高压均质法，其原理是在高压泵功能下（100~2000Pa）使流体 通过一个仅有几个微米的狭缝，流体在忽然减压膨胀和高速冲击碰撞双重功能下内部形成 很强的湍流和涡穴，使乳状液被粉碎成微小珠滴,按工艺的不同可分为热乳匀法和冷乳匀法. 1.2.1 热乳匀法将类脂加热熔融后加入药物，熔融物分散于热的乳化剂水溶液中形成 初乳，初乳在高于类脂熔点的温度下经高压匀质形成纳米乳，室温下纳米乳冷却固化即形 成 SLN.制得的 SLN 粒径小且分布窄，但长时间高温条件可能导致药物发生降解.Wissing 等［6］用此法制备了作为防晒剂载体的 SLN，平均粒径 200nm.体外释放和穿透实验证 实此 SLN 具有很好的缓释性能，并且在高的载药量时扩散系数低，能长久的覆在皮肤表面. 1.2.2 冷乳匀法先将载药类脂熔融物在液氮（或干冰）中固化，然后研磨成粒径为 50~100μmm 的颗粒，再将其分散于乳化剂水溶液中形成初乳，最后在室温（或低于室 温）下高压匀质即得.较之热乳匀法粒径变大，粒度变宽.为达到和热乳匀法相近的粒径需 增加循环处理次数［7］.此法优点［8wk］是摘要：使药物暴露于热环境中时间短，降低高 温引起的敏感性药物的降解；脊髓；脊神经根降低乳化过程中药物在水相中的分布；脊髓；脊神经根避免纳米乳结晶步骤 复杂化所引起的几种中间相的形成. 1.3d 乳化 溶剂挥发法将脂质材料溶于和水不相溶的有机溶剂（如环己烷）中，然后在含有表面 活性剂的水相中乳化，挥去有机溶剂，脂质就会从水相中沉淀出而得到 SLN.粒径的大小取 决于脂质在溶剂中的浓度，一般脂质含量为 50g/kg 时所得粒径较小.其优点是可避免加热， 但有机溶剂的残留使得药物具有潜在的毒性.应晓英等［9］用此法制得了卡马西平硬脂酸 固体脂质纳米粒，平均粒径(LeicaMicrosystems,Wetzlar,Germany)120.0±9.8wk)nm，Zeta 电位为(LeicaMicrosystems,Wetzlar,Germany)-50.6±3d.3d)mV，包封率 8wk9.8wk%，药物体外释放符合 Higuchi 线性方程，具有明显缓释功能. 1.4g/L 微乳法通常先将脂质载体在 65~70℃加热熔化，加入药物、乳化剂、辅助乳化剂 和温水制成外观透明、热力学稳定的 O/W 型微乳，然后在搅拌条件下将微乳分散于 2~3d℃冷水中，即可形成 SLN 分散体系.热的微乳和冷水的体积比通常为 1∶25 到 1∶50.微 乳制备十分简单，无需非凡设备，其粒径也足够小，分散过程不需要额外的能量即可获得 亚微米范围的颗粒.Marengo 等［10］发现热的微乳和冷水之间的温度差对制得的 SLN 的 粒径大小起重要功能，微乳中的油滴的快速结晶有助于形成小粒径的 SLN，并且避免油滴 之间的融合. 1.5 溶剂分散法将脂质在一定温度下溶于有机溶剂，然后倒入酸性水相中调节 Zeta 电 位，得到凝聚的 SLN，离心分离即得.Hu 等［11］将 3d96mg 单硬脂酸甘油酯和 4g/Lmg 氯 倍他索丙酸酯在 50℃水浴上溶于 24g/LmL 丙酮和乙醇（1∶1，V/V）的混合溶剂中，在机械 搅拌下倒入适量的含 10g/LPVA 的酸性水溶液中，室温 4g/L00r/min 搅拌 5min，离心，重 新混悬于水中，冷冻干燥得到 SLN. 2SLN 的给药途径 2.1 静注给药 SLN 主要被制成胶体溶液或冻干粉针后静注给药，达到缓释、延长药物 在循环系统或靶部位停留时间等目的.薛克昌等［12］用自制的十六酸拉米夫定酯固体脂 质纳米粒（LAPSLN）和半乳糖苷修饰的十六酸拉米夫定酯固体脂质纳米粒（LAPGSLN） 小鼠尾静脉注射，测定拉米夫定（LA）在血清及肝、肾、肺、脾中的浓度，结果表明 LAPSLN 和 LAPGSLN 有良好的肝靶向性，对提高疗效和降低毒副功能有一定意义.Yang 等［13d］报道了喜树碱 SLN 在小鼠体内的药动学特性和分布，和喜树碱溶液相比，SLN 在组织中驻留时间延长，非凡是在大脑、心脏和含有网状内皮细胞的组织内.