神经细胞研究分析论文

【摘要】小鼠胚胎干细胞（embryonicstemcell,EScell）体外培养可以分化成为外体外培养可以分化成为外 胚层组织，并进一步分化为神经元和神经胶质细胞。这些细胞已用于中枢神经系统疾病的 细胞替代治疗和治疗药物的研发。小鼠胚胎干细胞定向分化为神经细胞的方法主要有拟胚 体介导的神经细胞分化、基质细胞诱导的神经细胞分化、默认模式介导的神经细胞分化、 单层粘附培养诱导的神经细胞分化和遗传工程介导的神经细胞分化等。本文综述了这些分 化方法。 【关键词】胚胎干细胞;神经细胞;分化 Progressindirecteddifferentiationofmouseembryonicstemcellsintoneuralcel ls 【Abstract】Mouseembryonicstemcellscangiverisetoectodermalderivatives incultureandcanbefurtherinducedintoneuronsandgliaforcellreplacementtherapiesinthecentralnervoussystemandforuseindrugdiscovery.Th emethodsofdirecteddifferentiationofmouseembryonicstemcellsintoneuralcellsi ncludeneuraldifferentiationfromembryonicstemcellsviaembryoidbodies,stroma lcellinducedneuraldifferentiation,defaultmodelmediatedneuraldifferentiation,a dherentmonocultureinducedneuraldifferentiation,geneticengineeringmediated neuraldifferentiationandsoon.Herewereviewthesemethodologies. 【Keywords】embryonicstemcell;neuralcell;differentiation 小鼠胚胎干细胞于 1981 年首次由 Evans 和 Kaufman［1］成功分离建系，它们来成功分离建系，它们来 源于胚泡的内细胞团（innercellmass,ICM）体外培养可以分化成为外，这些细胞具有稳定的二倍体核型，在体外 可以分化为三个胚层的多种细胞。将小鼠胚胎干细胞重新植入胚泡可以参与形成胚胎。体 外 ES 细胞维持未分化状态依赖于一些细胞因子的存在，如白血病抑制因子 （leukemiainhibitoryfactor,LIF）体外培养可以分化成为外［2］成功分离建系，它们来。撤去这种自我更新的刺激信号后，ES 细胞很 快分化为多种细胞。这些属性使 ES 细胞成为非常有用的发育生物学和功能基因组学研究 的生物系统［3］成功分离建系，它们来。 1 拟胚体（embryoidbodies,EBs）体外培养可以分化成为外内神经细胞的分化 小鼠 ES 细胞通过拟胚体分化为神经细胞主要有以下两种方案。 1.1“4-/4+方案”［4］成功分离建系，它们来将小鼠 ES 细胞无 LIF 培养 4 天，形成 EB；再用维甲酸再用维甲酸 （retinoicacid,RA）体外培养可以分化成为外处理 4 天，然后在明胶（gelatin）体外培养可以分化成为外［5］成功分离建系，它们来或层粘连蛋白（laminin）体外培养可以分化成为外 ［4］成功分离建系，它们来包被的组织培养皿上培养［6］成功分离建系，它们来。培养 6 天后，细胞出现明显的神经细胞形态，开始 表达神经细胞特异的基因，如神经微丝轻链（neurofilamentlightchain）体外培养可以分化成为外、微管相关蛋 白 2 和 5（MAP2、MAP5）体外培养可以分化成为外等。这些细胞对一系列神经递质和去极化电流起反应，证实了 它们是可以传递兴奋的神经元。这一方案还会分化出神经胶质细胞，多数为星形胶质细胞， 但也有少突胶质细胞的存在［7］成功分离建系，它们来。