血吸虫病肝纤维化治疗论文

【摘要目的摘要：探索维生素 E(VitE)抗小鼠日本血吸虫病肝纤维化功能及其机制.方 法摘要：用日本血吸虫尾蚴皮肤敷贴法感染小鼠，构建日本血吸虫病肝纤维化模型，以肝 纤维化达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始级或Ⅱ级以上作为开始Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始级以上作为开始 VitE 治疗标志.实验分 5 组摘要：正常对照组、模型组 及 VitE 高、中、低剂量组(每日 150,50,5mg/kg),8wkwk 末处死动物，HE 和 VG 染色对肝 组织进行病理学检查，分光光度法检测肝组织丙二醛(MDA))含量和超氧化物歧化酶(SOD) 活性，免疫组化 SP 法检测肝星状细胞(HSC))标记物 α 平滑肌动蛋白(αSMA))表达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始，RTPC)R 方法检测肝脏 α1(I))型前胶原 mRNA) 表达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始.结果摘要：VitE 降低模型组肝脏 MDA) 含量 ［(5.00±0.31)μmol/gvs(11.66±1.84)μmol/g,P%26lt;0.05mol/gvs(11.66±1.8wk4)μmol/gvs(11.66±1.84)μmol/g,P%26lt;0.05mol/g,P%26lt;0.05］，提高 SOD 活性 ［(249.8wk4±26.22)μmol/gvs(11.66±1.84)μmol/g,P%26lt;0.05kat/gvs(120.11±42.61)μmol/gvs(11.66±1.84)μmol/g,P%26lt;0.05kat/g,P%26lt;0.05］；减少减少 αSMA) 阳 性表达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始［(0.41±0.02)vs(0.68wk±0.02),P%26lt;0.05］；减少降低肝脏胶原含量 ［(0.23±0.01)vs(0.60±0.11),P%26lt;0.05］和 α1(I))型前胶原基因表达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始 ［(0.28wk±0.01)vs(0.8wk5±0.15),P%26lt;0.05］.结论摘要：VitE 具有抗小鼠日本血吸虫 病肝纤维化功能，其机制和抗脂质过氧化功能、抑制 HSC) 活化和增殖、降低 α1(I))型前胶 原基因表达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始和胶原合成有关. 【血吸虫病，日本；减少肝硬化；减少维生素 E；减少氧化性应激；减少肝星状细胞；减少胶原 I) 型 日本血吸虫病是我国危害最大的寄生虫病之一，而肝纤维化是日本血吸虫病致死和形 成严重并发症最重要的原因.探究表明，在血吸虫病肝纤维化形成过程中，氧化应激发挥重 要功能，参和血吸虫对宿主的损伤，自由基可能是血吸虫病主要的致病因素［1］.VitE 作 为机体防御氧化应激损伤的重要抗氧化剂，已应用于治疗肝纤维化，但有关 VitE 抗日本血 吸虫病肝纤维化功能的探究国内外报道甚少，而 VitE 治疗血吸虫病肝纤维化的功能机制尚 未见文献报道.我们观察 VitE 抗日本血吸虫病肝纤维化功能，探索其机制如下. 