金属蛋白酶青光眼研究论文

【摘要】基质金属蛋白酶(MMP)MMP))是一类锌离子依赖性内源性蛋白水解酶家族，主要功 能是降解细胞外基质(MMP)ECM)和基底膜。近年来人们对 MMP) 的结构功能、活性的调节及在 原发性开角型青光眼发病机制和治疗中的作用有了初步的了解。本文就这方面的研究结果 作一综述。 【关键词】基质金属蛋白酶；原发性开角型青光眼；细胞外基质 原发性开角型青光眼(MMP)P)OAG))是常见致盲性眼病之一，迄今为止，其病因及发病机制 尚不清楚。小梁网组织的 ECM 与 MMP) 的动态平衡改变日益受到原发性开角型青光眼研究 领域学者的关注。本文就 MMP) 与 P)OAG) 关系的研究进展综述如下。 1MMP) 的结构及分类 MMP) 是一类锌离子依赖性内源性蛋白水解酶，主要功能是降解 ECM 和基底膜，除此 之外在许多生理和病理过程中发挥重要作用，例如基底膜的降解，ECM 的重构，结缔组织 的更新，血管的发生，再生，创伤的修复，肿瘤的发展和转移。 MMP) 家族在人类目前已发现了 20 几位成员，新成员还不断被发现。根据其底物的特 异性可将其分为五类［1］:(MMP)1)胶原酶，包括从纤维细胞、巨噬细胞、上皮细胞来源的胶原 酶 MMP)-1，从中性白细胞中得到的胶原酶 MMP)-8、MMP)-13 和 MMP)-18。主要水解底物 是胶原纤维，如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ型胶原和基底膜成分。型胶原和基底膜成分。(MMP)2)明胶酶，包括主要由结缔组织细 胞来源的 MMP)-2 和主要由中性白细胞和巨噬细胞分泌的 MMP)-9，即明胶酶 A、B，其主 要底物是明胶，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原和基底膜成分，型胶原和基底膜成分，MMP)-2 还可以分解纤维粘连蛋白 (MMP)FN))和层粘连蛋白(MMP)LN))；(MMP)3)基质降解酶类，包括 MMP)-3，-10，-11，其底物比较广泛， 主要降解Ⅲ、Ⅳ型胶原和基底膜成分，、Ⅸ型胶原型胶原 LN)、FN)、蛋白多糖及明胶等，并能激活某些 MMP)；(MMP)4)膜型 酶，包括 MMP)-4，-15，-16，-17，-24，-25，是新发现的一类，能降解几种 ECM 成分， 有些可激活其他 MMP)；(MMP)5)未分类 MMP)，包括 MMP)-6，-7，-12，-19，-26，-28 等， 较复杂，有些底物仍不详。 所有 MMP) 家族成员的 cDN)A 序列具有同源性，编码 4 个蛋白结构区。(MMP)1)信号肽结构， 与 MMP) 合成与分泌有关；(MMP)2)前肽结构，其中含一个高度保守的 P)RCG)VP)DV 氨基酸序列， 在大多数 MMP) 酶原活化中有重要作用；(MMP)3)催化结构，在所有 MMP) 的催化结构域中都含 有一段十分保守的氨基酸序列:HE-X-G)H-X-X-HS-X-M，其中的三个组氨酸被认为可以酶 活性中心部位 Zn2+结合而形成配位键(MMP)用 H 表示)，从而对酶的催化活性起主要作用； (MMP)4)C-末端区，约 200 个氨基酸残基组成，该区调节 MMP) 前肽与组织金属蛋白酶抑制剂 (MMP)tissueinhibitorsofmetalloproteinase，TIMP))结合，在底物选择特异性中起作用或与 特定细胞表面受体相互作用。 此外，此家族成员还均具有以下特征［2］：(MMP)1)是一种蛋白水解酶，可降解至少一种 ECM；(MMP)2)激活部位含有锌离子，由此控制与酶的接触反应；(MMP)3)以酶原形式分泌，之后由 纤溶酶和尿激酶的激活物裂解激活而发挥作用；(MMP)4)需要钙离子保持其稳定性，在中性活化 的 pH 环境中发挥重要作用；(MMP)5)MMP) 的激活受 TIMP) 或 α2-巨球蛋白的抑制。 