胃癌癌前期病变研究管理论文

【摘要】目的观察中药消滞胃宁对大鼠慢性萎缩性胃炎（CAG）及胃癌前期病变及胃癌前期病变 （PLGC）及胃癌前期病变动物模型胃黏膜血流量（GMBF）及胃癌前期病变及其病变逆转治疗作用。观察消滞胃宁的镇痛、 抗炎作用和对免疫功能的影响。方法在大鼠 CAG 及 PLGC 动物模型中，用激光多普勒血 流计测定大鼠 CAG 和 PLGC 的 GMBF，同时对各组 CAG 和 PLGC 的进行了病理组织学检 查；镇痛实验采用小鼠冰醋酸扭体法、热板法、恒温水浴甩尾法；抗炎实验使用二甲苯所 致小鼠耳肿胀、小鼠毛细血管渗透性实验；免疫实验采用小白鼠碳粒廓清实验和小鼠血清 溶血素实验。结果大鼠慢性萎缩性胃炎及胃癌前期病变动物模型实验中，经消滞胃宁 50 天的治疗，高剂量组大鼠便溏消失，动物体重较模型对照组增加明显，模型组较正常组 GMBF 明显减少，各治疗组均可降低 GMBF，消滞胃宁高、中、低剂量组大鼠的胃组织病 变得到了明显改善。镇痛实验表明：消滞胃宁能减少小鼠冰醋酸扭体次数；提高小鼠热板 痛阈值；能延长小鼠恒温水浴甩尾时间。抗炎实验表明：消滞胃宁减轻二甲苯所致小鼠耳 肿胀度；抑制小鼠毛细血管渗透性的增加。免疫实验表明：消滞胃宁能明显提高单核细胞 的吞噬功能；增加小鼠血清溶血素含量。结论消滞胃宁能提高 GAC 和 PLGC 胃黏膜血流 量，改善组织病理；消滞胃宁具有明显的镇痛、抗炎作用，并能提高机体免疫力。 【关键词】消滞胃宁；慢性萎缩性胃炎；胃癌前期病变；胃黏膜血流量；镇痛；抗炎； 免疫 ExperimentalresearchofeffectofXiaozhiweiningonchronicatrophicgastritisa ndprecancerouslesionsofgastriccancer 【Abstract】ObjectiveToexploretheeffectofXiaozhiweiningonGMBFinratswit hatrophicgastritisandprecancerouslesionsofgastriccancerandtostudyitstherape uticeffects，toexploreXiaozhiweiningonpharmacodynamicactionofantiinflammationandalleviatingpain，andimpactonimmunefunction.MethodsAcom plexmethodwasusedtoestablishthemodelthatwasstimulatingthevariousfactorst ocauseflowmeter.Thedateofdifferentgroupswereanalyzedandcompared.Themi xture’spharmacodynamicactionwasmeasuredbyobservingitseffectontorsiversio nmalpositionmicewithpaininducedbyiceacetic.Onthosewithpaininducedbyhotb oard，thermostaticalwaterbathtogetridofthetaillawexperimentally； Resistinflammationexperimentuseratsearswelling，ratscapillarypermeabilityex perimentinducedbyinjectingiceaceticintomiceabdominal； Theimmuneexperimentusesratsclearexperimentofcarbon.ResultsTheexperimentalPLGChavelower，Xiaozhiweiningincr