人源狂犬病毒建立管理论文

【摘要】目的用 ELISA 法对人源抗狂犬病毒抗体血浆进行筛查。方法采用国内几家狂 犬病毒 IgG 抗体诊断试剂盒（ELISA 法），结合小鼠中和试验测定法，对经 0、3、7、14、28 日程序免疫的供浆员之血样进行抗狂犬病毒抗体效价检测。结果与小 鼠脑内中和法比较，使用不同厂家 ELISA 试剂盒，检测结果存在一定差异，其中 C、D 厂 家试剂盒检测结果比较接近，线性关系较好（分别为：r＝0.997；r＝0.996），可以替代 小鼠脑内中和法作为采浆站血浆初筛的方法。结论经过反复筛选与比较，为大规模筛查抗 狂犬病毒特免血浆提供了技术条件。 【关键词】抗狂犬病毒抗体；狂犬病疫苗；ELISA；检测；中和试验 Establishmentofmethodtoscreeninghumananti-rabiesviruspositiveplasma 【Abstract】ObjectiveThepositivehumanplasmacontainingantibodyagainst rabiesviruswasscreenedwithELISAkit.MethodsTheIgGantibodydiagnostickits(EL ISAmethod)obtainingfromseveralmanufacturesinourcountrywereadoptedtoscr eentheantirabiesviruspositiveplasmacombiningwiththemiceneutralizationtest. Thelevelofantibodyagainstrabiesviruswasdeterminedinbloodsamplesofdonorst hatwereimmunizedwithrabiesvaccineondays0,3,7,14and28inschedule.ResultsI tshowedthattestresultsofELISAkitproducedinmanufactureCandDissimilar,theirli nearcorrelationisbetter(rc=0.997,ra=0.996respectively).ConclusionThemicene utralizationtestcanbereplacedbyELISAkitmethods. 【Keywords】antibodyagainstrabiesvirus；rabiesvaccine；ELISA； neutralizationtest；screening 狂犬病是一种严重危害人类生命的人畜共患疾病，主要通过带狂犬病毒的动物传播给 人类，发病后致死率为 100％。据卫生部 2005 年 10 月公布的数字表明，病死率仍居我 国法定传染病的第 2 位，据调查，近年来狂犬病发病呈上升趋势，目前尚无治疗狂犬病的 有效药物。虽然狂犬病抗血清对预防狂犬病起着重要作用，但其来源因系异源性蛋白而副 反应较大，使用中易发生变态反应和血清病，其发生率为 15％～45％［1］，而且对某些 疫苗的抗体反应有抑制作用［2］，使用人源狂犬病免疫球蛋白（HRIG）则克服了上述缺 点，与异源抗体相比，具有在血液中维持时间较长、保护效果好的优点，这使得 HRIG 的 需求量越来越大［3］，为此，我们于 2003 年末开始进行人源抗狂犬病抗体血浆的筛查 工作，目的是早日开发出安全有效的 HRIG 制品。但由于方法学的限制，《中华人民共和 国药典 2005 年版三部（附录ⅪⅪ J）》规定的小鼠效力中和试验（NIH）［4］方法难于做 大规模的检测。为寻找适合的方法，笔者曾建立了间接 ELISA 法测定狂犬病毒抗体的方法， 并进一步证实了该方法与小鼠中和法有良好的相关性，但现有 ELISA 法在实际应用中有灵 敏度不高、且存在漏检的问题。为解决上述问题，笔者结合小鼠中和法对国内 4 个 ELISA 厂家的狂犬病毒抗体 ELISA 诊断试剂盒进行筛选和比较，获得了较满意的结果。