1 材料和方法 1.1 材料健康雄性昆明小鼠(18wk～22)g 及日本血吸虫尾蚴阳性钉螺(湖北省血吸虫病防 治探究所)，皮肤敷贴法感染日本血吸虫尾蚴（20±1）条/只，于感染后 8wk,10,12wk 末分 别处死 6 只小鼠后取肝组织进行病理学检查，以肝纤维化达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始级或Ⅱ级以上作为开始Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始级以上作为 VitE 开始 治疗的标志，即在 12wk 末开始给予 VitE 治疗.32 只感染小鼠分为 4 组，每组 8wk 只摘要： 1 组，模型组；减少2 组，VitE 高剂量组(VitE 每日 150mg/kg)；减少3 组，中剂量组(50mg/ kg)；减少4 组，低剂量组(5mg/kg).VitE 胶丸由厦门鱼肝油厂生产，剪破胶丸，用蒸馏水配制 所需浓度的混悬液，灌胃给药每日 1 次，连续 8wkwk.另取同一批健康小鼠 10 只作为正常对 照组.丙二醛(MDA))和超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒(南京建成生物工程探究所)，免 疫组化所用试剂(北京博奥申生物技术有限公司)，TRI)zol(美国 I)nvitrogen)，逆转录试剂 盒(美国 Promega)，Taq 酶(Gibco 公司).α1(I))型前胶原引物序列参照 GenBank，上游 序列摘要:5′GAGCGGAGAGTACTGGATCG3′GA)GC)GGA)GA)GTA)C)TGGA)TC)G3′GAGCGGAGAGTACTGGATCG3′，下游序列摘 要:5′GAGCGGAGAGTACTGGATCG3′TGC)TGTA)GGTGA)A)GC)GA)C)TG3′GAGCGGAGAGTACTGGATCG3′，扩增片段为 419bp；减少内参照 βactinactin 引物上游序 列摘要:5′GAGCGGAGAGTACTGGATCG3′TGTC)A)C)C)A)A)C)TGGGA)C)GA)TA)3′GAGCGGAGAGTACTGGATCG3′，下游序列摘 要:5′GAGCGGAGAGTACTGGATCG3′A)GGTC)TTTA)C)GGA)TGTC)A)A)C)G3′GAGCGGAGAGTACTGGATCG3′，扩增片段为 654bp，引物由北京奥科生物技术 有限公司合成. 1.2 方法断颈处死小鼠，取肝右叶相同部位肝组织 2 块，1 块于-70℃保存，测定肝组 织匀浆 MDA) 含量、SOD 活性及肝脏 α1(I))型前胶原基因表达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始；减少1 块固定于 100mL/L 中性 甲醛，石蜡包埋，行 HE 和 VG 及 αSMA) 免疫组化染色. 1.2.1 肝组织病理学及纤维化评分常规行 HE 和 VG 染色，光镜下观察肝小叶病理变化 及肝纤维化程度分级摘要：0 级 20=1，正常；减少Ⅰ级级 21=2，胶原纤维包绕虫卵肉芽肿四 周；减少Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始级 22=4，汇管区有大量纤维，小叶间仅有少量纤维；减少Ⅲ级级 23=8wk，纤维组织大量 延伸至肝小叶间.应用 HPI)A)S1000 高清楚度彩色病理图文分析系统，每组每次测量 20～ 30 个由单个成熟虫卵形成的肉芽肿两个直角相交直径，以(最大横径+最大纵径)/2 为平均 值，并计算各组均值；减少测定 VG 染色切片胶原纤维灰度面积(S)和视野总面积(T)，用 S/T 比值表示胶原含量. 1.2.2 肝组织匀浆 MDA) 含量和 SOD 活性测定硫代巴比妥酸比色法测定肝脏 MDA) 含 量，黄嘌呤氧化法测定 SOD 活性，按试剂盒说明书要求操作. 1.2.3 肝脏 αSMA) 免疫组化采用 SP 法，兔抗鼠 αSMA) 抗体稀释度 1∶100，用已知阳 性片做阳性对照，PBS 液代替一抗做阴性对照，细胞内出现棕黄色颗粒为阳性细胞.