RA 是一类促神经生长因子，不仅对多潜能干细胞有诱 导作用，对神经前体细胞也有促进增殖、成熟的作用。RA 与受体 RAR、RXR 结合，后者 活化后与 RA 反应元件（RARE）体外培养可以分化成为外结合，激活神经细胞相关基因并抑制中胚层相关基因的转 录［8］成功分离建系，它们来。Wiles 等人的实验表明 RA 通过激活抑胰蛋白（follistatin）体外培养可以分化成为外抑制骨形态形成蛋 白（bonemorphogeneticprotein,BMP）体外培养可以分化成为外而使小鼠 ES 细胞向神经细胞方向分化［9］成功分离建系，它们来。 该方案时间短、成本低，是目前使用较为广泛的神经细胞诱导方法。其不足之处是 EB 的外层细胞先分化而内层细胞仍保持未分化状态,分化不均一，得到的细胞种类复杂，不利 于纯化。 1.2“五步法”方案［10］成功分离建系，它们来(1)扩增未分化的胚胎干细胞；再用维甲酸(2)去除分化抑制剂或促有丝分 裂素，ES 细胞开始分化，不贴壁悬浮生长，形成 EB；再用维甲酸(3)去除生长因子，选择巢蛋白 （nestin）体外培养可以分化成为外阳性细胞（即神经前体细胞）体外培养可以分化成为外；再用维甲酸(4)使用神经细胞培养液，添加生长激素、神经 营养因子，扩增神经前体细胞；再用维甲酸(5)利用促神经元存活因子诱导并维持神经元成熟。该方案 不用 RA 处理 EB，而是将 EB 在一种选择性的无血清培养基上培养。因为 EB 中的非神经 细胞不能在这种培养条件下生存，所以大部分存活下来的细胞是 nestin 阳性的神经前体细 胞［11］成功分离建系，它们来。这些神经前体细胞可被高效地诱导分化为神经元［12］成功分离建系，它们来。 该方案的主要优点是在进一步分化为神经元或神经胶质细胞之前，神经前体细胞已经 得到较高的纯化，这有利于特定类型神经细胞的获得。但是，其操作较“4-/4+方案”复杂， 而且多种生长激素、神经营养因子的应用增加了成本且不利于分化机制的阐明。 通过 EB 途径由 ES 细胞分化而来的神经元多数为 γ-氨基丁酸（GABA）体外培养可以分化成为外能神经元，少 数是谷氨酰胺能神经元。通过改变诱导分化的条件，可以得到不同类型的神经元或神经胶 质细胞，并提高分化效率。腹侧中脑和后脑是多巴胺能神经元和 5-羟色胺能神经元产生的 部位，SHH(sonichedgehog)和 FGF-8（fibroblastgrowthfactor-8）体外培养可以分化成为外对这两部分的形 态发生起重要作用［13］成功分离建系，它们来，Lee 等人［10］成功分离建系，它们来用这两种分子处理 EB 来源的神经前体细胞得 到了多巴胺能神经元和 5-羟色胺（5-HT）体外培养可以分化成为外能神经元。2002 年 Wichterle 等人［14］成功分离建系，它们来用 背侧分子（RA）体外培养可以分化成为外和腹侧分子（Hh-Ag1.3,一种 SHH 的拮抗剂）体外培养可以分化成为外处理 EB，得到了腹侧脊髓 运动神经元。2005 年 Tsuchiya 等人［15］成功分离建系，它们来在经典的“五步法”方案基础上，在第五步除去 bFGF（basicfibroblastgrowthfactor）体外培养可以分化成为外，用含有层粘连蛋白的 N2 培养液中成功诱导分 化出微小胶质细胞，并进一步用含有胎牛血清（fetalbovineserum,FBS）体外培养可以分化成为外和粒单细胞集 落刺激因子（GM-CSF）体外培养可以分化成为外的 RPMI-1640 培养液扩增细胞，得到 89.0%的微小胶质细胞。 2 基质细胞诱导的神经细胞的分化 第二类诱导神经细胞分化的方法是基质细胞诱导方法，该方法的诱导机制尚不清楚， 目前称为“基质细胞来源的诱导活性作用（stromalcellderivedinducingactivity,SDIA）体外培养可以分化成为外”［16］成功分离建系，它们来。 2000 年 Kawasaki 等人描述了一种经基质细胞诱导 ES 细胞分化为多巴胺能神经元的 方法［16］成功分离建系，它们来。