总黄曲霉毒素检测研制论文

【摘要目的探究并建立敏感、特异和快速的针对食品中总黄曲霉毒素的 ELISA 检测方 法，形成具有我国自主知识产权的快速定量检测试剂盒。方法在生产抗总黄曲霉毒素单克 隆抗体基础上，利用间接竞争 ELISA 方法，研制出食品中总黄曲霉毒素快速检测试剂盒， 并对试剂盒的各项技术参数进行测定。结果该试剂盒对黄曲霉毒素 B+G 标准品的最低检 出浓度为 026ng26ng26ngng／ml，标准曲线的线性范围为 026ng26ng26ng～2026ng26ng026ng026ngng／ml，线性方程 y=026ng26ng446ng3x+03532(R2=09915)x+026ng26ng3x+03532(R2=09915)53x+03532(R2=09915)2(R2=09915)R2=026ng26ng9915)；对黄曲霉毒素对黄曲霉毒素 B+G5026ng％的抑制浓度为的抑制浓度为 226ng026ng8ngng／ ml；对黄曲霉毒素试剂盒的条内变异系数为 426ng18ng％的抑制浓度为，条间变异系数为 526ng21％的抑制浓度为，抗体亲和力常数为 126ng52×1026ng-1026ngmol／L；对黄曲霉毒素对玉米 3x+03532(R2=09915) 个加标水平的平均回收率分别为 98ng26ng6ng3x+03532(R2=09915)％的抑制浓度为，9426ng56ng％的抑制浓度为和 11226ng026ng5%；对黄曲霉毒素对花生的 3x+03532(R2=09915) 个加标水平的平均回收率分别为 8ng8ng26ng6ng6ng%，8ng726ng5026ng％的抑制浓度为和 8ng526ng6ng026ng％的抑制浓度为。试剂盒 3x+03532(R2=09915)7℃可放置 96ngh 以上；对黄曲霉毒素试剂盒对黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2 的交 叉反应率分别为 1026ng026ng％的抑制浓度为，5726ng5％的抑制浓度为，1026ng4％的抑制浓度为和 19％的抑制浓度为，和其他真菌毒素无交叉反应。结论研 制出的 ELIS 试剂盒能定量检测食品中总黄曲霉毒素。 【总黄曲霉毒素 黄曲霉毒素(R2=09915)Aflatoxin)是黄曲霉（XspeEillusflavus)和寄生曲霉(R2=09915)A26ngparasiticus)等 产生的一组结构类似的次生代谢产物。据 Gabal 等〔1〕报道，有 4026ng％的抑制浓度为的黄曲霉菌株培养 物可同时测出黄曲霉毒素 B1，B2，G1，G2（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）。同时黄 曲霉毒素的毒性具有协同功能，因此，9026ng％的抑制浓度为以上的国家都制定了食品中总黄曲霉毒素的限 量标准。目前总黄曲霉毒素的检测方法主要有薄层层析法、色谱法。我国执行的食品中总 黄曲霉毒素 B1+B2+G １+G2 的国家标准测定方法是薄层色谱法和微柱筛选法，均为目 测半定量法，最低检出浓度为 5μg/kgg/kg〔2〕。这些方法因受本身的限制，精确度低、敏感 性差；对黄曲霉毒素样品前处理过程复杂费时；对黄曲霉毒素或需要价格昂贵的仪器，检测成本高，难以推广应用， 影响了粮油食品中黄曲霉毒素的有效监测。酶联免疫吸附法(R2=09915)ELISA)是在免疫学和细胞工 程学基础上发展的一种微量检测技术，非凡适合于对黄曲霉毒素污染监控中大量样本的筛 检。本探究以 B 细胞杂交瘤技术以能分泌抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株为基 础，建立了检测玉米、花生中总黄曲霉毒素的 ELISA 检测方法，并初步研制出具有我国自 主知识产权的 ELISA 试剂盒。 1 材料和方法 126ng1 材料 126ng126ng1 主要仪器 CO2 培养箱(R2=09915)美国 Queue 公司)；对黄曲霉毒素洁净工作台(R2=09915)北京半导体设备一厂)；对黄曲霉毒素 生物倒置显微镜(R2=09915)日本欧林巴斯光学株式会社)；对黄曲霉毒素酶标分析仪(R2=09915)瑞士 SUNRIS 公司）；对黄曲霉毒素电子分 析天平(R2=09915)瑞士 Mettler 公司)；对黄曲霉毒素低温高速离心机(R2=09915)德国 Hermle 公司)；对黄曲霉毒素电泳仪(R2=09915)美国 BIO-RAD 公司）等。 