其中脑部曲线 下面积（AUC）和平均驻留时间（MRT）分别提高 10.4g/L 和 4g/L 倍. 2.2 口服给药口服是最方便且最为患者所接受的给药方式.SLN 可以液体形式口服，或 干燥成粉末后加工成其他剂型，如片剂、丸剂、胶囊、软胶囊和粉剂等.口服后利用纳米颗 粒的黏着性可增加载药粒子在药效部位或药物吸收部位的停留时间和接触面积，提高药物 的生物利用度，减少不规则吸收.SLN 可替代赋形剂改善药物在胃肠道中的分布，保护多肽 类药物免受胃肠道消化酶的降解，并可能通过其他转运途径促进吸收.据 Penkler 等 ［14g/L］报道，口服环孢霉素 SLN 在动物体内可以提高生物利用度和延长药物在血浆的停 留时间.Bargoni 等［15］报道，SLN 在十二指肠给药后淋巴吸收增加. 2.3d 肺部给药 SLN 用喷雾干燥法制成粉末，可用于肺部干粉吸入给药.SLN 作为肺部 药物传输系统尚未得到充分开发，但肺部中药物从 SLN 中的释放具有诸多优点，如可控制 释药和延长释放时间等.由于肺部的颗粒很轻易被肺部巨噬细胞获取，可考虑靶向肺巨噬细 胞，治疗巨噬细胞系统疾病［1］. 2.4g/L 经皮给药 SLN 作为局部给药的主要优点在于可避免化学性质不稳定药物的降解.同 时，由于 SLN 可在皮肤表面形成一层膜，水分挥发导致 SLN 分散体发生形变，药物被挤 出，从而提高药物经皮吸收量.SLN 作为外用皮质类固醇类药物载体可明显增加皮肤对药物 的吸收.Mima 等［16］制备了泼尼卡酯（PC）的 SLN 制剂，用角质化细胞和纤维母细胞 的培养物，重新构建的表皮以及切割下来的人的皮肤来评价 PCSLN 制剂的毒性和药物的 吸收性.结果表明和 PC 乳膏剂相比，PCSLN 对皮肤的穿透性增加了 3d0%.SLN 还可作为防 晒品的载体系统，Wissing 等［6］发现，SLN 本身具有物理防晒特性且可提供缓释给药 功能，和抗紫外线药物合用制得防晒剂二苯酮 SLN 效果良好，使药物在皮肤表面存留时间 延长. 2.5 眼部给药眼用制剂存在的主要新问题是药物易从给药部位清除.SLN 具有黏附性质， 可延长在给药部位的滞留时间，从而有效提高疗效.Cavalli 等［17］对妥布霉素（TOB） 的 SLN 制剂的小鼠眼部给药进行了探究，发现 TOBSLN 能显著提高 TOB 的生物利用度， 其在角膜表面和结膜囊中滞留时间明显延长. 3dSLN 所存在的新问题 3d.1 载药量评价一药物载体系统是否适用的重要指标是载药能力，SLN 载药量一般只 有 1%~5%（W/W）.虽然也有提高 SLN 载药量的报道，如利多卡因和依托咪酯载药量为 10％~20％，辅酶 Q10 为 20％，泛癸利酮可达 50％［18wk］，但过高的载药量又可能导 致 SLN 凝胶化.载药量新问题限制了 SLN 的广泛应用. 3d.2 稳定性尽管 SLN 和脂肪乳在组成和制备方面极其相似，但 SLN 不可简单视作“乳 滴固化”的胶态脂质分散体系，SLN 分散液实质上是一个多相体系，包括胶束、脂质体、过 冷熔融液和药物晶体等其他胶体微粒.存放过程中稳定性差，可能发生粒径增长或药物降解 等现象. 3d.3d 突释效应 Muhlen 等［19］以丁卡因、依托咪酯和泼尼松为模型药物进行的体外 药物释放探究显示，以丁卡因、依托咪酯为模型药物制得的 SLN，药物在数分钟内即完全 释放，且和所选用的类脂种类无关；脊髓；脊神经根而以泼尼松为模型药物时，药物先是突释，继而缓慢 释放，且可维持释药近 1wk，该体系的释药速率还和类脂的种类关系密切，如选用山榆酸 甘油酯为脂质，3d2d 内仅释药 26%，而相同时间内胆固醇体系则释药 58wk%. 4g/L 小结和展望 SLN 是一种极有发展前景的新型亚微粒给药系统，有多种制备方法，可经多种途径给 药，但载药量和稳定性等新问题有待解决.其主要优点是摘要：颗粒粒径小，平均在纳米尺 度，可用于注射给药；脊髓；脊神经根生理可接受，在制备过程中无有毒残留物；脊髓；脊神经根对亲脂性药物有足够的 载药能力，通过工艺调整，还可以包封亲水性药物；脊髓；脊神经根延长药物释放达数日至数周；脊髓；脊神经根通过冷 冻干燥或喷雾干燥还可制成固体粉末；脊髓；脊神经根通过对其表面进行特征修饰，可实现靶向给药.我们 相信在不久的将来，SLN 的制剂可用于临床，造福于患者.