easedtheGMBF.Xiaozhiweiningcanmodulatethisstateandimprovethevariouspat hologicalmanifestationsofCAGandPLGC.ConclusionXiaozhiweininghadeffectofa ntiinflammationandalleviatingpain，andcanimprovetheorganism’simmunefunctio n. 【Keywords】Xiaozhiweining；chronicatrophicgastritis； precancerouslesionsofgastriccancer；gastricmucosiabloodflows； alleviatingpain；anti-inflammation；immune 应用中医药防治慢性萎缩性胃炎（chronicatrophicgastritis，CAG）及胃癌前期病变是我国医药的 优势所在［1］。消滞胃宁是在临床应用几十年后总结出的的临床验方，由黄芪、丹参、 枳壳、石菖蒲等多味中药组成的纯中药制剂，具有健脾益气，理气合胃，化瘀解毒之功效。 主治脾虚气滞型慢性萎缩性胃炎及伴发胃癌癌前期病变。为进一步研究该方的疗效及机制， 本文重点观察消滞胃宁对大鼠慢性萎缩性胃炎及胃癌前期病变动物模型的影响，同时对其 镇痛、抗炎、免疫作用进行探讨。 1 实验材料 1.1 实验动物 Wistar 大鼠，雄性，体重（220±20）及胃癌前期病变g，由兰州医学院实验动物中心 提供，均在我所动物实验室作 2 天适应性饲养后进入本研究；健康昆明种、BALB/c 小鼠 由兰州大学动物中心提供，动物合格证号为：甘肃省动物管委会 14-002(普)。动物实验合 格证：甘肃省医学动物管委会（普）及胃癌前期病变-005。 1.2 受试物消滞胃宁浸膏粉，由甘肃省药品检验所药理室提供，临用前根据需要配制 成不同浓度的混悬液；阳性对照药温胃舒颗粒，合肥神鹿双鹤药业生产，批号 0404005。 1.3 实验仪器 GJ-8402 型热板仪；751-GW 分光光度计，惠普上海分析仪器有限公司 生产；METTLERAE240 电子天平；激光多普勒血流计由南开大学电子仪器厂生产。 1.4 统计学方法各组数据以 x±s 表示，组间进行 t 检验，P<0.05 为差异有显著性， P<0.01 为差异有非常显著性。 2 实验方法与结果 2.1 对大鼠慢性萎缩性胃炎及胃癌前期病变动物模型的影响［2］Wistar 大鼠 60 只， 全部雄性，体重（220±20）及胃癌前期病变g，每只大鼠足底注射佐剂抗原（同种大鼠胃黏膜浆与 Freund 佐剂以 1：1 配成乳剂）及胃癌前期病变0.3ml/次，1 次/4w，共 2 次，去氧胆酸自由饮水，浓度 为 20mmol/L。猪胆汁离心后置-20℃冰箱备用，使用前溶解至冰水混合物，抽取液体部 分，按 12.5ml/kg 给大鼠皮下注射，1 次/d，共 90 天。饥饱失常：2 天喂食，1 天停食， 保证足量，自由饮水。60 只大鼠随机分为 6 组，每组 10 只，以下 4 组在造模 90 天均连 续用消滞胃宁和阳性对照药温胃舒颗粒灌胃 50 天，其剂量分别为：消滞胃宁低剂量 5.13g/kg；消滞胃宁中剂量 10.25g/kg；消滞胃宁高剂量组 20.50g/kg；阳性药对照组 5.16g/kg，各组在给药期间记录动物一般情况和质量变化。