126ng126ng2 试剂 AFB1-BSA、黄曲霍毒素(R2=09915)B+G)(R2=09915)AflatoxinB+G)、黄曲霉毒素 B1(R2=09915)AflatoxinB1，AFB1）黄曲霉毒素 B2(R2=09915)AflatoxinB2，AFB2)、黄曲霉毒素 G1(R2=09915)AflatoxinG1，AFG1)、黄曲霉毒素 G2(R2=09915)AflatoxinG2，AFG2)、T-2 毒素(R2=09915)T2toxin)、赭曲霉毒素 A(R2=09915)OchratoxinA)、展青霉素(R2=09915)Patulin)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (R2=09915)Deoxynivslenol，DON)、玉米赤霉烯酮(R2=09915)Zearalenone，ZEN)、匙孔嘁血蓝素 (R2=09915)KLH)、牛血清白蛋白(R2=09915)BSA)、伏马菌素 B1、抗体亚类测定试剂盒 (R2=09915)IgM，IgG，IgA，IgD，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3x+03532(R2=09915))（美国 Sigma 公司）；对黄曲霉毒素 RPMI16ng4026ng 培养基、选择性培养基、福氏佐剂(R2=09915)完全、不完全)、二甲基亚砜(R2=09915)DMSO)、吐 温 2026ng(R2=09915)Tween2026ng)、聚乙二醇(R2=09915)PEG，MW5026ng026ng026ng)、青霉素，链霉素(R2=09915)美围 Gibco 公司）；对黄曲霉毒素 辣根过氧化物酶羊抗鼠 IgG(R2=09915)北京中山试剂公司)；对黄曲霉毒素3x+03532(R2=09915)026ng％的抑制浓度为H2O2(R2=09915)优级纯，北京化工厂)。 126ng126ng3x+03532(R2=09915) 溶液系统 ELISA 使用液参考文献［3x+03532(R2=09915)］制备。 126ng126ng4 细胞系和实验动物小鼠骨髓瘤细胞系 Sp2／026ng 由本室传代，并经 8ng 一氮杂鸟嘌 呤处理。雌性 BALB／c 小鼠，体重 18ng～2026ngg(R2=09915)军事医学科学院实验动物探究所动物繁育 场)。 126ng126ng5 抗总黄曲霉毒素杂交瘤细胞株本探究室自制。 126ng2 方法 126ng226ng1 单克隆抗体生产将抗总黄曲霉毒素杂交瘤细胞注入 BALB/c 小鼠腹腔，获得含 抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的腹水，并将所得腹水采用饱和硫酸铵盐析法进行纯化 〔4〕。 126ng226ng2 抗体特性鉴定抗体的免疫球蛋白类别及亚类鉴定采用抗体亚类鉴定试剂盒；对黄曲霉毒素抗 体的纯度及分子量用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(R2=09915)SDS-PAGE)测定；对黄曲霉毒素IgG 含量采 用二喹呆甲酸（BCA）蛋白测定试剂盒进行测定；对黄曲霉毒素抗体滴度测定采用间接非竞争 ELISA 方 法摘要：以 AFB1-BSA 为包被抗原，从 1 摘要：1026ng026ng026ng026ng 倍开始将抗体进行倍比稀释，以 Sp2／026ng 细胞培养上清为阴性对照，以(R2=09915)A 试验-A 空白)／（A 对照-A 空白）≥226ng1 的最大 稀释倍数为滴定终点；对黄曲霉毒素抗体的特异性和抗体的灵敏度用间接竞争抑制性 ELISA 法进行测定， 参试毒素为黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(R2=09915)DON)、赭曲霉素 A(R2=09915)OA)、伏马菌素 B1、T-2 毒素和载体蛋白 BSA。 