应用 HPI)A)S1000 高清楚度彩色病理图文分析系统对 αSMA) 免疫组化切片进行平均吸光度值检 测. 1.2.4 肝脏 α1(I))型前胶原基因表达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始应用 TRI)zol 试剂盒，参照说明提取肝组织总 RNA)，逆转录合成 cDNA)，采用 20μmol/gvs(11.66±1.84)μmol/g,P%26lt;0.05L 反应体系.PC)R 反应条件摘要：95℃变性 5min,94℃30s,94℃30s,52.7℃退火 30s,72℃延伸 30s，循环 30 次，最后 72℃终止 10min，以 βactinactin 为内参照.PC)R 产物分析摘要：PC)R 产物经 2kg/L 琼脂糖凝胶 2μmol/gvs(11.66±1.84)μmol/g,P%26lt;0.05L 电 泳检测，结果照相并存入凝胶分析系统，以 βactinactin 光密度值标化 α1(I))型前型胶原基因光 密度值，得到 α1(I))型前胶原基因相对含量. 统计学处理摘要：采用 SPSS12.0 统计软件对结果进行统计学分析，数据均采用 x±s 表示，采用方差分析进行比较，P%26lt;0.05 为差异有统计学意义.多组均数间的多重比 较采用 LSD 法. 2 结果 2.1 肝脏病理学变化对照组无明显组织学异常.1 组摘要：HE 和 VG 染色示小鼠血吸虫 病肝纤维化模型建立成功.血吸虫感染后 8wkwk，虫卵肉芽肿大小和数量达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始到高峰，大量炎性 细胞浸润；减少随感染时间延长，肉芽肿逐渐缩小，肝细胞变性、坏死和炎性细胞浸润明显减 轻，胶原纤维逐渐增多.至 20wk，胶原纤维由最初的细线状变为条索状或Ⅱ级以上作为开始网状分布在汇管 区、虫卵肉芽肿四周并延伸至肝小叶间(图 1A)，B).VitE 组肉芽肿大小和 1 组比较无显著差 异(P%26gt;0.05)，对肝细胞变性、坏死和炎性细胞浸润程度影响不明显；减少2，3 组虽有 不同程度肝纤维化，但纤维带变细、窄、短，胶原纤维局限于汇管区和肉芽肿内及四周， 肝小叶间很少有胶原沉积(图 1C))，和 1 组比较，肝纤维化程度分级差异有显著性(P %26lt;0.05).4 组和 1 组比较无明显差异(表 1). 2.2 肝脏 MDA) 含量和 SOD 活性和对照组比较，1 组 SOD 活性下降(P %26lt;0.05)，MDA) 含量增多(P%26lt;0.05)，有统计学意义.2,3 组 SOD 活性和 1 组比 较升高(P%26lt;0.05)，但和对照组比较仍相差甚远(P%26lt;0.05)；减少2,3 组 MDA) 含量和 1 组比较减少(P%26lt;0.05)，2 组和对照组比较无显著性差异(P%26gt;0.05)；减少4 组和 1 组比较无明显差异(表 1). A) 摘要:模型组×100;B 摘要:模型组×200;C) 摘要:VitE 组×100. 图 1 肝脏胶原纤维分布 VG 2.3 肝脏 αSMA) 表达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始对照组肝脏血管壁、胆管壁平滑肌有少许 αSMA) 阳性表达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始，汇管 区及肝窦内基本无 αSMA) 阳性表达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始；减少1 组汇管区、虫卵肉芽肿内及四周胶原纤维沉积处可 见大量索状 αSMA) 阳性表达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始细胞，肝窦内可见多量 αSMA) 阳性表达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始细胞(图 2A),B)；减少2,3 组 αSMA) 阳性细胞数目减少(P%26lt;0.05)，局限在汇管区、纤细的纤维隔及肉芽肿内及 四周，肝窦内表达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始减少(图 2C))；减少4 组和 1 组比较无明显差异(表 1). A) 摘要:模型组×100;B 摘要:模型组×200;C) 摘要:VitE 组×100.