2MMP) 活性的调节 MMP) 在正常组织中水平很低，当体内需要时，信号才传导至细胞，在细胞上转录调控， 合成分泌 MMP)，反之酶则停止活动，MMP) 活性消失。故 MMP) 在体内的调节十分严格和 精密，可分为基因水平调节、酶原活化调节、活化后调节。 2.1 转录水平的调节 大量研究表明［3］，多数生长因子，包括表皮生长因子(MMP)EG)F)、碱性成纤维细胞因子 (MMP)b-FG)F)、血小板源生长因子(MMP)P)DG)F)、肿瘤坏死因子(MMP)TN)F-α)、IL-1、IL-6 及激素、炎细 胞因子能刺激 MMP) 在转录水平的表达。在大多数 MMP)(MMP)MMP)-1、MMP)-3、MMP)-9 等)基 因的调节序列中，含有 TATA 盒，在此 TATA 盒前，存在多种转录调节因子结合位点，多 种原癌基因如 c-fos 和 c-jun 的表达产物，能与这些位点结合，刺激 MMP) 的转录，也就是 说，当某种刺激因子引起细胞增殖、ECM 产生增多的同时，也诱导了 MMP) 的表达，这可 能是正常组织保持 ECM 动态平衡的重要机制之一。与其他 MMP) 不同的是，MMP)-2 基因 的调节序列不含 TATA 盒，其表达也很少受原癌基因的影响，被认为是一种典型的管家基 因。MMP)mRN)A 的表达受许多因素的影响，如神经激素、细胞因子(MMP)CK))、化学因素等， 它们对 MMP) 基因的启动区产生诱导或抑制作用，从而启动或关闭 MMP)mRN)A 的表达。 2.2 酶原活化调节 多数 MMP) 是以酶原的形式分泌的，活化后才能在细胞外间隙选择性与 ECM 成分结合， 可由纤维蛋白溶酶依赖和非依赖性两条途径介导活化，纤维蛋白溶酶原能被其激活剂，如 尿激酶类纤溶酶原激活剂，转变为纤维蛋白溶酶，后者是大部分的 MMP) 的强大激活剂 ［4］。MMP) 间的相互激活也是其酶原活化的重要方式，如膜型 MT-1 可激活 MMP)2，MMP)-2 又可激活 MMP)-9［5］。MMP) 的活化机制尚未完全明了，目前多数学者认为 MMP) 酶原的前肽区包含一半胱氨酸(MMP)Cys)肽链内切酶开关序列，此序列与催化活性中心的 Zn2+结合成配位键，使酶的活性中心被覆盖，不能与底物接触，在某些条件下，活化剂 可直接打断 Cys-Zn2+间的配位键，或引起前肽区裂解掉，使酶活性中心暴露而活化。 2.3 基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP)）的调节的调节 TIMP) 是一组多基因家族的编码糖蛋 白，是 MMP) 的内源性特异性抑制因子，有资料证明，维持 ECM 正常代谢的关键在于 MMP) 与 TIMP) 之间的分泌平衡［6］。目前发现的 TIMP) 有四种:TIMP)-1、TIMP)-2、TIMP)3、TIMP)-4［7］。不同的 TIMP) 对 MMP) 的活性抑制具有特异性，而研究最多的是 TIMP)1 和 TIMP)-2。TIMP)-1 可由巨噬细胞和结缔组织细胞产生，广泛存在于组织和体液中，能 被多种细胞因子诱导产生，也能抑制大多数 MMP) 活性，它与活化的 MMP) 以 1:1 非共价结 合而抑制 MMP)，也可与 MMP) 酶原形式结合阻止其活化；TIMP)-2 随 MMP)-2 的表达而表 达，很少受细胞因子的诱导，TIMP)-2 主要通过与 MMP) 酶原结合抑制 MMP)-2，但也抑制 其他 MMP)；TIMP)-3 是一种结合 ECM 的非可溶性蛋白，仅存在于 ECM 中；TIMP)-4 具有 器官特异性。TIMP) 一方面结合酶原避免无活性的 MMP) 激活，另一方面可形成 MMP)TIMP) 复合物，阻断 MMP) 与底物结合，从而抑制 MMP) 活性。故 TIMP) 不仅与酶的催化位 点相结合，还阻止酶原活化。另据报道，还有一类 MMP) 的血浆抑制剂—α2-巨球蛋白(MMP)α2M)，也可抑制 MMP) 活性，其抑制作用是通过与酶的催化位点结合而实现的［8］。 