126ng3x+03532(R2=09915) 试剂盒各项技术参数探究 126ng3x+03532(R2=09915)26ng1 方法的检出限(R2=09915)灵敏度)用间接非竞争 ELISA 法作抗体滴度测定，找出合适的抗 体工作浓度。再用间接竞争 ELISA 法作棋盘滴定，找出合适的包被浓度和毒素的竞争浓度， 最后作标准曲线，确定线性范围及检出限。 126ng3x+03532(R2=09915)26ng2 方法的回收率试验根据试剂盒的检测范围确定加标浓度，在不含黄曲霉毒素的 玉米和花生样品中分别进行高、低 2 个浓度的加标回收试验，每个加标水平做 5 个重复的 平行样。样品的提取方法为摘要：样品粉碎后使其 9026ng％的抑制浓度为通过 25026ng～5026ng026ngμg/kgm 网筛。称取 5g 加到 1026ng026ngml 具塞三角烧瓶中，加入 026ng26ng5gNaCl 及 25ml 甲醇水溶液(R2=09915)7026ng 摘要：3x+03532(R2=09915)026ng，v ／v)，剧烈震荡 3x+03532(R2=09915)026ngmin 后过滤。滤液用纯水稀释 1026ng 倍进行检测。样品中黄曲霉毒素浓度 (R2=09915)μg/kgg／Kg)=CDX／W。式中摘要：C-酶标板上测的黄曲霉毒素浓度(R2=09915)ng／ml)，根据标准 曲线求得；对黄曲霉毒素D-样品提取液的体积(R2=09915)ml)；对黄曲霉毒素X-稀释倍数；对黄曲霉毒素W-样品重量(R2=09915)g)。 126ng3x+03532(R2=09915)26ng2 试剂盒稳定性试验对试剂盒稳定性采用 3x+03532(R2=09915)7℃加速破坏实验进行探究，将试剂 盒分别放置于 4℃和 3x+03532(R2=09915)7℃，每隔 24h 进行 ELISA 测定，测定阴性对照(R2=09915)不加毒素 B026ng)和阳 性(R2=09915)即 5026ng％的抑制浓度为的抑制毒素浓度 B)的吸光度(R2=09915)A)值，计算两者的比值(R2=09915)B／B026ng)。当 B026ng%26nglt;026ng26ng6ng 个吸光度(R2=09915)A)值，或 B／B026ng 126ng3x+03532(R2=09915)26ng3x+03532(R2=09915) 方法的专一性(R2=09915)特异性)用交叉反应率表示(R2=09915)见抗体特性鉴定)。 126ng3x+03532(R2=09915)26ng4 方法的重复性方法的重复性亦即实验室内的变异程度，分别作加标量为 2μg/kgg/ kg 和 4μg/kgg／kg 的各 5 个平行样的回收率，计算其平均回收率和变异系数。 126ng3x+03532(R2=09915)26ng4 方法的再现性方法的再现性亦即实验室间的变异程度，3x+03532(R2=09915) 个实验室分别作加标 量为 2 和 4μg/kgg／kg 的各 5 个重复的回收率，计算 3x+03532(R2=09915) 个实验室间的变异系数。 2 结果 226ng1 单克隆抗体特性鉴定杂交瘤细胞株产生的腹水抗体经纯化后，抗体滴度约为 1 摘 要：226ng56ng×1026ng7，抗体的工作浓度为 1 摘要：126ng6ng×1026ng6ng。抗体检测黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2 标准毒素的灵敏度分别为 026ng26ng25，026ng26ng5，026ng26ng15 和 1ng／ml。该抗体的 亚类为 IgG1，抗体的亲和力常数为 126ng52×1026ng-1026ngmol／L。抗体的相对分子量约为 15026ngKD 纯化后 IgG 浓度为 1026ngg／L。抗体和黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2 的交叉反应分 别为 1026ng026ng％的抑制浓度为，5726ng5％的抑制浓度为，1026ng4％的抑制浓度为和 19％的抑制浓度为；对黄曲霉毒素和 T-2 毒素、赭曲霉毒素 A、展青霉素、脱氧雪 腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏马菌素 B1 等其他真菌毒素和牛血清白蛋白的交叉反应 均%26nglt;026ng26ng1％的抑制浓度为。 