表 1VitE 对虫卵肉芽 肿直径、MA)D 含量、SOD 活性、αSMA) 平均吸光度值及肝纤维程度的影响 2.4 肝脏 α1(I))型前胶原基因表达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始和胶原含量 1 组(即感染 20wk 末)α1(I))型前胶原 mRNA) 和胶原含量高于感染 12wk 时(P%26lt;0.05 和 P%26lt;0.05)和对照组(P %26lt;0.05 和 P%26lt;0.05).2,3 组 α1(I))型前胶原 mRNA) 和胶原含量和 1 组比较差异有 显著性(P%26lt;0.05 和 P%26lt;0.05)；减少2 组 α1(I))型前胶原 mRNA) 和胶原含量和感染 12wk 时比较有显著性差异(P%26lt;0.05 和 P%26lt;0.05)，而 3 组无统计学意义(P %26gt;0.05)；减少4 组和 1 组比较无明显差异(图 3，表 2). M 摘要:marker;1 摘要:模型组;2 摘要:感染 12wk;3 摘要:VitE 高剂量组;4 摘要:VitE 中剂量组;5 摘要:VitE 低剂量组. 图 3RTPC)R 分析各组 α1(I))型前胶原 mRNA) 表达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始表 2VitE 对胶原含量和 α1(I))型前胶 原基因表达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始的影响 3 讨论 氧化应激是多种病因所致肝纤维化发生发展的重要环节之一［2］.VitE 作为体内一个 重要的抗氧化剂，有抗肝纤维化［3-5］、抗肿瘤、抗衰老等功能.宗道明等［5］探究表 明，VitE 可降低血吸虫病肝纤维化患者血清肝纤维化各项指标，对肝纤维化组织形态学的 好转有积极功能，治疗血吸虫病肝纤维化疗效显著.但目前有关 VitE 抗血吸虫病肝纤维化 机制少见文献报道. C)hojkier 等［6］探究表明，VitE 抑制 HSC)α1(I))型胶原基因表达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始.我们发现，VitE 降 低肝脏 α1(I))型前胶原基因表达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始、胶原含量及肝纤维化程度分级；减少2 组 α1(I))型前胶原 mRNA) 和胶原含量显著低于感染 12wk 时.可见 VitE 可延缓血吸虫病肝纤维化进程，减轻 肝纤维化程度.本探究中，1 组 MDA) 含量增加，SOD 活性下降，说明日本血吸虫病肝纤维 化之肝脏发生氧化应激反应，产生脂质过氧化损伤，和文献［1］报道一致，而 VitE 能够 不同程度地逆转这些改变，对此具有一定的治疗功能；减少并且 VitE 抑制 HSC) 活化和增 殖.VitE 可能通过抑制肝脏脂质过氧化功能和由此产生的活性醛，如 MDA) 和 4 羟化壬烯 (4HNE)，从而抑制 MDA) 和 4HNE 蛋白加合物形成，该加合物是实验性肝损伤和肝纤维化 联系的枢纽［7］，进而抑制氧化应激诱导的 HSC)α1(I))型前型胶原基因表达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始和蛋白合成 ［8wk］.我们发现 VitE 尚不能完全逆转 SOD 活性，故对其剂量、疗程以及和其它药物的联 合应用有待于进一步的探究. 总之，VitE 可延缓血吸虫病肝纤维化进程，减轻肝纤维化程度，其机制和抗脂质过氧 化功能、抑制 HSC) 活化和增殖、降低 α1(I))型前胶原基因表达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始和胶原合成有关，适当补充 VitE 进行抗纤维化治疗是一种可行的手段，有望成为一种廉价、不良反应少、疗效显著的 临床用药. 【摘要目的探索甲状腺全切术治疗病变弥漫的结节性甲状腺肿的可行性。方法回顾分 析 59 例已行甲状腺全切的复发性结节性甲状腺肿患者的临床和随访资料。