给药结束后，各组大鼠禁食 24h，自由饮水，用 10g/L 戊巴比妥钠（40mg/kg）及胃癌前期病变麻醉后，打开腹腔，沿胃大弯侧作一 0.8～15cm 切口，将胃内容物冲洗干净，将多普勒血流计光纤探头轻放于胃小弯黏膜上， 保持中等压力而没有距离，多普勒血流计频移范围为 5～7kHz，时间常数选 1s，量程选 X1，用特制的外径 2.8mm，长 2m 的光纤探头，输出功率＞1mW，测定范围为半径 1.5mm 半球形体微区；血流量单位用多普勒信号的电压值“u”表示，试验开机预热 30min，并调零后进行测定。测定后杀检各组大鼠，摘除大鼠胃，沿胃大弯剪开，生理盐 水中洗净胃黏膜，肉眼观察胃黏膜大体情况后固定于 10％甲醛液中，供病理组织镜检。 2.2 结果 2.2.1 大鼠体质量的变化正常组在整个试验过程中，未出现便溏，模型组均出现便溏， 各治疗组便溏有不同程度转好，其中高剂量组大鼠便溏消失，阳性对照组大鼠的便溏也有 一定的改善。模型组质量增长逐渐减慢，在给药后 25 天及给药 50 天明显低于正常对照组 及治疗组（P＜0.05～0.01）及胃癌前期病变，给药 50 天后消滞胃宁治疗组体质量较阳性对照组明显重， 结果见表 1。 注：与模型对照组比较，*PP＜0.05，*P*PP＜0.01；与正常对照组比较，☆☆P＜0.01 2.2.2 胃黏膜组织病理观察正常组：上皮细胞及腺体排列整齐，大小形状一致，细胞 呈单层柱状，胞质透明或空泡状，腺上皮与腺管分界清楚，固有腺及黏膜无扩张淤血，黏 膜肌层无增生。模型组：胃黏膜层变薄，固有腺体数量减少；个别腺体上皮细胞增生，可 见肠上皮化生，细胞体积较大、核大、深染，有大而红染的核仁，病理性核分离像可见。 间质有少量淋巴细胞、嗜酸性粒细胞浸润，于黏膜上皮表面可见多量幽门螺杆菌。治疗组： 消滞胃宁高、中、低组：胃黏膜层变薄，固有腺体数量减少，间质有少量淋巴、嗜酸性粒 细胞浸润，无明显坏死、表现为浅表性胃炎或接近正常组织，黏膜上皮表面有极少量幽门 螺杆菌。 2.2.3 胃黏膜血流量模型组较正常组 GMBF 明显减少，各治疗组均可高降低的 GMBF，消滞胃宁高、中、低剂量组优于阳性对照组。结果见表 2。 注：与模型对照组比较，*P*PP＜0.001，*PP＜0.01 2.3 镇痛作用［3］ 2.3.1 对小鼠冰醋酸扭体法的影响取健康昆明种小鼠 50 只，体重 18～22g，雌雄各 半，随机分为 5 组，连续灌胃 3 天，于末次给药 30min 后，每鼠腹腔注射 0.6%冰醋酸 0.2ml/只，记录注射冰醋酸 15min 内各鼠因疼痛产生扭体的次数，结果见表 3。 注：与正常对照组比较，*P*PP＜0.001，*PP＜0.01 2.3.2 对小鼠热板法痛阈值的影响取健康雌性昆明种小鼠 50 只，体重 18～22g，分 组给药剂量见表 2，连续灌胃 3 天，于末次给药 30min 后，将小鼠放于 50℃的热板仪上， 以小鼠“舔”后足作为“疼痛”的反应指标，观察记录小鼠从放置到热板上到小鼠因热痛而舔后 足之间的时间（为热板痛反应时间）及胃癌前期病变，结果见表 4。 注：与正常对照组比较，*P*PP＜0.05，*PP＜0.1 2.3.3 对小鼠甩尾次数的影响取健康昆明种小鼠 50 只，体重 18～22g，分组给药剂 量见表 3，连续灌胃 3 天，于末次给药 30min 后，将小鼠放于 41℃的恒温水浴中，以小 鼠从放入水浴至甩尾作为反应指标，观察并记录小鼠自放置到水浴中至甩尾所用的时间， 结果见表 5。 2.4 抗炎作用［4］ 2.4.1 对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响取健康雄性昆明种小鼠 50 只，体重 22～ 24g，随机分为 5 组，按表 4 所示剂量灌胃给药，每日 1 次，连续 3 次，于末次给药后立 即将小鼠右耳涂二甲苯 30μll 致炎，于致炎后 1.5h 将小鼠处死，沿耳根剪下双耳，用 7mm 的打孔器打孔，将耳片在万分之一的天平上称重，用两耳片的差值表示肿胀度，结 果见表 6。 