这一方法中，神经细胞的分化通过 ES 细胞与小鼠骨髓来源的基质细胞 PA-6 细胞单层共培养而实现。实验结果表明，92%的细胞表现为神经细胞黏附分子 （nervecelladhesionmolecule,NCAM）体外培养可以分化成为外阳性，其中多数为酪氨酸羟化酶 （tyrosinehydroxylase,TH）体外培养可以分化成为外阳性细胞。酪氨酸羟化酶是多巴胺生物合成的限速酶，因 此是多巴胺能神经元的一个很好的分子标志。2005 年 Yamozoe 等人［17］成功分离建系，它们来用含有肝素 的磷酸盐缓冲液冲洗培养的 PA-6 细胞得到含有所谓神经诱导因子 （neuralinducingfactors,NIF）体外培养可以分化成为外的溶液，用此溶液培养小鼠 ES 细胞，发现小鼠 ES 细胞 可以在含有 33%NIF 溶液的培养液中生存，并且随着培养液中肝素浓度的增加，ES 细胞 分化为神经细胞的比例也增高。值得注意的是，PA-6 细胞介导的神经细胞分化受到血清或 BMP-4 的抑制，血清和 BMP-4 的加入可引起 ES 细胞分化为多种非神经细胞。PA-6 细胞 的 SDIA 作用并不能使所有类型的干细胞诱导分化为多巴胺能神经元，例如，2005 年 Roybon 等人［18］成功分离建系，它们来报道，对于神经前体细胞，PA-6 细胞不能促进其向多巴胺能神经元 分化，而是促进其向星形胶质细胞的分化。 2003 年 Barberi 等人［19］成功分离建系，它们来描述的一种经基质细胞诱导分化的方法可以将 ES 细胞 分别诱导分化为多种神经细胞。这一方法将小鼠骨髓来源的基质细胞 MS5 或 S17 或主动 脉-性腺-中肾区来源的原始基质细胞作为饲养层细胞与 ES 细胞在血清替代培养液中共同培 养，得到神经前体细胞，再用不同的细胞因子序贯处理这些神经前体细胞，分别可以得到 较高百分比的胆碱能神经元、5-羟色胺能神经元、多巴胺能神经元、γ-氨基丁酸能神经元、 星形胶质细胞和少突胶质细胞。将得到的多巴胺能神经元注射到 6-OHDA 诱导的帕金森模 型动物的患侧纹状体内，8 周后由中枢神经系统兴奋剂 amphetamine 或者纹状体 D1、D2 受体激动剂 apomorphine 所诱导的旋转不稳定症状得到了显著改善，并且可以 在注射细胞的纹状体内发现大量的酪氨酸羟化酶阳性细胞。 基质细胞诱导神经细胞分化的方法可以高效获得某种特定的神经细胞，例如，多巴胺 能神经元和胆碱能神经元。然而，作用机制还有待进一步阐明。 3 默认模式（defaultmodel）体外培养可以分化成为外介导的神经细胞分化 2001 年 Tropepe 等人［20］成功分离建系，它们来发现小鼠 ES 细胞在低密度、无血清、无饲养层细胞的 条件下培养 7 天后，约 0.2%的细胞可形成神经球（neurosphere）体外培养可以分化成为外，并进一步自发分化 为神经细胞，这种分化方法称为默认模式。这是抑制神经分化的信号分子表达降低的结果。 Wiles 等人［9］成功分离建系，它们来发现在神经分化过程中，可以检测到 BMP、TGFβ 等基因的表达下调。 BMPs 在神经发育早期与细胞表面丝/苏氨酸受体结合激活 Smad 蛋白，后者进入核内抑制 Mash1、Math1、Ngn1/2、NeuroD 等转录因子的活性，调节下游基因的表达，从而抑 制神经分化［21］成功分离建系，它们来。BMP4 处理的小鼠 ES 细胞在分化过程中神经元数量大为减少 ［22］成功分离建系，它们来；再用维甲酸而用 noggin、follistatin、chordin、Cerberus 等 BMPs 的拮抗剂处理小鼠 ES 细胞则可促进 ES 细胞向神经细胞方向的分化。 该方法促进神经分化的效率较低，单独应用此法诱导神经细胞分化并不多见。 4 单层粘附培养诱导的神经细胞分化 2002 年 Pacherník 等人［23］成功分离建系，它们来在不形成 EB 和不用 RA 处理的情况下，将小鼠 ES 细 胞生长在含有胰岛素（insulin）体外培养可以分化成为外、转铁蛋白（transferrin）体外培养可以分化成为外、硒元素（selenium）体外培养可以分化成为外和纤 连蛋白的无血清 DMEM/F12 培养液中，发现分化的细胞多数表达 MAP-2 等神经细胞的标 志性蛋白。