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 狂犬病毒抗原 狂犬病毒北京固定毒 AG 株适应地鼠肾细胞传代培养的病毒悬液经灭活初步纯化后的 疫苗原液，由兰州生物制品研究所疫苗四室提供。 1.1.2ELISA 检测试剂 ELISA 定量检测人抗狂犬病抗体诊断试剂（批号分别为： 20040703、20050301、20050302、20050801）分别由兰州生物制品研究所、宁波 天润生物药业有限公司、武汉生物制品研究所、珠海海泰生物制药有限公司提供），抗狂 犬病参考血清由中国药品生物制品检定所惠赠。 1.1.3 人用狂犬病疫苗和工作对照品 人用浓缩狂犬病疫苗（≥2.5IU/瓶），批号 20040401、20040403、20041101。 工作对照品（HRIG）批号 9008。以上制品均由兰州生物制品研究所生产。 1.1.4 实验样本 狂犬病毒抗体阳性血浆 20 份（SNT 效价≥10IU/ml），阴性血浆 100 份，均由兰州 生物制品研究所血液制剂室提供。 1.2 方法 首先对供浆者进行 0、3、7、14、28 日程序狂犬疫苗注射，于最后一针 1 个月后采 集血样，用 ELISA 试剂盒检测其相对效价，将此血样与标准品进行系列稀释，分别与狂犬 病毒悬液结合，小鼠脑内注射，在规定的时间内，观察小鼠存活和死亡情况，测定出供试 品效价，之后再用小鼠中和法试验 SNT 效价进行比较。将中和法测得 SNT 效价结果 ≥10IU/ml 的样品，再用其他三家 ELISA［4］试剂盒进行检测。最终筛选出与小鼠中和 法试验结果相接近的试剂盒作为大规模筛查狂犬病抗体阳性血浆初筛试剂盒，设计出能满 足单采浆站特异性免疫血浆筛选的需要和可靠的收浆方案。 2 结果 2.1 初免后两种检测方法的比较 按 0、3、7、14、28 日程序免疫后 1 个月采集的血样用两种方法检测的结果比较， 见表 1。表 1 初免后两种检测方法的比较（略）注：兰生所试剂（批号为 20040703） 从表 1 可以看出，小鼠中和法与 A 厂家 ELISA 试剂盒检测结果存在很大差异，从而导 致了大量的特免血浆漏检。 2.2 不同厂家 ELISA 试剂盒检测结果比较 经小鼠中和法测得 SNT 效价（≥10IU/ml）样品与其他三个生产厂家试剂盒检测结果 比较，见表 2。表 2 不同厂家 ELISA 试剂盒检测结果比较(略)注：样品 1～7 号为同一供浆 者不同次血浆样，8～9 号为同一供浆者。不同次血浆样中，小鼠中的样品作过一次。海泰 批号为 200801 从表 2 可以看出，采用 B、C、D 厂家 ELISA 试剂盒经中和法测得 SNA≥10IU/ml 的 9 份血样进行检测，结果显示，B、D 厂家 ELISA 试剂盒检测结果与中和法 SNT 值接近。 2.3 不同 ELISA 试剂盒标准曲线对比 以 9008 批 HRIG 为工作参考品，用不同 ELISA 试剂盒测得的线性关系比较，见表 3。表 3 不同 ELISA 试剂盒标准曲线对比（略）注：工作参考品为 98008HRIG 冻干品经 小鼠中和法测得效价为 60IU/ml 从表 3 可以看出，以 HRIG（批号：98008）为工作参考品的检测结果可以看出， B、DELISA 生产厂家的试剂盒线性关系较好（分别为：r＝0.997，r＝0.996），可以作 为初筛狂犬免疫血浆的首选试剂。 3 讨论 ELISA 检测方法与小鼠中和法的比较：早在 20 世纪末国内就有人［4］将 ELISA 与小 鼠中和试验进行了比较，两者已经有了很好的一致性。苏军英等［5］在 vero 细胞狂犬病 疫苗免疫人的效果观察中，用 ELISA 与 MNT、RFFIT 三种方法进行比较，也有相似的结 果［6，7］。在实验中测定的结果也证实上述两种方法具有良好的正相关性。