注：与正常对照组比较，*P*PP＜0.001，*PP＜0.01 2.4.2 对小鼠毛细血管渗透性的影响上述各组小鼠给药 30min 后，每鼠立即尾静脉注 入 1%伊文思兰溶液 0.1ml/10g，立即腹腔注入 0.6%的冰醋酸溶液 0.15ml/ 10g，30min 后处死，将各鼠腹腔上皮打开，向腹腔注入 7ml0.9%的氯化钠溶液，充分 在腹腔内混匀，用注射器将注入的腹腔溶液吸出，过滤，放入试管中，用 751-GW 分光光 度计于 590nm 处测光密值，结果见表 7。 注：与正常对照组比较，*P*PP＜0.001，*PP＜0.01 2.5 免疫作用［5］ 2.5.1 对小鼠网状内皮系统吞噬功能的影响取健康昆明种小鼠 50 只，体重 18～ 22g，随机分为 5 组，按表 8 所示剂量灌胃给药，每日 1 次，连续 4 次。给药结束后尾静 脉注射印度墨汁 0.1ml/10g，注射后分 2min、12min 用微量移液器分别经眼后静脉丛取 血 20μll，溶于 0.1%的碳酸钠溶液 2ml 中，摇匀，751-GW 分光光度计中于 600nm 下 比色，测定光密度。计算廓清指数 K，根据各组 K 值，进行组间 t 检验，结果见表 8。 注：与正常对照组比较，*P*PP＜0.001，*PP＜0.01 2.5.2 对小鼠血清溶血素的影响取健康 HIC 小鼠 50 只，雌雄各半随机分为 5 组，即： 生理盐水对照组、阳性药贞芪扶正冲剂对照组、消滞胃宁高、中、低剂量组。每组 10 只。 各组小鼠连续给药 7 天，于给药第 2 天腹腔注射 5％羊红细胞 0.2m/只。末次给药后 0min，眼眶后静脉取血，离心取血清，以生理盐水将血清稀释 100 倍。取稀释血清 1ml 与 5%羊红细胞悬液 0.5ml、10％豚鼠补体血清 0.5ml 混合，在 37℃恒温反应 30min，0℃冰箱中终止反应，离心取上清，在 751-GW 分光光度计 540nm 处测定吸收 度 A 值。以不加血清的空白对照管上清液作对照比色。结果见表 9。 3 讨论 慢性萎缩性胃炎（简称 CAG）及胃癌前期病变是一种甚为常见的消化道胃黏膜慢性炎症及腺体萎缩的 疾病，往往并发异性增生及肠上皮化生，病期较长，反复发作，目前在临床上西医无特效 疗法。中医认为，萎缩性胃炎多属正虚和脾气阴虚，在正虚的情况下，瘀毒为患，或毒腐 成疡，或瘀结成结，或气滞湿聚痰结，最后形成恶性肿瘤。中医对癌前病变的治疗，是通 过健脾益气，养阴清热，解毒散结，活血化瘀和酸甘化阴，不仅能改善症状，而且能阻断 和逆转其癌变。因此，中医对治疗萎缩性胃炎及伴发胃癌癌前期病变的治疗具有非常乐观 的前景。 本方的立意特点，是依据我国传统医学的辨证论治与现代医学的辨病论治相结合，对 慢性萎缩性胃炎及其伴发症进行了全面的分析和认识后配伍而成的一种治疗慢性萎缩性胃 炎的中药复方制剂。本实验结果证明，大鼠 CAG 及胃癌前期病变动物模型组 GMBF 较正 常组明显减少（P＜0.01）及胃癌前期病变，经消滞胃宁治疗后，使 CAG 和 PLGC 大鼠的胃组织病变得到 了明显改善，同时胃黏膜血流量增加，说明增加胃黏膜血流量是消滞胃宁对 CAG 有效作 用环节之一；该试验还选用不同方法来证明了该方具有不同程度的镇痛和抗炎效果；并能 提高机体免疫力，这是该方剂的特点所在，是由于该方剂中黄芪、党参能提高患者的细胞 免疫能力，丹参、赤芍等活血化瘀药能改善胃黏膜微循环障碍，对萎缩腺体的恢复及炎细 胞浸润的消失起了良好作用。在此基础上，又重用了抗癌药白花蛇舌草、莪术等化瘀、散 结，这是取得疗效的重要原因。 【摘要】目的探讨外标四点法的可行性。