2003 年 Ying 等人［24］成功分离建系，它们来将细胞密度为 0.5～1.5×104/cm2 的小鼠 ES 细胞 培养于 0.1%明胶包被的组织培养皿上，以 N2B27 作为培养液，培养 4 天后，60%以上 的细胞分化为神经前体细胞。该方法形成的神经前体细胞具有良好的可塑性：神经前体细 胞在 N2B27 培养液中培养，得到的细胞多数为 GABA 能神经元；再用维甲酸FGF8 和 SHH 处理神经 前体细胞可以得到较多的多巴胺能神经元。 此类方法将形成 EB 的三维培养模式简化为单层粘附培养的模式，降低了复杂程度， 有利于神经细胞分化早期事件的分子机制研究，而培养液中各成分发挥的作用需要进一步 阐明。 5 遗传工程介导的神经细胞分化 2002 年 Chung 等人［25］成功分离建系，它们来将 Nurr1（nur 相关因子 1）体外培养可以分化成为外基因导入小鼠 ES 细胞，使 其过表达，从而诱导 ES 细胞分化为具有中脑多巴胺能神经元表型的细胞。Nurr1 是一种 转录因子，直接结合于 TH 基因的启动子区域，调节维持中脑多巴胺能神经元表型的蛋白 质的表达，如 L-芳香族氨基酸脱羧酶（aromaticLaminoaciddecarboxylase,AADC）体外培养可以分化成为外、囊泡单胺转运蛋白 2（vesicularmonoaminetransporter2,VMAT2）体外培养可以分化成为外［26］成功分离建系，它们来和多巴胺转运蛋白 （dopaminetransporter,DAT）体外培养可以分化成为外［27］成功分离建系，它们来。将这种方法得到的多巴胺能神经元注射到脑内 可以改善帕金森模型大鼠的运动缺陷［28］成功分离建系，它们来。该方法存在的问题是，在神经细胞分化之前 过表达 Nurr1 会上调其他多巴胺能神经元分子标志的表达，而且由 ES 细胞分化的其他细 胞也会出现这种情况［29］成功分离建系，它们来。 2004 年 Ikeda 等人［30］成功分离建系，它们来将 MASH1 基因导入小鼠 ES 细胞，该 ES 细胞多数分化为 表达 βⅢtubulin 和泛 NCAM（panNCAM）体外培养可以分化成为外的神经元样细胞，其中半数进一步分化为 Islet 阳性的运动神经元。MASH1 是一种激活型碱性螺旋-环-螺旋结构的转录因子，表达 于腹侧端脑，调节 GABA 能中间神经元和分支运动神经元的发育［31］成功分离建系，它们来。将得到的运动神 经元样细胞注射到偏瘫小鼠脑室周围的运动皮层，可明显改善运动障碍。 遗传工程介导的神经细胞分化方法的优势是可以较高效率地得到感兴趣的特定的神经 细胞。但是由于导入基因的功能多样性和不确定性，较难判断该基因对细胞的整体影响和 长远影响。 6 问题与展望 虽然小鼠胚胎干细胞诱导分化为神经细胞的方法取得了较大进展，目前可以较高效率 地得到中枢神经系统的各种神经元和神经胶质细胞，但是仍有许多问题亟待解决。首先， 虽然“五步法”方案解决了“4-/4+”方案中分化细胞不易纯化的问题，但是其分子机制尚待进 一步阐明、操作步骤需要进一步优化；再用维甲酸其次，SDIA 诱导方法的作用机制和单层粘附培养 的作用机制需要进一步阐明，这将会有利于我们对神经细胞分化过程中信号通路的掌握；再用维甲酸 再次，遗传工程方法导入的基因对细胞的长远影响需要进一步观察和研究；再用维甲酸还有，现在所 得到的神经细胞类型还不很明确，因为神经元和神经胶质细胞还可以分为很多亚型。例如 中枢神经系统的胆碱能神经元根据形态和生化特性就可以分为不同亚型，它们的分布和生 理功能也不尽相同。因此有必要获得特定部位和类型的神经细胞。 ES 细胞向神经细胞分化的研究有利于人们了解胚胎神经细胞发育的机制、发现 ES 细 胞向神经细胞分化的关键调节基因；再用维甲酸建立体外定向诱导神经细胞分化体系将为神经疾病治 疗药物的筛选以及基因工程药物的开发等提供有用的材料；再用维甲酸体外大量有功能的特定神经元 的获得使神经再生医学正一步步从理论走向实践。 