同时通过在 ELISA 实验中同步设立了已知的 SNT 效价的阳性对照作为工作参考标准，最大限度地减少 其他因素对实验结果的影响。针对大规模人源性狂犬病毒特异性免疫血浆的采集工作的需 要，实验中根据稀释阳性对照标准的 ELISA 测定结果绘制标准曲线作为参照，建立了有效 的收浆方案［8］，从而克服了小鼠中和法诸如检测周期长、实验条件复杂、费用高、其 检测样品受到限制等不利于采浆站大规模初筛特异性免疫血浆的要求。为加快 HRIG 制品 的研制、开发提供了技术条件。 【摘要】充分认识七年制医学生的特点，通过改变教师的教学观念、调整课程的设置 内容及教学方法，七年制医学生课间实习全面贯彻以学生为主体，教师为辅导的“五 步”教学方针，即走“学生-教师-学生-教师-学生”路线。统计学分析，实验组的教学效 果比对照组具有明显的优势，为使医学生的培养从知识型向能力型转变进行了有益的 探索，取得了良好效果。 【关键词】七年制医学生；课间实习；教学方法改革 七年制医学硕士生扩大招生是近几年的事，由于这些学生具有较强的自学、交流能力、 较高的创新意识和创新精神，具备较快的接受新事物的潜力和能力。如何充分发挥他 们的特长成为摆在我们面前的新课题。我们的教学组在学生课间实习中对骨科医学教 育的观察、实习内容及教学方法进行了新的尝试，取得了良好效果。 1 充分认识七年制学生的特点 在传统的医学生课间实习过程中，教师往往只是全面系统的复习大课讲授的理论知识， 有时结合一些典型病例进行讲解，实习过程以教师为主导，学生只是被动地听讲，忽 视了调动学生的主观能动性，忽视了对医学生的独立思考和处理问题能力的培养。在 七年制学生骨科课间实习时，我们充分了解了七年制学生知识面广，接受能力强的特 点，注重学生的自己动手动脑能力培养，在短暂的课间实习时间里让其所学的理论知 识得以充分发挥，改变以往实习“教师唱主角学生唱配角”的模式，实行“教师唱配角学 生唱主角”，以适应新世纪经济文化发展和人才竞争的需求，为使医学生的培养从知识 型向能力型转变进行了有益的探索。 2 实习课程设置及内容的改变 七年制课间实习全面贯彻以学生为主体，教师为辅导的“五步”教学方针，即走“学生-教 师-学生-教师-学生”路线。实习过程首先让学生自己尝试诊查、处理病人、操作使用 石膏夹板，对这些东西先有感性认识，教师讲解后再由学生自己总结分析错误所在， 之后教师再予总结评价，最后进行学生考核。使学生先实践再理论再实践，实践与所 学理论相结合去理解分析问题，从而加深印象，提高实习效果。实验组按照此方针总 结出“五步”教学方法：学生自行操作、处理-教师讲解-学生自行纠正错误-教师总结评 价-学生实习考核。注重实践，发挥潜能，创新思维。在实习中结合实例讲解骨科理学 检查、骨科石膏夹板牵引技术、骨科影像学检查基础等实用内容，使学生理解并能利 用这些骨科基本技能。对照组仍采用传统的教师单纯讲授典型病例和石膏夹板牵引技 术，然后即由学生操作的教学方法。 3 具体实施方法 本学期七年制学生共 72 人，平均分成 4 组，每组 18 人，2 组作为实验组，另两组作 为对照组。每组实习 18 学时。 3.1 典型病例实习 实验组首先选择急诊骨折病人统一问诊、查体(注意避免加重病人痛苦)，回到教室要 求每个学生均作为主治医生给出初步诊断、辅助检查方法、治疗处理意见。然后老师 和同学共同对每一处理方法进行总结分析，分析学生正确处理方法及错误所在，最后 得出明确诊断，正确治疗处理意见。教师尽可能先让学生自己进行分析总结，然后再 结合大课所学理论提示性给出结论。学生提问，学生解答，教师评价，师生互动，课 堂气氛活跃，学生印象深刻，教学效果良好。对照组则完全由老师进行示范讲解，学 生按照老师的要求操作实习。实习结束按照国家执业医师考试全真试题进行理论考核。 3.2 骨科检查法实习 实验组：(1)运用投影仪多媒体技术组织学生学习观看骨科检查法的正规操作；(2)学 生交叉进行骨科体格检查，教师在旁进行辅导，纠正检查中的错误；(3)教师选择典 型体征病人让学生实际查体操作。