方法 HPLC 法，色谱柱： ALLTECHC18(4.6mm×250mm，5μlm)，流动相：正丙醇-四氢呋喃-水(1：15：85)， 流速 1.0ml/min，ELSD 参数：漂移管温度 108.0℃；载气(压缩空气)流速 3.10L/min。 结果外标四点法得出回归方程，经统计学方法证明成立，且相关系数 r 显著。结论外标四 点法可以用于银杏萜类内酯的含量测定。 【关键词】银杏叶萜类内酯；含量测定；HPLC-ELSD；外标四点法 StudyonreliabilityofESMoffourpointstodeterminetheassayforGinkgoTerpen eLactones 【Abstract】ObjectiveStudyonthereliabilityofESMoffourpoints.MethodsHPL CsystemconsistingofanAlltechC18column(4.6mm×250mm，5μlm)，andthemo bilephasewasnPropylalchol，tetrahydrofuranandwater(1:15:84)atflowrateof1.0ml/ min.Thedetectortemperaturewas108.0℃andthedrygasflowratewas3.10L/ min.ResultsTheESMoffourpointshasbeenestablished.ConclusionTheESMoffourp ointscanbeusedondeterminetheassayforGinkgoTerpeneLactones. 【Keywords】ginkgoterpenelactones；assay；HPLC-ELSD； ESMoffourpoints 有关银杏叶中萜类内酯的含量测定方法的报道较多，目前银杏叶制剂的萜类内酯含量 测定方法采用的多为 HPLC 法［1～3］。我们亦采用 2005 版中国药典收录的 HPLC 法 ［4］，蒸发光散射检测器进行测定。HPLC-ELSD 使用外标两点法对数方程分别计算白果 内酯、银杏叶内酯 A、银杏叶内酯 B 和银杏叶内酯 C 的含量，四种银杏内酯的含量之和为 萜类内酯含量。我们在实际工作中使用外标两点法时，直接从数值上难以判断对照溶液的 配制是否准确，及其外标两点法对应的工作曲线(n＝2)是否可靠。因此，同时配制两份对 照溶液各自分别测定 5μll、10μll 两点，将四个浓度和相应峰面积一条标准曲线（n＝4）及胃癌前期病变， 得出回归方程及相关系数 r，通过统计学方法考察曲线和回归方程是否成立［5］。 1 仪器与试药 1.1 仪器高效液相色谱仪：SHIMADZU-10A；蒸发光散射检测器 ALLTECHELSD2000。 1.2 试药白果内酯，银杏叶内酯 B、银杏叶内酯 C 对照品购于中国药品生物制品检定 所；银杏叶内酯 A 对照品购于 SIGMA。甲醇为色谱纯；水为自制超纯水；其他试剂均为分 析纯。 2 方法与结果 2.1 色谱条件与系统适应性试验色谱柱：ALLTECHC18(4.6mm×250mm，5μlm)； 流动相：正丙醇-四氢呋喃-水(1：15：84)；流速 1.0ml/min；ELSD 参数：漂移管温度 108.0℃；载气(压缩空气)流速 3.10L/min；柱温 35℃；进样量 5、15μll。理论塔板数 按白果内酯峰计算应不低于 2500，相邻峰的分离度应＞1.5。 2.2 对照品溶液的制备分别精密称取经五氧化二磷干燥过夜的白果内酯、银杏叶内酯 A、银杏叶内酯 B 和银杏叶内酯 C 对照品适量，置同一 10ml 量瓶中加甲醇稀释至刻度， 混匀，即得。 2.2.1 对照品溶液一白果内酯 22.73mg、银杏内酯 A13.42mg、银杏内酯 B11.13mg 和银杏内酯 C9.05mg。