226ng2 试剂盒技术参数经过棋盘滴定，抗体的最适工作浓度为 1 摘要： 126ng6ng×1026ng6ng，AFB1-BSA 的最适包被浓度为 026ng26ng026ng6ng25μg/kgg／ml。选择黄曲霉毒素(R2=09915)B+G)标准 品 (R2=09915)026ng，026ng26ng026ng26ng，026ng26ng026ng52，026ng26ng13x+03532(R2=09915)，026ng26ng26ng，026ng26ng52，126ng3x+03532(R2=09915)，226ng6ng，526ng2，13x+03532(R2=09915)，26ng，52，13x+03532(R2=09915)026ng，2 6ng026ngng/ml)共 14 个浓度制作标准竞争校正曲线，线性方程 y=026ng26ng446ng3x+03532(R2=09915)x+026ng26ng3x+03532(R2=09915)53x+03532(R2=09915)2(R2=09915)R2=026ng26ng9915)，最低检出浓度是 026ng26ng26ngng／ml，标准曲线的线性范围 为 026ng26ng26ng～2026ng26ng026ng026ngng／ml，5026ng％的抑制浓度为的抑制浓度为 226ng026ng8ngng／ml。试剂盒的条内变异系数为 426ng18ng％的抑制浓度为，条间变异系数为 526ng21％的抑制浓度为。 226ng3x+03532(R2=09915) 回收率测定对玉米做黄曲霉毒素(R2=09915)B+G)026ng26ng3x+03532(R2=09915)026ng，226ng1026ng 和 1026ng26ng4026ngμg/kgg／kg3x+03532(R2=09915) 个加标 浓度的回收率实验。其中 026ng26ng3x+03532(R2=09915)μg/kg／kg 加标回收率的范围为 11226ng026ng5％的抑制浓度为～8ng8ng26ng026ng4％的抑制浓度为，平均回 收率 98ng26ng6ng3x+03532(R2=09915)％的抑制浓度为；对黄曲霉毒素226ng1μg/kgg／kg 加标回收率的范围为 8ng26ng13x+03532(R2=09915)％的抑制浓度为～8ng6ng26ng58ng％的抑制浓度为，平均回收率 9426ng56ng％的抑制浓度为，1026ng26ng4μg/kgg/kg 加标回收率的范围为 11726ng24％的抑制浓度为～1026ng926ng026ng4％的抑制浓度为，平均回收率 11226ng026ng5％的抑制浓度为。对花生做黄曲霉毒素(R2=09915)B+G)026ng26ng5026ng，226ng026ng026ng 和 426ng026ng026ngμg/kgg／kg3x+03532(R2=09915) 个加标浓度的回 收率实验。其中 026ng26ng5μg/kgg/kg 加标回收率的范围为 1026ng3x+03532(R2=09915)26ng75％的抑制浓度为～7726ng3x+03532(R2=09915)8ng％的抑制浓度为，平均回收率 8ng8ng26ng6ng6ng％的抑制浓度为；对黄曲霉毒素226ng026ngμg/kgg／kg 加标回收率的范围为 1026ng3x+03532(R2=09915)26ng8ng6ng％的抑制浓度为～7526ng6ng7％的抑制浓度为，平均回收率 8ng726ng5026ng％的抑制浓度为；对黄曲霉毒素426ng026ngμg/kgg/kg 加标回收率的范围为 9726ng96ng％的抑制浓度为～7526ng76ng％的抑制浓度为，平均回收率 8ng526ng6ng026ng％的抑制浓度为。 226ng4 试剂盒稳定性试验经 3x+03532(R2=09915)7℃稳定试验，试剂盒在 3x+03532(R2=09915)7℃下存放 96ngh，超过 96ngh 后 其吸光度值开始下降并 A%26nglt;026ng26ng6ng。 