对照组：(1)教师示范骨科检查法的正规操作；(2) 学生交叉进行骨科体格检查，教师在旁进行辅导，纠正检查中的错误。 最后一天进行实际操作考核。 3.3 石膏、小夹板技术实习 实验组：(1)首先由学生按照自己掌握的知识尝试使用石膏和小夹板。(2)教师集中讲 解骨科石膏、小夹板技术的原理、适应证、禁忌证、正确的使用方法、注意事项。教 师进行示范石膏、小夹板的操作。(3)教师示范后学生自己总结纠正首次石膏、小夹 板操作中的错误，教师最后再给予评价和最终总结。学生再次交叉分别进行石膏、小 夹板的操作。对照组：(1)教师集中讲解骨科石膏夹板牵引技术的原理、适应证、禁 忌证、具体的方法、注意事项。(2)教师进行示范石膏、小夹板的操作。(3)学生交叉 分别进行石膏、小夹板的操作。 石膏管型、小夹板操作统一考核。 4 教改结果考核 4.1 床典型病例处理考核 国家执业医师考试骨科部分共 21 题，实验组 2 组共 36 人，对照组共 36 人分别进行 考核结果见表 1。表 1 临床典型病例处理考核（略） 对考核结果进行 χ2 检验分析可以看出，P＜0.05，实验组比对照组具有明显优势效 果，具有统计学意义。 4.2 石膏夹板考核 以教科书理论叙述为判定标准，对学生逐一考核石膏或夹板(任选其一)使用操作技术， 分为优、良、差三等。经 χ2 检验，P＜0.05，具有统计学意义，说明实验组比对照 组实习效果好。见表 2。表 2 石膏夹板考核（略） 5 教改效果分析 理论和实践是密不可分的，如何将所学理论运用于实践需要有一个过程，对于医学理 论来讲，临床实习即是理论到实践的重要环节，以往的实习，常常由教师带领学生复 习理论知识，查看典型病人，教师示范操作，而学生只有听讲的份。如此实习效果怎 样不得而知，文中对照组即是采用传统教学方法实习。结果就拿看 X 线片来说，老师 刚刚讲过同一种病，等提问学生自己阅片时仍然说不出所以然。实验组上来就先让学 生自己分析阅片、给出诊断和治疗方法，学生只能根据自己所学充分发挥。开始时学 生的确有些发蒙，有时不知所措，老师有针对性的根据同学的错误和难点再进一步给 出正确分析，老师讲完，再提问学生几乎都能答对，大大提高了实习效果。 实际操作中出现问题经老师讲解再操作就会记忆深刻，七年制学生是很聪明的，他们 也喜欢探索，教学过程充分调动学生的学习热情，课堂气氛活跃，师生之间关系融洽， 随时沟通，取得了意想不到的效果。统计学分析，实验组的教学效果比对照组具有明 显的优势，可见以学生为主体、教师为辅导的“五步”教学方针，即走“学生-教师-学生教师-学生”的路线，为使医学生的培养从知识型向能力型转变进行了有益的探索，对 七年制医学生课间实习是可行的，值得推广应用。 糖尿病(DM)是一组由多基因遗传因素和环境因素共同影响所致的慢性、非传染性终身 疾病。我国目前正处于 DM 的上升期，如果不加以有效遏止，估计 2015 年我国可能有 6000 万 DM 患者［1］。目前认为，胰岛素抵抗（IR）和胰岛 β 细胞功能缺陷是 2 型糖尿 病（T2DM）的主要发病机理［2］。IR 伴有高胰岛素（INS）血症，血糖在正常范围期间 是糖尿病防治的最佳时机，及早的行为干预和药物干预不仅减少 T2DM 的发病率，还能减 缓或纠正 IR 引起的代谢综合征，这一时期对 DM 的防治具有重大意义。T2DM、脂质代谢 紊乱、高血压、动脉粥样硬化（AS）、冠心病、内脏型肥胖被称为“代谢综合征”，其共同 的病因之一是 IR。现在认为，在糖尿病病程早期，尚无高血糖时，绝大多数患者已存在 IR 并伴有高 INS 血症，进一步发展，导致胰岛 β 细胞代偿机制逐渐衰退，血糖升高，最终发 生 T2DM。IR 伴高 INS 血症，是预测发生 T2DM 的有效单个预测指标［3］。二甲双胍 （MT）通过减肥、强化 INS 的作用、抑制肝糖产生和降低血脂而减轻 IR。 1 减肥作用