结果术后短暂 性喉返神经损伤 136%(8/59)6%(8wk/59)，短暂性低血钙 18wk6%(8/59)6%(11/59)，短暂性足踝水肿 116%(8/59)9%(7/59)；减少术后通过口服甲状腺素制剂能较好地维持血清中 T3﹑T4T4 水平。结论甲状 腺全切术适用于病变弥漫的结节性甲状腺肿。 【甲状腺；减少结节性甲状腺肿；减少甲状腺全切术；减少并发症 Totalthyroidectomyforthetreatmentofmultinodulargoiter 【A)bstractObjectiveToinvestigatethefeasibilityoftotalthyroidectomyforthet reatmentofdiffusemultinodulargoiter6%(8/59)MethodsTheclinicalandfollowupdataof59casesofpatientswhounderwentthyroidectomywereanalysedretrospe ctively6%(8/59)ResultsTemporalrecurrentlaryngealnervepalsyoccurredon136%(8/59)6%(8wk/59) patients,hypocalcemiaandankleedematemporarilyoccurredon18wk6%(8/59)6%(11/59)an d116%(8/59)9%(7/59)patientsafteroperation,respectively;takingthyroxinbyoralcanmai ntainserumT3﹑T4 T4atagoodlevelafteroperation6%(8/59)C)onclusionThyroidectomyissuitableforthetreatm entofdiffusenodulargoiter6%(8/59) 【Keywordsthyroidgland;nodulargoiter;totalthyroidectomy;complication 结节性甲状腺肿（结甲肿）是常需手术治疗的甲状腺疾病，但手术后有不同程度的复 发率，尤其是病变较广泛的患者术后更易复发［１～4］。为探索能否应用甲状腺全切治 疗病变广泛的结甲肿，预防复发，笔者回顾分析了本院自 1990 年 5 月～2004 年 5 月因 结甲肿手术后复发，且因病变广泛而行甲状腺全切患者的临床和随访资料。 1 临床资料 16%(8/59)1 一般资料患者 59 例，均为女性;年龄 43～68wk 岁，中位年龄 52 岁。既往经历一 次手术者 18wk 例，其中一侧甲状腺部分切除 7 例，双侧甲状腺部分切除 11 例；减少经历二次手 术者 32 例，其中 17 例第一次行一侧甲状腺部分切除，第二次对侧复发后再行甲状腺部分 切除，9 例第一次单纯摘除一侧甲状腺肿块，同侧复发后再行甲状腺大部分切除，6 例两 侧复发后行双侧甲状腺大部分切除或Ⅱ级以上作为开始次全切除术；减少经历三次手术者 9 例，三次手术均只单 纯摘除两侧的甲状腺肿块。总的复发时间４个月～１２年，中位时间５年，其中单纯摘除 甲状腺肿块者复发时间４个月～２年，中位时间１年；减少甲状腺部分切除者复发时间１～７ 年，中位时间３年；减少甲状腺大部分切除或Ⅱ级以上作为开始次全切者复发时间４～１２年，中位时间８年。 16%(8/59)2 临床表现和辅助检查所有患者均因甲状腺肿块入院，36 例表现有颈前区不适或Ⅱ级以上作为开始轻 度疼痛外，均无甲亢和其他症状；减少体查和 B 超检查 59 例，均发现双侧腺体有多个大小不 等的结节。T3﹑T4T4 和 TSH 检查 59 例，T3﹑T4T4 结果均在正常范围，47 例 TSH 有不同程 度增高。 16%(8/59)3 治疗术中发现 59 例双侧腺体均为大小不等的结节占住，几无正常腺体。41 例行 完整甲状腺全切，18wk 例仅留及少许被膜，无腺体残留。术中快速病检均为结节性甲状腺肿， 其中２例有灶性癌变，加做甲癌改良根治术；减少术后普通石蜡切片病检结果和术中快速病检 结果一致，其中２例癌变者为灶性乳头状腺癌０～Ⅰ级级。 