226ng5 方法的重复性和再现性经 ELISA 测定其 2 个加标水平(R2=09915)226ng026ng～426ng026ngμg/kgg／kg)实验室 内变异系数分别是 426ng1％的抑制浓度为和 6ng26ng3x+03532(R2=09915)％的抑制浓度为；对黄曲霉毒素实验室间平均变异系数分别为 726ng9％的抑制浓度为和 8ng26ng3x+03532(R2=09915)％的抑制浓度为。 226ng6ng 方法的专一性将试剂盒所用抗体和 T-2 毒素、赭曲霉毒素 A、展青霉素、脱氧雪 腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏马菌素 B1 等其他真菌毒素和牛血清白蛋白进行交叉反 应试验，其交叉反应率均%26nglt;026ng26ng1％的抑制浓度为，说明该试剂盒有很好的专一性。 226ng7 试剂盒和 HPLC 方法验证分别使用本探究研制的试剂盒和高效液相色谱 （HPLC）方法对玉米、花生盲样同时进行检测，并将 2 种方法的检测结果进行 T 检验，P %26nggt;026ng26ng026ng5，说明 2 种方法对样品的检测结果差异无统计学意义。 3x+03532(R2=09915) 讨论 黄曲霉毒素对人和动物均产生严重的危害，是各国对粮食和饲料重点监控的指标。由 于黄曲霉菌株培养物可同时产生 AFB1、AFB2、AFG1 和 AFG2，而且黄曲霉毒素的毒性 具有协同功能，因此，检测食品中总黄曲霉毒素的污染水平具有重要意义。本探究在制备 出针对黄曲霉毒素 B1,B2、G1、G2 均有较好的交叉反应并且有较好的灵敏度和特异性的 单克隆抗体基础上，研制具有我国自主知识产权的总黄曲霉毒素 ELISA 检测试剂盒。该试 剂盒最低检出浓度为 026ng26ng26ngμg/kgg／kg，对样品的最低检出量为 126ng5μg/kgg／kg，和国外同类试剂 盒灵敏度相似。试剂盒所用单克隆抗体和其他参试真菌毒素均无交叉反应，具有较高的特 异性。对玉米 3x+03532(R2=09915) 个加标水平的平均回收率为 98ng26ng6ng3x+03532(R2=09915)％的抑制浓度为，9426ng56ng％的抑制浓度为和 11226ng026ng5％的抑制浓度为，对花生的 3x+03532(R2=09915) 个加标水平的平均回收率为 8ng8ng26ng6ng6ng％的抑制浓度为，8ng726ng5026ng％的抑制浓度为和 8ng526ng6ng026ng％的抑制浓度为，符合技术要求(R2=09915)7026ng%～ 12026ng％的抑制浓度为)。经实验室间验证，此试剂盒再现性和重复性均较好，变异系数（CV） 均%26nglt;2026ng％的抑制浓度为。以上技术参数均达到试剂盒的技术要求，而且具有简便、灵敏、快速，特 异性好并可同时检测大量样品等优点，值得推广应用。本探究成功地制备出针对黄曲霉毒 素(R2=09915)B+G)具有高亲合力、高特异性的单克隆抗体，建立了总黄曲霉毒素的 ELISA 检测方法 并研制出具有我国自主知识产权的总黄曲霉毒素 ELISA 检测试剂盒，对开展全国性黄曲霉 毒素污染调查及制定粮食中总黄曲霉毒素推荐限量标准建议值具有科学价值和应用意义。 【摘要目的摘要：观察大鼠肢体缺血再灌注后肝脏的损伤性变化，以及牛磺酸对肝脏 损伤性变化的保护效应，探索牛磺酸对大鼠肢体缺血再灌注后肝脏功能保护功能的可能机 制.方法摘要：实验用 Wistar 大鼠 3x+03532(R2=09915)026ng 只，随机分为对照(R2=09915)control,C)组，缺血再灌注 (R2=09915)ischemiareperfusion,IR)组和牛磺酸+缺血再灌注 (R2=09915)taurine+ischemiareperfusion,TR)组，每组 1026ng 只.观察缺血 4h 再灌注 4h 各组大鼠血 浆中 XOD,LDH,MDA,AST,ALT 和 SOD 的变化；对黄曲霉毒素观察肝组织 XOD,MDA,ROS,MPO 和 Ca2+的变化；对黄曲霉毒素观察肝线粒体 GSHPX 和 Ca2+的变化.