3MMP) 与 P)OAG) 3.1 小梁网上 MMP) 和 P)OAG) 小梁网分为:葡萄膜小梁网、角巩膜小梁网和内皮小梁网，后者构成 Schlemm 管的内 侧壁，由薄层长形内皮细胞组成，3/4 的房水外流阻力在此形成。正常人眼小梁网细胞外 基质（ECM）的调节主要包括Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原和基底膜成分，、Ⅴ、Ⅵ型胶原蛋白，纤维连接蛋白和层粘连蛋白，透型胶原蛋白，纤维连接蛋白和层粘连蛋白，透 明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素和硫酸角质素等 5 种氨基多糖［9］。 正常情况下 ECM 处于不断产生和降解的动态平衡中，病理下 ECM 增多或(MMP)和)降解减少导 致 ECM 过多堆积影响组织功能。故 ECM 正常生理功能是保证房水外流通畅的重要因素。 P)OAG) 患者小梁网中细胞外基质异常堆积，如:弹力样纤维鞘源性物质、弹力蛋白、纤维连 接蛋白增多［10］。现已证实在人类的小梁网细胞上存在着 MMP) 与 TIMP)，并认为两者 作用的平衡性对正常人眼维持小梁 ECM 与房水外流通畅十分重要［11］。小梁细胞中有 大量的 MMP)-2 表达和少量的 TIMP)-1、TIMP)-2 表达，分别对 ECM 进行降解。MMP)/TIMP) 比例发生变化可引起病理改变［12］。也有研究发现原发性开角型青光眼中小梁网及房水 中 TIMP)-1 水平比正常和其他类型青光眼病人有显著增高，而 MMP) 活性却显著降低 ［13］。正常情况下 MMP) 的表达与其抑制剂的表达处于动态平衡中，此平衡调节对 ECM 正常功能具有重要意义。MMP) 过多表达可致组织损伤破坏，影响愈合功能；TIMP) 过多表 达则造成 ECM 堆积。现代研究表明，青光眼患者小梁细胞数目的减少及其细胞外基质含 量的改变使小梁网网眼狭窄或塌陷导致了原发性开角型青光眼［14］。有实验证明，激光 作用于小梁网后，MMP)-3、MMP)-9 及 TIMP)-1 表达增加［15］。故氢激光成形术可通过 增加 MMP) 的表达而使 ECM 降解增加从而提高房水外流量。 3.2P)OAG) 时房水中 MMP) 表达及调节 有学者在人类器官外植块灌注模型中，在灌注介质中加入等量的活化的 MMP)-3 和 MMP)-2，-9，房水流出通畅率增加 160%。相反，当灌注介质中加入 TIMP)-2，灌注量将 比处理前减少 40%［16］。在 P)OAG) 患者的房水中 MMP)-2、MMP)-3 和 TIMP)-2 的浓度 较正常升高，但 MMP)-2 的活性并无明显升高［17］。据此推断在 P)OAG) 发病机制中 MMP) 的活性起关键作用。这些研究表明房水中局部 MMP)-TIMP) 平衡的改变及 MMP) 活性 的降低可能增加小梁网异常的细胞外基质的堆积，增加房水流出阻力，这可能涉及 P)OAG) 的发病机制。 一些研究发现，在人类房水中存在着转化生长因子 β（TG)F-β）的调节、尿激酶型纤溶酶原 激活剂，MMP) 及其抑制剂 TIMP)［18］。TripathiRc［19］等人发现正常人房水中含 TG)F-β1 和 TG)F-β2，并且以后者为多，在 P)OAG) 患者的房水中的 TG)F-β2 含量明显高于 正常人，TG)F-β 能促进 MMP) 的分泌和合成，其异常表达与炎症过程有关。因此推断 TG)Fβ2 在 P)OAG) 的发病机制中发挥重要作用。而尿激酶型纤溶酶原激活剂是 MMP) 的内源性激 活剂，MMP) 均以酶原的形式分泌，它必须激活后才能降解胶原和其他基质蛋白。研究发现， 慢性前葡萄膜炎时，房水中的 MMP)-2、MMP)-3、MMP)-9 都有所提高，TIMP) 的表达也增 高，但两者无数量平行关系，MMP) 水平的变化不随 TIMP) 的表达而改变，这可能是慢性前 葡萄膜炎组织损伤导致继发性青光眼的潜在因素。 