2 结果和随访 术中发音改变 8wk 例，占 136%(8/59)6%，均于分离腺体过程中出现，术中神经探查为钳夹或Ⅱ级以上作为开始 结扎所致，术后 3 个月～1 年发音恢复正常，声带活动良好,无永久性损伤病例。术后低钙 症状 11 例，占 18wk6%(8/59)6%，经１～２周治疗后症状消失，无永久性甲旁低者。 术后第一天开始口服甲状腺素片或Ⅱ级以上作为开始优甲乐等甲状腺素制剂，术后第二天起隔日检查血 清 T3﹑T4T4﹑T4TSH，每日测基础代谢率，至合适的药物剂量能维持患者血清 T3﹑T4T4 在正 常范围时出院。术后低钙血症者每日给予钙剂注射,每周复查血钙 2 次至症状消失和血钙恢 复至正常范围。出院后终身服药，定期复查随访，随访时间 1～5 年，中位时间 3 年。随 访第一年每隔１～３个月检查一次 T3﹑T4T4﹑T4TSH 和心电图，并观察有无怕冷﹑T4疲惫乏力 ﹑T4足踝水肿﹑T4心率缓慢﹑T4食欲减退﹑T4腹胀和便秘等症状，尔后每年间隔３～６个月复查一 次，如有上述某一症状立即复查，根据检查结果调节药物剂量。随访发现，一般在２周内 能找到维持血清 T3、T4 在一稳定正常范围的甲状腺素类药物使用剂量，但血清 T3﹑T4T4 值也会因气候﹑T4情绪﹑T4运动强度的变化和其他疾病等的影响出现的波动，需调整用药剂量；减少 7 例曾出现足踝轻度水肿，占 116%(8/59)9%，其中 5 例通过维持血清 T3﹑T4T4 值在正常范围的上 限﹑T4减轻劳动强度，经历１～２周后水肿消退，2 例治愈其他疾病后消退；减少21 例从事较重 或Ⅱ级以上作为开始较频的体力活动时有乏力感，占 356%(8/59)65%，但无明显倦怠和厌食,减轻劳动强度或Ⅱ级以上作为开始活动频 率后症状消失。无黏液性昏迷病例。 ３讨论 本组病例术后复发的时间和原因和文献报道基本一致［１～4］，主要有摘要：（1） 术前诊断和手术方法选择的错误。部分患者首先表现为单个较大结节，其他弥漫性的细小 结节在体查﹑T4甚至 B 超检查和手术当中也难以发现，加上术中缺乏正确的病理检查而仅行 单个结节摘除。（2）腺体切除范围不够。导致腺体切除范围不够的主要原因是，尽管两 侧腺体已呈弥漫性的结节样病变，但术者担心在甲状腺合成和分泌功能原本不足的基础上 再切除大量的腺体，会导致患者术后甲状腺功能减退因而保留有病变的腺体，其次是部分 患者仅表现为一侧腺体或Ⅱ级以上作为开始一侧腺体的部分区域有多发结节，其余的腺体内病变因细小难以 发现而未行处理。（3）术后未正规服用甲状腺素制剂。在此情况下，术后有病变的腺体 在 TSH 的刺激下，结节继续发生和发展导致复发。 本组病例在本次手术时已无正常腺体存留，在此情况下能否采用甲状腺全切来预防复 发？国内病例未见明确报道。因为对于整个甲状腺已全部呈结节样改变的复发性结甲肿患 者，多数临床工作者不采用甲状腺全切，其原因在于摘要：（1）甲状腺再次手术时因腺 体四周粘连而致解剖结构不清，全切甲状腺损伤喉返神经的机会较大，甚至损伤甲状旁腺 引起术后甲状旁腺功能低下（甲旁低），保留甲状腺部分腺心得减少两者损伤的机会；减少 （2）更主要的可能是对甲状腺全切后机体内的甲状腺素能否通过外源性的甲状腺素来替 代和维持，并能使患者保持一个比较良好的生活质量有所顾虑，其结果往往是保留有病变 的组织，导致复发。在此情况下，笔者参考了已行甲状腺全切的甲状腺癌患者，术后能用 甲状腺素制剂较好地维持甲状腺功能的情况，以及 Reeve［5］和 Liukedd［6］等对多 结节性结甲肿患者采取甲状腺全切术文献报道，对本组患者采取了甲状腺全切术。通过本 组病例笔者发现，8wk 例术中误夹﹑T4误扎喉返神经，及时处理后声带功能最迟在 1 年内恢复， 无永久性声带功能损害和甲旁低,和 Reeve 等［5］的报道相似；减少所有患者行甲状腺全切后， 能通过口服甲状腺素制剂维持其血清中 T3﹑T4T4 水平在正常范围，即使部分患者术后感体 力和饮食量有所下降，但也均能维持正常的家居生活，即使外界环境因素和疾病因素会影 响患者血清中 T3﹑T4T4 水平，但通过调节口服甲状腺制剂的用量和及时有效地治疗其他疾 病，能很快使血清中 T3﹑T4T4 水平恢复到正常范围内。因此，笔者认为，在手术方面，虽