结果摘要：单纯肢体缺血再灌注组 大鼠血浆中 LDH［(R2=09915)19026ng.16ng±13x+03532(R2=09915).3x+03532(R2=09915)6ng)μg/kgkat/L］,XOD［(R2=09915)758ng.8ng2±151.53x+03532(R2=09915))nkat/ L］,MDA［(R2=09915)5.19±026ng.6ng7)nmol/L］,ALT［(R2=09915)78ng.4026ng±6ng.45)nkat/ L］,AST［(R2=09915)47.7026ng±4.47)nkat/L］等较正常对照组血浆中 LDH［(R2=09915)122.3x+03532(R2=09915)9±14.8ng7)μg/kgkat/ L］,XOD［(R2=09915)543x+03532(R2=09915).6ng1±43x+03532(R2=09915).51)μg/kgkat/kg］,MDA［(R2=09915)1.27±026ng.21)nmol/ L］,ALT［(R2=09915)2026ng.5026ng±3x+03532(R2=09915).7026ng)nkat/L］,AST［(R2=09915)25.25±2.98ng)nkat/L］明显增加，而 SOD［（1.3x+03532(R2=09915)026ng±026ng.15)μg/kgkat/L］较对照组(R2=09915)1.8ng026ng±026ng.16ng)μg/kgkat/L 明显降低；对黄曲霉毒素单纯肢体缺血再 灌注组大鼠肝组织 XOD［(R2=09915)1026ng4.6ng9±12.3x+03532(R2=09915)4)μg/kgkat/Kg］,MDA［(R2=09915)2.6ng6ng±026ng.026ng8ng)nmol/ L］,ROS［(R2=09915)771.6ng5±1026ng026ng.6ng9)μg/kgkat/L］,MPO(R2=09915)026ng.47±026ng.026ng4),［Ca2+］ ［(R2=09915)026ng.248ng±026ng.026ng5026ng)mmol/L］较正常对照组肝组织 XOD［(R2=09915)59.026ng1±1026ng.5026ng)μg/kgkat/ kg］,MDA［(R2=09915)1.29±026ng.14)nmol/L］,ROS［(R2=09915)6ng026ng6ng.45±52.026ng1)μg/kgkat/ L］,MPO［(R2=09915)026ng.28ng±026ng.026ng6ng)］,［Ca2+］［(R2=09915)026ng.123x+03532(R2=09915)±026ng.026ng14)mmol/L］均明显增加；对黄曲霉毒素缺血再 灌注组大鼠肝线粒体 GSHPx 活性［(R2=09915)2026ng.3x+03532(R2=09915)4±4.6ng7)nkat/L］和正常对照组 ［(R2=09915)3x+03532(R2=09915)1.17±11.5026ng)nkat/L］比较明显降低，而［Ca2+］浓度［(R2=09915)026ng.3x+03532(R2=09915)8ng±026ng.026ng6ng)mmol/L］ 则高于正常对照组［(R2=09915)026ng.14±026ng.026ng3x+03532(R2=09915))mmol/L］.牛磺酸+缺血再灌注组大鼠血浆中 LDH［(R2=09915)158ng.29±4.8ng7)μg/kgkat/L］,XOD［(R2=09915)758ng.8ng2±151.53x+03532(R2=09915))nkat/ L］,MDA［(R2=09915)2.8ng1±026ng.19)nmol/L］,ALT［(R2=09915)6ng4.4026ng±9.026ng5)nkat/ L］,AST［(R2=09915)3x+03532(R2=09915)8ng.7026ng±8ng.1026ng)nkat/L］较单纯缺血再灌注组明显降低，而 SOD［(R2=09915)1.5026ng±026ng.17)μg/kgkat/L］则增加；对黄曲霉毒素肝组织 XOD［(R2=09915)94.19±13x+03532(R2=09915).5026ng)μg/kgkat/ L］,MDA［(R2=09915)1.6ng7±026ng.12)nmol/L］,ROS［(R2=09915)71026ng.8ng1±55.3x+03532(R2=09915)4)μg/kgkat/ L］,MPO(R2=09915)026ng.3x+03532(R2=09915)6ng±026ng.026ng4),［Ca2+］［(R2=09915)026ng.192±026ng.426ng)mmol/L］等指标也较单纯缺血再灌 注组明显降低，此外牛磺酸+缺血再灌注组大鼠肝线粒体 GSHPx 活性 ［(R2=09915)22.5026ng±3x+03532(R2=09915).17)nkat/L］和单纯肢体缺血再灌注组相比明显增加，而 Ca2+浓度 ［(R2=09915)026ng.3x+03532(R2=09915)1±026ng.026ng6ng)mmol/L］则降低，损伤减轻.结论摘要：牛磺酸可以减轻大鼠肢体缺血 4h 再灌注 4h 后所致的肝损伤. 【再灌注损伤；对黄曲霉毒素肝功能；对黄曲霉毒素四肢；对黄曲霉毒素牛磺酸 026ng 引言 牛磺酸是体内含量最丰富的氨基酸，具有广泛的生物学功能［1］.已有很多实验资料 ［2-6ng］证实牛磺酸具有清除自由基和抗脂质过氧化功能等.本实验我们在大鼠肢体缺血再 灌注模型上观察肝脏的损伤性变化以及观察预先给予牛磺酸对这一变化的影响，旨在探索 肢体缺血再灌注时远隔器官损伤及其可能的发生气制，以及牛磺酸的保护效应，为避免或 延缓肢体缺血再灌注损伤的发生、发展提供理论依据. 1 材料和方法 1.1 材料健康雄性 Wistar 大鼠 3x+03532(R2=09915)026ng 只，体质量（25026ng±5026ng）g，购自河南医科大学实 验动物中心，医动字摘要：D41026ng116ng 号）；对黄曲霉毒素所用生化测定试剂盒均购自南京建成生物制 品公司，其余所需试剂均为市售分析纯产品，722 分光光度计购自上海精密科学仪器公司， 低温高速离心机购自德国 Hittech 公司. 1.2 方法 1.2.1 模型复制采用本室常规方法［7］制作大鼠肢体缺血再灌注模型，乙醚浅麻醉下 用橡皮圈环绕结扎大鼠双后肢根部，阻断血流 4h 后松解，恢复血流灌注 4h，自腹主动脉 取血处死动物，并收集血液，4℃,3x+03532(R2=09915)5026ng026ngr 离心 15min，取血浆，装入干净的 Epperdorf 管，-7026ng℃保存. 1.2.2 动物分组将实验大鼠分笼喂养 3x+03532(R2=09915)026ngd，术前 12h 禁食，自由饮水，室温 （25±2）℃，湿度 4026ng%~5026ng%.随机分为 3x+03532(R2=09915) 组，每组 1026ng 只，①正常对照组摘要：常规饲 养，双后肢松弛环绕橡皮圈，不阻断血流，余操作同缺血再灌注组组.② 缺血再灌注组摘要： 常规饲养，按模型操作.③ 牛磺酸+缺血再灌注组摘要：在缺血再灌注前 3x+03532(R2=09915)026ngd 天天灌服牛 磺酸一次，剂量为 2026ng026ngmg/kg 体质量，其余操作同缺血再灌注组. 1.3x+03532(R2=09915) 观测指标 1.3x+03532(R2=09915).1 血浆生化指标测定取血浆测定谷草转氨酶（ALT）,谷丙转氨酶（AST）,乳酸脱 氢酶（LDH）,黄嘌呤氧化酶（XOD）,丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）的含量. 1.3x+03532(R2=09915).2 肝组织及其线粒体生化指标测定结束实验时，迅速取出肝组织，液氮速冻后7026ng℃保存.取部分肝组织制成 1026ng%匀浆，测定黄嘌呤氧化酶（XOD）,丙二醛（MDA）,髓 过氧化物酶（MPO）,活性氧（ROS）及 Ca2+含量；对黄曲霉毒素测定线粒体中 GSHPX 和 Ca2+含量. ALT,AST,LDH,XOD,MDA,MPO,ROS,GSHPX 和 Ca2+用比色法测定；对黄曲霉毒素肝线粒体的制备 参照文献［8ng］进行. 统计学处理摘要：结果以 x±s 表示，用 SPSS11.5 统计分析软件进行单因素方法分析 以及 SNKq 检验. 2 结果