3.3P)OAG) 时 MMP) 对视神经的影响 研究证实，猴青光眼模型筛板中活性星型胶质细胞内 ECM 的 MMP)-1 大量增加是对眼 压升高的反应，不是由于视神经轴突丧失后继发的反应［20］，P)OAG) 时眼压升高引致 ECM 结构的修复和星型胶质细胞的活化，它最终将导致筛板层板的萎缩和塌陷以及轴突支 持作用的丧失，为青光眼视神经乳头的研究提供了一个新方向。 综上所述，MMP) 在原发性开角型青光眼发病机制中起着重要作用，对 MMP) 的活性、 调节和抑制的研究，将使对青光眼发病机理的探讨提高到分子水平，将为青光眼的治疗提 供新思路。 【摘要】目的用 ELISA 法对人源抗狂犬病毒抗体血浆进行筛查。方法采用国内几家狂 犬病毒 IgG) 抗体诊断试剂盒（ELISA 法）的调节，结合小鼠中和试验测定法，对经 0、3、7、14、28 日程序免疫的供浆员之血样进行抗狂犬病毒抗体效价检测。结果与小 鼠脑内中和法比较，使用不同厂家 ELISA 试剂盒，检测结果存在一定差异，其中 C、D 厂 家试剂盒检测结果比较接近，线性关系较好（分别为：r＝0.997；r＝0.996）的调节，可以替代 小鼠脑内中和法作为采浆站血浆初筛的方法。结论经过反复筛选与比较，为大规模筛查抗 狂犬病毒特免血浆提供了技术条件。 【关键词】抗狂犬病毒抗体；狂犬病疫苗；ELISA；检测；中和试验 Establishmentofmethodtoscreeninghumananti-rabiesviruspositiveplasma 【Abstract】ObjectiveThepositivehumanplasmacontainingantibodyagainst rabiesviruswasscreenedwithELISAkit.MethodsTheIgG)antibodydiagnostickits(MMP)EL ISAmethod)obtainingfromseveralmanufacturesinourcountrywereadoptedtoscr eentheantirabiesviruspositiveplasmacombiningwiththemiceneutralizationtest. Thelevelofantibodyagainstrabiesviruswasdeterminedinbloodsamplesofdonorst hatwereimmunizedwithrabiesvaccineondays0,3,7,14and28inschedule.ResultsI tshowedthattestresultsofELISAkitproducedinmanufactureCandDissimilar,theirli nearcorrelationisbetter(MMP)rc=0.997,ra=0.996respectively).ConclusionThemicene utralizationtestcanbereplacedbyELISAkitmethods. 【K)eywords】antibodyagainstrabiesvirus；rabiesvaccine；ELISA； neutralizationtest；screening 狂犬病是一种严重危害人类生命的人畜共患疾病，主要通过带狂犬病毒的动物传播给 人类，发病后致死率为 100％。据卫生部 2005 年 10 月公布的数字表明，病死率仍居我 国法定传染病的第 2 位，据调查，近年来狂犬病发病呈上升趋势，目前尚无治疗狂犬病的 有效药物。虽然狂犬病抗血清对预防狂犬病起着重要作用，但其来源因系异源性蛋白而副 反应较大，使用中易发生变态反应和血清病，其发生率为 15％～45％［1］，而且对某些 疫苗的抗体反应有抑制作用［2］，使用人源狂犬病免疫球蛋白（HRIG)）的调节则克服了上述缺 点，与异源抗体相比，具有在血液中维持时间较长、保护效果好的优点，这使得 HRIG) 的 需求量越来越大［3］，为此，我们于 2003 年末开始进行人源抗狂犬病抗体血浆的筛查 工作，目的是早日开发出安全有效的 HRIG) 制品。