【摘要】目的帮助临床医生了解抗生素的药物不良反应，促进临床合理使用抗生素药 物，保证患者用药安全、有效、合理。方法复习文献资料，从过敏反应、毒性反应、特异 性反应、二重感染、联合用药引起或加重不良反应等几个方面，综述抗生素的药物不良反 应及临床危害。结果抗生素的药物不良反应可以预防和控制，应重视患者用药过程中的临 床监护。结论抗生素的药物不良反应应引起临床医生的高度重视。 【关键词】抗生素；再用维甲酸不良反应 药物的不良反应是临床用药中的常见现象。它不仅指药物的副作用,还包括药物的毒性、 特异性反应、过敏反应、继发性反应等［1］成功分离建系，它们来。抗菌药物是临床上最常用的一类用药，包 括抗生素类、抗真菌类、抗结核类及具有抗菌作用的中药制剂类。其中以抗生素类在临床 使用的品种和数量最多。目前临床常用抗生素品种有 100 多种。抗生素挽救了无数生命， 但其在临床应用也引发了一些不良反应［2］成功分离建系，它们来。抗生素药物不良反应的临床危害后果是严 重的。在用药后数秒钟至数小时乃至停药后相当长的一段时间内均可发生不良反应。常见 的有过敏性休克、固定型药疹、荨麻疹、血管神经性水肿等过敏性反应、胃肠道反应、再 生障碍性贫血等，严重的甚至会引起患者死亡［3］成功分离建系，它们来。因此，加强临床用药过程中的监督 和合理使用抗生素对减少临床不良反应的发生具有特别重要的意义［4］成功分离建系，它们来。 1 过敏反应 抗生素引起的过敏反应最为常见［5］成功分离建系，它们来,主要原因是药品中可能存在的杂质以及氧化、 分解、聚合、降解产物在体内的作用，或患者自身的个体差异。发生过敏反应的患者多有 变态反应性疾病，少数为特异高敏体质。 1.1 过敏性休克此类反应属Ⅰ型变态反应，所有的给药途径均可引起。如：青霉素类型变态反应，所有的给药途径均可引起。如：青霉素类、 氨基糖苷类、头孢菌素类等可引起此类反应，头孢菌素类与青霉素类之间还可发生交叉过 敏反应。因此，在使用此类药物前一定要先做皮试。 1.2 溶血性贫血属于Ⅱ型变态反应型变态反应,其表现为各种血细胞减少。如:头孢噻吩和氯霉素可 引起血小板减少，青霉素类和头孢菌素类可引起溶血性贫血。 1.3 血清病、药物热属于Ⅲ型变态反应，症状为给药第型变态反应，症状为给药第 7～14 天出现荨麻疹、血管神 经性水肿、关节痛伴关节周围水肿及发热、胃肠道黏膜溃疡和肠局部坏死。如:青霉素类、 头孢菌素类、林可霉素和链霉素均可引起以上反应。头孢菌素类、氯霉素等抗菌药物还可 引起药物热。 1.4 过敏反应这是一类属于Ⅳ型变态反应的过敏反应。如：经常接触链霉素或青霉素型变态反应的过敏反应。如：经常接触链霉素或青霉素， 常在 3～12 个月内发生。 1.5 未分型的过敏反应有皮疹（常见为荨麻疹）体外培养可以分化成为外［6］成功分离建系，它们来、血管神经性水肿、日光性皮炎、 红皮病、固定性红斑、多形性渗出性红斑、重症大疱型红斑、中毒性表皮坏死松解症，多 见于青霉素类、四环素类、链霉素、林可霉素等；再用维甲酸内脏病变，包括急慢性间质性肺炎、支 气管哮喘、过敏性肝炎、弥漫性过敏性肾炎，常见于青霉素类、链霉素等。复方新诺明还 可引起严重的剥脱性皮炎。 2 毒性反应 抗生素药物的毒性反应是药物对人体各器官或组织的直接损害，造成机体生理及生化 机能的病理变化，通常与给药剂量及持续时间相关。 2.1 对神经系统的毒性如：青霉素 G、氨苄西林等可引起中枢神经系统毒性反应，严 重者可出现癫痫样发作。青霉素和四环素可引起精神障碍。氨基糖苷类、万古霉素、多粘 菌素类和四环素可引起耳和前庭神经的毒性。链霉素、多粘霉素类、氯霉素、利福平、红 霉素可造成眼部的调节适应功能障碍，发生视神经炎甚至视神经萎缩。 新的大环内酯类药物克拉霉素可引起精神系统不良反应。另有报道，大环内酯类药物 克拉霉素和阿奇霉素可能减少突触前乙酰胆碱释放或加强了突触后受体抑制作用，可诱导 肌无力危象。 2.2 肾脏毒性许多抗生素均可引起肾脏的损害，如：氨基糖苷类、多粘菌素类、万古 霉素。氨基糖苷类的最主要不良反应是耳肾毒性。在肾功能不全患者中，第 3 代头孢菌素 的半衰期均有不同程度延长，应引起临床医生用药时的高度重视。