但由于方法学的限制，《中华人民共和 国药典 2005 年版三部（附录Ⅺ J）的调节》规定的小鼠效力中和试验（N)IH）的调节［4］方法难于做 大规模的检测。为寻找适合的方法，笔者曾建立了间接 ELISA 法测定狂犬病毒抗体的方法， 并进一步证实了该方法与小鼠中和法有良好的相关性，但现有 ELISA 法在实际应用中有灵 敏度不高、且存在漏检的问题。为解决上述问题，笔者结合小鼠中和法对国内 4 个 ELISA 厂家的狂犬病毒抗体 ELISA 诊断试剂盒进行筛选和比较，获得了较满意的结果。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 狂犬病毒抗原 狂犬病毒北京固定毒 AG) 株适应地鼠肾细胞传代培养的病毒悬液经灭活初步纯化后的 疫苗原液，由兰州生物制品研究所疫苗四室提供。 1.1.2ELISA 检测试剂 ELISA 定量检测人抗狂犬病抗体诊断试剂（批号分别为： 20040703、20050301、20050302、20050801）的调节分别由兰州生物制品研究所、宁波 天润生物药业有限公司、武汉生物制品研究所、珠海海泰生物制药有限公司提供）的调节，抗狂 犬病参考血清由中国药品生物制品检定所惠赠。 1.1.3 人用狂犬病疫苗和工作对照品 人用浓缩狂犬病疫苗（≥2.5IU/瓶）的调节，批号 20040401、20040403、20041101。 工作对照品（HRIG)）的调节批号 9008。以上制品均由兰州生物制品研究所生产。 1.1.4 实验样本 狂犬病毒抗体阳性血浆 20 份（SN)T 效价≥10IU/ml）的调节，阴性血浆 100 份，均由兰州 生物制品研究所血液制剂室提供。 1.2 方法 首先对供浆者进行 0、3、7、14、28 日程序狂犬疫苗注射，于最后一针 1 个月后采 集血样，用 ELISA 试剂盒检测其相对效价，将此血样与标准品进行系列稀释，分别与狂犬 病毒悬液结合，小鼠脑内注射，在规定的时间内，观察小鼠存活和死亡情况，测定出供试 品效价，之后再用小鼠中和法试验 SN)T 效价进行比较。将中和法测得 SN)T 效价结果 ≥10IU/ml 的样品，再用其他三家 ELISA［4］试剂盒进行检测。最终筛选出与小鼠中和 法试验结果相接近的试剂盒作为大规模筛查狂犬病抗体阳性血浆初筛试剂盒，设计出能满 足单采浆站特异性免疫血浆筛选的需要和可靠的收浆方案。 2 结果 2.1 初免后两种检测方法的比较 按 0、3、7、14、28 日程序免疫后 1 个月采集的血样用两种方法检测的结果比较， 见表 1。表 1 初免后两种检测方法的比较（略）的调节注：兰生所试剂（批号为 20040703）的调节 从表 1 可以看出，小鼠中和法与 A 厂家 ELISA 试剂盒检测结果存在很大差异，从而导 致了大量的特免血浆漏检。 2.2 不同厂家 ELISA 试剂盒检测结果比较 经小鼠中和法测得 SN)T 效价（≥10IU/ml）的调节样品与其他三个生产厂家试剂盒检测结果 比较，见表 2。表 2 不同厂家 ELISA 试剂盒检测结果比较(MMP)略)注：样品 1～7 号为同一供浆 者不同次血浆样，8～9 号为同一供浆者。不同次血浆样中，小鼠中的样品作过一次。海泰 批号为 200801 从表 2 可以看出，采用 B、C、D 厂家 ELISA 试剂盒经中和法测得 SN)A≥10IU/ml 的 9 份血样进行检测，结果显示，B、D 厂家 ELISA 试剂盒检测结果与中和法 SN)T 值接近。 2.3 不同 ELISA 试剂盒标准曲线对比 以 9008 批 HRIG) 为工作参考品，用不同 ELISA 试剂盒测得的线性关系比较，见表 3。表 3 不同 ELISA 试剂盒标准曲线对比（略）的调节注：工作参考品为 98008HRIG) 冻干品经 小鼠中和法测得效价为 60IU/ml